一種檢測(cè)貉源性物種成分的特異性引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)貉源性物種成分的特異性引物及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物源性成分 特異性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 絡(luò)在動(dòng)物分類學(xué)中屬于哺乳綱、食肉目、犬科、絡(luò)屬（Nyctereutes)，起源于中國(guó)的 東北部烏蘇里江地帶以及俄羅斯境內(nèi)。最初馴化飼養(yǎng)的貉成為烏蘇里貉，后培育出很多毛 色變種，如吉林白貉和紅色貉等。我國(guó)開(kāi)展毛皮動(dòng)物相關(guān)飼養(yǎng)技術(shù)研宄始于上世紀(jì)50年 代，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物以其獨(dú)特的資源特性、重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求而成為我 國(guó)農(nóng)業(yè)的新興特色產(chǎn)業(yè)。我國(guó)是特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)大國(guó)，貉年飼養(yǎng)量達(dá)3000萬(wàn)只。
[0003] 目前，食品安全問(wèn)題引起了各國(guó)政府和消費(fèi)者的高度關(guān)注，尤其是肉食品、動(dòng)物飼 料安全性等關(guān)系人民健康、百姓切身利益的問(wèn)題得到了廣泛重視。瘋牛病、禽流感、狂犬病、 犬瘟熱等在世界各地的蔓延和傳染給人類的事也有發(fā)生，目前畜禽肉食品的動(dòng)物源性成分 的鑒別檢測(cè)已涉及到肉食品的工業(yè)、進(jìn)出口貿(mào)易、市場(chǎng)及餐飲業(yè)等領(lǐng)域。檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)檢 測(cè)高新技術(shù)進(jìn)步的需求日益強(qiáng)烈，在飼料貿(mào)易、進(jìn)出口防疫檢查、肉制品消費(fèi)市場(chǎng)監(jiān)督等方 面表現(xiàn)尤為突出。貉是犬科動(dòng)物，貉肉作為養(yǎng)殖業(yè)的附屬品，常被用作飼料甚至做成肉制 品，如果未經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)檢疫程序，一旦攜帶致病因子，極大地危害了消費(fèi)者的健康，擾亂了 畜產(chǎn)品及肉制品市場(chǎng)秩序。近年來(lái)，羊肉卷市場(chǎng)比較混亂，很多壓制的羊肉卷中摻雜著貉 肉、狐貍?cè)狻⒑炎尤庖约捌渌忸?，從感官上難以去分辨，也曾有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貉肉有被冒充為 狗肉的現(xiàn)象，為了能快速、特異性檢測(cè)出肉制品或者飼料中的貉的成分，有必要開(kāi)發(fā)出一種 基于分子水平貉源性成分的檢測(cè)方法，為檢驗(yàn)檢疫部門或者消費(fèi)者提供便利的技術(shù)服務(wù)， 并且要求方法簡(jiǎn)便易于操作，檢測(cè)成本低廉。
[0004] 目前，為了確定食物及飼料的真實(shí)成分，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了很多種動(dòng)物源性成分鑒別的 方法，有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法。在分子生物學(xué)方法中，分子標(biāo)記技術(shù)以其 快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點(diǎn)顯示出巨大的開(kāi)發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。在動(dòng)植物源性成 分鑒別檢測(cè)中應(yīng)用的分子標(biāo)記主要包括核DNA，RNA、線粒體DNA(mtDNA)、和蛋白質(zhì)分子標(biāo) 記等。PCR分子標(biāo)記鑒別檢測(cè)技術(shù)，具有特異性高、針對(duì)性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、對(duì)檢測(cè)樣 品要求較低，比如無(wú)論是經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)途運(yùn)輸或低溫保存多年的陳舊樣本，或者經(jīng)過(guò)一定壓力、溫 度加工后，只要能夠提取基因組核酸，就都可以用于PCR反應(yīng)。
[0005] 哺乳動(dòng)物和禽類mtDNA在遺傳上相對(duì)獨(dú)立，是雙鏈的超螺旋環(huán)狀分子，具有基因 組?。s16kb)、沒(méi)有重復(fù)序列、生物個(gè)體內(nèi)無(wú)組織特異性、每個(gè)細(xì)胞中含有大量線粒體基 因組（哺乳動(dòng)物約1000- 2300個(gè)拷貝）等特點(diǎn)。因此，用mtDNA分子標(biāo)記鑒別畜禽肉食品 及飼料動(dòng)物源性成分與核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、快速、降解?。庸?過(guò)程中mtDNA保持較完整）、穩(wěn)定易操作等優(yōu)勢(shì)?；趧?dòng)物mtDNA的PCR分子標(biāo)記技術(shù)的上 述特點(diǎn)，因此在動(dòng)物源性成分鑒別檢測(cè)中的應(yīng)用具有廣闊的前景。
[0006] 國(guó)外已對(duì)牛、綿羊、豬、雞的源性成分進(jìn)行了研宄報(bào)道，國(guó)內(nèi)對(duì)牛、綿羊、豬、雞、驢、 馬、鹿屬、獅、虎、豹等源性成分鑒定進(jìn)行了研宄報(bào)道。在用分子生物學(xué)方法鑒定檢測(cè)動(dòng)物源 性成分的研宄上，對(duì)貉源性成分鑒別檢測(cè)的研宄很少，張麗華等人利用酶切的方法研宄了 貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析，采用DNA限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（mtDNA-RFLP) 分析技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增細(xì)胞色素 b基因部分序列片段。結(jié)果表明新鮮的貂心 組織可提取完整的mtDNA，并能擴(kuò)增出310bp大小的Cytb基因，與雞心臟mtDNA限制性內(nèi) 切酶酶切圖譜有差異。RFLP方法所用的酶價(jià)格較貴，檢測(cè)成本高。張洪海等人對(duì)鼬科動(dòng)物 線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)分析，但并未進(jìn)一步做源性成分的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)貉源性物種成分的特異性引物及其應(yīng) 用，采取的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)貉源性物種成分的特異性引物，該引物是以 貉屬物種的線粒體全基因組序列為參考序列，篩選出貉線粒體基因組中進(jìn)化速率較快的區(qū) 段，根據(jù)相應(yīng)區(qū)段設(shè)計(jì)引物，最后對(duì)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證后篩選出的引物。
[0009] 所述特異性引物是以GeneBank:NC-013700. 1區(qū)段為模板設(shè)計(jì)得到的特異性引 物。
[0010] 優(yōu)選地，所述特異性引物的正向引物和反向引物的核苷酸序列如下：
[0011] 正向引物：5'-ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0012] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
[0013] 所述特異性引物的引物目標(biāo)擴(kuò)增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0014] 所述特異性引物用于檢測(cè)肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的貉源性物種成分。
[0015] 所述引物擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性：94°C，3min ;進(jìn)入循環(huán)：94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循環(huán)；終止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。
[0016] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有所述特異性引物的試劑盒，該試劑盒包括 10又？0?緩沖液、1〇11111〇1/1正向引物、1〇11111〇1/1反向引物、1〇11111〇1/1(1階1 3和5"1^丁&9〇嫩 聚合酶。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒包括10 X PCR緩沖液、lOumol/L正向引物、lOumol/L反向引 物、lOumol/L dNTP 和 5U/uL TaqDNA 聚合酶；
[0018] 其中，正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0019] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
[0020] 所述試劑盒用于檢測(cè)肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的貉源性成分。
[0021] 所述引物擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性：94°C，3min ;進(jìn)入循環(huán)：94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循環(huán)；終止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物。
[0022] 所述特異性引物是通過(guò)分析比對(duì)了貉屬動(dòng)物線粒體全基因組序列，查找特異性位 點(diǎn)，旨在只針對(duì)貉特異性擴(kuò)增，而對(duì)實(shí)驗(yàn)中涉及到的其他動(dòng)物物種不能擴(kuò)增。本發(fā)明開(kāi)展的 試驗(yàn)初期設(shè)計(jì)了 4對(duì)引物，通過(guò)篩選條件從而確定第4對(duì)引物具有最好的貉屬特異性。4對(duì) 引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 8所示。
[0023] 本發(fā)明著重從鑒定貉源性成分的角度出發(fā)，基于線粒體基因組序列設(shè)計(jì)引物，利 用電泳方法及核酸序列測(cè)定方法，結(jié)合序列比對(duì)，開(kāi)發(fā)研制出一種分子水平上的檢測(cè)試劑 盒，具有靈敏度高、特異性好、易操作等優(yōu)點(diǎn)。
[0024] 本發(fā)明有益效果：具有物種特異性PCR方法的簡(jiǎn)單性、物種特異性和高度靈敏性， 該方法的使用極大地改善和方便了食物、飼料中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)。與其他分子生物學(xué) 技術(shù)如序列分析、PCR-RFLP 或 RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA)相比，本發(fā)明更 加便宜、更加快速、更加適合于大多數(shù)樣品的常規(guī)檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為特異性引物針對(duì)貉等不同物種基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；
[0026] (M，Marker ;1，貉；2,藍(lán)狐；3,銀狐；4,貉子；5,豬；6,雞；7,狗；8,羊）。
[0027] 圖2為靈敏度檢出限電泳圖；
[0028] (M，Marker ;1，貉基因組原濃度；2-6,濃度依次為原濃度的50%，10%，1 %， 0· 5%，0· 1% ) 〇
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0030] 以下實(shí)施例所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試 劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲取。
[0031] 實(shí)施例1貉源性成分DNA的PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的建立
[0032] 一、貉源性DNA的PCR檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)
[0033] 從GenBank檢索到食肉目犬科、絡(luò)屬動(dòng)物線粒體序列相關(guān)信息，將序列進(jìn)行blast 序列比對(duì)，根據(jù)已有的相近物種的線粒體全基因組序列，甄別物種保守區(qū)、分析特異性位 點(diǎn)，篩選適于設(shè)計(jì)貉特異性擴(kuò)增引物的區(qū)段，從初步篩選的8個(gè)適宜區(qū)段中進(jìn)一步分析，排 除易于引起引物二具體、退火溫度不合適等因素，細(xì)化選擇了 4個(gè)位點(diǎn)，作為貉特異性引物 設(shè)計(jì)的位點(diǎn)，而其他區(qū)段都不適合于設(shè)計(jì)貉特異性引物，該引物設(shè)計(jì)基于已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的 NCBI genbank的序列NC-013700. 1。利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5. 0設(shè)計(jì)出鑒別檢測(cè)貉源性 成分的PCR特異性引物即只能擴(kuò)增出貉DNA特