基于微流控芯片的癌細(xì)胞遷移及抗癌藥物篩選共培養(yǎng)模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及微流控忍片技術(shù)和癌癥研究等領(lǐng)域，具體地，是一種基于微流控忍片 研究不同程度癌癥癌細(xì)胞遷移及抗癌藥物篩選的共培養(yǎng)模型。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是目前嚴(yán)重困擾人類健康的世界性難題，據(jù)國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)公布的數(shù) 據(jù)顯示每年全球約800萬人死于惡性腫瘤，其中90%惡性腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，研究顯示 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程為能更好地闡明腫瘤細(xì)胞遷移的機(jī)制和篩選出抑制腫瘤細(xì)胞遷移的 藥物，建立一種靈活、可靠、低成本的細(xì)胞遷移模型具有重要意義。
[0003] 細(xì)胞遷移模型分為體內(nèi)和體外模型，體外細(xì)胞遷移模型相比體內(nèi)模型成本低、操 作簡(jiǎn)單，可避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所設(shè)及到的倫理問題，同時(shí)也可避免人類與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬特異性 差異造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的現(xiàn)象。
[0004] 微流控忍片具有結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活和規(guī)模集成的優(yōu)勢(shì)，具有高通量、低消耗和操作自 動(dòng)化的特點(diǎn)，是細(xì)胞操控和分析的有利技術(shù)平臺(tái)。用于生物細(xì)胞培養(yǎng)的微流控裝置多用娃、 聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃等制作。其中聚二甲基硅氧烷不僅具有生物兼容性、毒性低、 較高的化學(xué)和熱穩(wěn)定性、透光性、對(duì)水的滲透性低W及電導(dǎo)性低等特點(diǎn)。
[000引此外，近年來國(guó)內(nèi)外在腫瘤轉(zhuǎn)移研究方面進(jìn)展較快，尤其是闡明了腫瘤轉(zhuǎn)移的某 些關(guān)鍵環(huán)節(jié)和相關(guān)機(jī)理，但至今尚無廣泛用于臨床預(yù)防治療腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控忍片的癌細(xì)胞遷移及抗癌藥物篩選的共培 養(yǎng)模型，本模型為研究癌細(xì)胞遷移的體外共培養(yǎng)模型，通過控制癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的比例， 從而建立輕度、中度和重度的癌癥模型，研究癌癥的不同時(shí)期癌細(xì)胞的遷移狀況。本模型也 可用于抗癌藥物的篩選，尤其是抗癌細(xì)胞遷移的藥物篩選，從而更好的擬制癌細(xì)胞的擴(kuò)散。
[0007] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 一種基于微流控忍片研究不同程度癌癥癌細(xì)胞遷移及抗癌藥物篩選的共培養(yǎng)模型，該 共培養(yǎng)模型由四層忍片疊加而成，所述四層忍片自下而上依次是玻璃片支撐層（1)、PDMS接 種細(xì)胞層(2XPDMS供液層(3)W及PDMS氣動(dòng)閥口控制層(4)，通過基于等離子清洗技術(shù)的鍵 合工藝組裝成一體;其中，所述PDMS接種細(xì)胞層(2)上設(shè)有Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室，用于研究 癌細(xì)胞和正常細(xì)胞不同比例下癌細(xì)胞遷移或抗癌藥物篩選。
[0008] 優(yōu)選實(shí)施例中，所述Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室的每個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室包括兩個(gè)接細(xì)胞 腔室，一個(gè)腔室接入癌細(xì)胞，另一個(gè)腔室接入正常細(xì)胞，該兩個(gè)接細(xì)胞腔室中間設(shè)置微流道 陣列（11)，由集成于所述PDMS供液層(3)和PDMS氣動(dòng)閥口控制層(4)上的一個(gè)氣動(dòng)控制閥口 (18)控制該微流道陣列（11)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)接細(xì)胞腔室的連通和閉合;控制所述Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng) 腔室中癌細(xì)胞和正常細(xì)胞比例分別模擬輕度癌癥、中度癌癥和重度癌癥，研究癌細(xì)胞的遷 移。
[0009] 所述Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室中，一個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室的兩個(gè)接細(xì)胞腔室為腔室（5) 和腔室(8)，另一個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室的兩個(gè)接細(xì)胞腔室為腔室(6)和腔室(9)，第Ξ個(gè)細(xì)胞共 培養(yǎng)腔室的兩個(gè)接細(xì)胞腔室為腔室（7)和腔室（10)，腔室（5)、（6)、（9)及（10)的面積相等， 腔室（8)與腔室（7)的面積相等并且是腔室（5)面積的兩倍;腔室（5)、（6)、（7)分別接低濃 度、中等濃度及高濃度癌細(xì)胞，腔室(8)、（9)、（10)分別接入高濃度、中等濃度及低濃度的正 常細(xì)胞，腔室巧)和腔室(8)作為輕度癌癥模型，腔室(6)和腔室(9)作為中度癌癥模型，腔室 (7)和腔室（10)作為重度癌癥模型。
[0010] 其中，所述微流道陣列（11)具有30-50個(gè)微通道，相鄰微通道間隔40μπι，每一個(gè)微 通道的尺寸是40μπιχ25μπιΧ:400μπι(寬X高X長(zhǎng)）。所述立個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室采用相同規(guī)格的微 流道陣列，便于在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下評(píng)價(jià)Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室癌細(xì)胞的遷移能力。
[0011] 所述PDMS供液層（3)和PDMS氣動(dòng)閥口控制層(4)上集成了與所述Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng) 腔室對(duì)應(yīng)的Ξ個(gè)氣動(dòng)控制閥口（ 18)。所述氣動(dòng)控制閥口（ 18)包括位于所述PDMS氣動(dòng)閥口控 制層(4)中的一充氣腔室（20)，與該充氣腔室20連通的入氣口（ 19) ; W及，設(shè)置于所述PDMS 供液層(3)的對(duì)應(yīng)流道上的條狀突起（16)，借助有無氣體壓力使該條狀突起（16)下壓接觸 或脫離所述微流道陣列（11)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室的兩個(gè)接細(xì)胞腔室的閉合和連通。所述條 狀突起（16)的高度為130μπι。所述充氣腔室（20)大小是4細(xì)訊!，2級(jí)從χΟ L;掛m (長(zhǎng)X寬X 局）。
[0012] 所述PDMS供液層(3)的設(shè)計(jì)基于Ξ個(gè)目標(biāo)而進(jìn)行:首先要確保接入細(xì)胞的均勻性， 使細(xì)胞能夠均勻分布在細(xì)胞培養(yǎng)腔室;其次是為了保證供給培養(yǎng)液的均勻性，同時(shí)降低培 養(yǎng)液流速對(duì)細(xì)胞的影響；最后要保證營(yíng)養(yǎng)液的供給充分。在所述PDMS供液層(3)下表面（即 與PDMS接種細(xì)胞層(2)相鄰的一面)上設(shè)置與所述Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室分別對(duì)應(yīng)的流道，用 于接入細(xì)胞和供給培養(yǎng)液;在每個(gè)流道與其進(jìn)夜口（ 14)、出液口（ 15)之間分別設(shè)有若干柱 狀突起(17)，W保證供給培養(yǎng)液的均勻性，同時(shí)降低培養(yǎng)液流速對(duì)細(xì)胞的影響。
[001引所述PDMS供液層(3 )的厚度可W為0.2 5-0.3mm，設(shè)置于PDMS供液層(3 )上的供液流 道的深度是150μπι。所述PDMS供液層(3)上的流道適應(yīng)于靜態(tài)或動(dòng)態(tài)地供給細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0014] 當(dāng)采用動(dòng)態(tài)的供給培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，本共培養(yǎng)模型可W研究不同的培養(yǎng)液供給速度 下，癌細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)而模擬人體不同部位的癌細(xì)胞的遷移情況。
[0015] 本共培養(yǎng)模型可用于模擬癌細(xì)胞和正常細(xì)胞不同比例下癌細(xì)胞的遷移情況，W此 來用于不同程度的癌癥的研究。也可W在此模型下進(jìn)行抗癌藥物的篩選，從而針對(duì)不同程 度的癌癥選用不同劑量的藥物，減少對(duì)正常細(xì)胞的殺傷，更好的治療癌癥;本模型可W進(jìn)行 抗癌細(xì)胞遷移的藥物研究。
[0016] 本共培養(yǎng)模型可直接放到二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，從而保證穩(wěn)定無菌的細(xì)胞 生長(zhǎng)環(huán)境。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明在四層忍片的設(shè)計(jì)上綜合考慮了目前微流控片的加工工藝，具有多個(gè)細(xì)胞共培 養(yǎng)腔室、用于細(xì)胞遷移評(píng)價(jià)的微流道陣列W及集成于忍片的多個(gè)氣動(dòng)控制閥口，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 精巧，制作工藝簡(jiǎn)單，可W實(shí)現(xiàn)批量化制作。
[0018] 在忍片的操作上，本模型控制簡(jiǎn)單易行，接種細(xì)胞和供給培養(yǎng)液方便，細(xì)胞生長(zhǎng)和 遷移情況在顯微鏡下觀察方便，忍片可直接放到二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，從而保證穩(wěn) 定無菌的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。
[0019] 在忍片的功能上，本忍片是正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的共培養(yǎng)裝置，更加仿生地模擬了 癌細(xì)胞再人體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。同時(shí)集多種功能于一體，可W用于癌細(xì)胞遷移能力的研究和 抗癌藥物的篩選，尤其是可W用于抗癌細(xì)胞遷移的藥物研究；可W實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)或靜態(tài)的共培 養(yǎng)等。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明用于研究癌細(xì)胞遷移的體外共培養(yǎng)模型的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為圖1中PDMS接種細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)示意及局部圖； 圖3為圖1中PDMS供液層下面向上翻轉(zhuǎn)后的結(jié)構(gòu)示意及局部圖； 圖4為本發(fā)明用于研究癌細(xì)胞遷移的體外共培養(yǎng)忍片組裝后的剖面圖和一氣動(dòng)控制閥 口的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說明。
[0022] 如圖1所示，本發(fā)明共培養(yǎng)模型為四層忍片結(jié)構(gòu)，自下而上依次是玻璃片支撐層 (1)、PDMS接種細(xì)胞層(2)、PDMS供液層(3似及PDMS氣動(dòng)閥口控制層(4) dPDMS接種細(xì)胞層上 設(shè)Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室，在PDMS供液層與PDMS接種細(xì)胞層相鄰的一面上配置與所述Ξ個(gè)細(xì) 胞共培養(yǎng)腔室對(duì)應(yīng)的流道，PDMS供液層和PDMS氣動(dòng)閥口控制層上集成了相應(yīng)的Ξ個(gè)氣動(dòng)控 制閥 11 (18 )。
[0023] 忍片的加工組裝通過W下步驟來實(shí)現(xiàn)： 首先，玻璃片支撐層（1)選用常用的光學(xué)玻璃，尺寸是y化&:<(長(zhǎng)>：寬>： 高），在忍片組裝前，必須對(duì)玻璃片進(jìn)行充分的清洗，然后烘干使用。
[0024] 其次，PDMS接種細(xì)胞層(2)、PDMS供液層(3)W及PDMS氣動(dòng)閥口控制層(4)的加工是采 用常用的軟光刻加工方法，運(yùn)Ξ層結(jié)構(gòu)先是用SU-8光刻膠再娃片上用光刻機(jī)制作出設(shè)計(jì)好的 圖案;然后用PDMS娃橡膠(如現(xiàn)有的道康寧Sylgard DC184產(chǎn)品），將其主劑和固化劑分別W 10:1、20:1、5:1的比例配制成誘注液，誘注在各自的娃片模版上，即可制得帶有微通道的忍片 基片。最終加工出來的PDMS接種細(xì)胞層(2 )、PDMS供液層(3 ) W及PDMS氣動(dòng)閥口控制層(4 )的 夕h形尺寸分另!]是51巧巧乂2至巧⑩Xi化化.'、《I始戚朱別妨泌戈々-油a撤'、《I貓化《2}化巧X2化從（長(zhǎng)X 寬￥:髙）。最后通過基于等離子清洗技術(shù)的鍵合工藝來完成忍片的組裝。
[0025] 如圖2所示，PDMS接種細(xì)胞層(2)上設(shè)有Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室，深度是25μπι。Ξ個(gè)細(xì) 胞共培養(yǎng)腔室中，每個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔室包括兩個(gè)接細(xì)胞腔室，一個(gè)腔室接入癌細(xì)胞，另一個(gè) 腔室接入正常細(xì)胞，兩個(gè)接細(xì)胞腔室中間設(shè)微流道陣列（11)，由集成在忍片上的氣動(dòng)控制 閥口（18)控制微流道陣列（11)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)兩個(gè)接細(xì)胞腔室的連通和閉合。Ξ個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)腔 室均配置一個(gè)微流道陣列（11 )，微流道陣列（11)具有40個(gè)微通道，相鄰微通道間隔40WI1排 列，每一個(gè)微通道尺寸是40μπιΧ25皿Χ400皿（寬X高X長(zhǎng)）。^個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)