異性片段，擴增不出其它動物DNA限制性片 段
[0034] 1、實驗前期，基于上述原則，并且將設計物與GenBank中羊、豬、牛、赤狐等線粒體 序列進行比對，初步判斷所設計引物是只針對貉具有特異性，引物委托上海生工生物工程 公司代理合成。
[0035] 正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0036] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'
[0037] 2、引物合成后進行了一系列引物特異性驗證擴增試驗，摸索適宜擴增溫度和反應 體系條件，確定特異性引物，作為試驗用貉源性檢驗的引物。貉組織樣本基因組提取，采用 線粒體基因組提取試劑盒提取DNA，購北京百浩生物科技有限公司。PCR擴增反應結(jié)果，用 瓊脂糖凝膠電泳檢測。實驗結(jié)果表明，該引物有較強的特異性，可以作為貉源性成份檢測的 特異性引物。將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定，擴增序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0038] 將該序列與Genbank下載序列進行blast比對，對應序列相似度達99%，進一步說 明該擴增片段是貉源性特異性序列。
[0039] 二、貉源性DNA的PCR檢測試劑盒的構(gòu)建
[0040] 在獲得的上述特異性引物對的基礎上，設計用于貉DNA的PCR檢測的試劑盒，試劑 盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含10 X PCR緩沖液、I Ou mo I /L正向引物、I Ou mo I /L反向引 物、IOu mol/L dNTP、5U/yL TaqDNA聚合酶；其中，所述的引物序列為：
[0041] 正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0042] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'
[0043] 三、貉源性DNA的PCR檢測方法的建立
[0044] 1、DNA樣品的制備
[0045] (1)樣品制備：
[0046] 肌肉樣品：稱取約200mg貉的肌肉組織切碎，用組織研磨器借助研磨成粉末狀。
[0047] 飼料粉末樣品：采用相同的液氮研磨方式，可直接用試劑盒提取線粒體DNA。
[0048] (2) DNA 提取
[0049] 線粒體基因組提取試劑盒提取DNA，購北京百浩生物科技有限公司。按照操作手冊 步驟進行。
[0050] 2、PCR 反應
[0051] (1)反應體系：
[0052] 取3 μ L待測樣品DNA溶液，上下游引物各I. 0 μ L，加入用于貉DNA的普通PCR檢 測的試劑盒中的溶液rtaq mix酶25 μ L，再加入滅菌超純水至總體積50 μ L ;將以上各組分 加入至0. 2mL PCR反應管中，5000r/min，離心IOs ;然后按下列條件參數(shù)進行PCR擴增。
[0053] (2)反應條件：
[0054] 預變性：94°C，3min ;
[0055] 進入循環(huán)：94°C變性30s, 58°C退火30s, 72°C延伸30s, 35次循環(huán)；
[0056] 終止延伸：72°C，IOmin ;
[0057] 4 °C保存反應產(chǎn)物。
[0058] 3、結(jié)果判斷
[0059] 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果是以D2000bp marker對比，在250bp和500bp之間位置處出現(xiàn) 特異性擴增條帶為陽性，沒有特異性擴增條帶為陰性。
[0060] 4、擴增貉DNA產(chǎn)物序列分析：
[0061] 將貉PCR擴增產(chǎn)物進行純化后送上海生工生物工程有限公司進行測序。PCR特異 性擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如SEQ ID NO. 9所示。
[0062] 實施例2PCR檢測方法對肉類樣品中貉源性成分DNA的特異性檢測
[0063] 針對市場中會出現(xiàn)的以貉肉類冒充其他肉制品的現(xiàn)象，本試驗從特異性引物擴增 片段的角度檢測貉源性成分，以期能夠為檢測肉制品中是否摻雜了貉肉提供一種鑒定方 法，為質(zhì)檢部門提供一種分子檢測手段。市場中購買了羊肉、牛肉、豬肉并提取了基因組備 用，毛皮動物養(yǎng)殖場采集了水貂、藍狐組織樣本。肌肉組織提取DNA采用前面提到的試劑盒 完成。采用實施例1的含有特異性引物的檢測試劑盒及檢測方法檢測貉DNA樣品。同時檢 測藍狐、水貂等其他毛皮動物DNA樣品，以此方法的特異性進行評估。
[0064] 特異性檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，只有貉的泳道在250bp和500bp 之間位置處出現(xiàn)了特異性擴增條帶，而其他物種的泳道均為出現(xiàn)特異性擴增條帶。這一試 驗結(jié)果表明：本發(fā)明所設計引物只對貉DNA的特異性擴增引物，對于試驗中涉及的羊、牛、 藍狐、水貂、豬和犬等源性成分基因組DNA沒有特異性擴增條帶，能夠達到檢測貉源性成分 的效果。
[0065] 實施例3貉DNA的PCR檢測方法靈敏度檢測
[0066] 將制備的貉基因組DNA進行梯度稀釋，該樣本的濃度測定值為0,01ug/ul，分別稀 釋至10%，1%，0. 1%，0. 01%，0. 001%，0. 0001%，按照實施例1中的試劑盒和方法對該 稀釋的溶液DNA用于進行檢測靈敏度分析。按照實施例1提供的PCR擴增條件進行試驗， 結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，當濃度稀釋至原濃度的0. 001 %時仍可檢出貉源性成 分，經(jīng)分析計算可知檢出限為KT8UgAil。
[0067] 雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動與修飾，因此，本發(fā)明的保 護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測貉源性物種成分的特異性引物，其特征在于，以貉屬物種的線粒體全基因 組序列為參考序列，篩選出貉線粒體基因組中進化速率較快的區(qū)段，根據(jù)相應區(qū)段設計引 物，最后對引物進行特異性驗證后篩選出的引物。
2. 權(quán)利要求1所述特異性引物，其特征在于，是以GeneBank:NC-013700. 1區(qū)段為模板 設計得到的特異性引物。
3. 權(quán)利要求2所述特異性引物，其特征在于，正向引物和反向引物的核苷酸序列如下： 正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3' 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
4. 權(quán)利要求2所述特異性引物，其特征在于，引物目標擴增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9 所示。
5. 權(quán)利要求2所述特異性引物用于檢測肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的貉源性物種成 分。
6. 權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述引物擴增的條件為：預變性：94°C，3min ;進 入循環(huán)：94°0變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循環(huán)；終止延伸 ：721：，1〇111111;4°〇 保存反應產(chǎn)物。
7. 含有權(quán)利要求1所述特異性引物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括10 x PCR 緩沖液、l〇umol/L正向引物、10umol/L反向引物、10umol/L dNTP和5U/uL TaqDNA聚合酶。
8. 權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括10 x PCR緩沖液、10umol/L 正向引物、l〇umol/L反向引物、10umol/L dNTP和5U/uL TaqDNA聚合酶； 其中，正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3' 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
9. 權(quán)利要求7所述試劑盒用于檢測肉制品、飼料和毛皮產(chǎn)品中的貉源性成分。
10. 權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述引物擴增的條件為：預變性：94°C，3min ; 進入循環(huán)：94°0變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循環(huán)；終止延伸 ：721：，1〇111111; 4°C保存反應產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測貉源性物種成分的特異性引物及其應用，屬于動物源性成分特異性檢測技術領域。本發(fā)明所提供的檢測貉源性成分的特異性引物的正向引物和反向引物分別為：正向引物：5'-ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'；反向引物：5'-GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。本發(fā)明還提供了含有特異性引物的試劑盒以及利用特異性引物檢測肉制品、飼料和毛皮類產(chǎn)品中貉源性成分的方法。本發(fā)明所提供的方法具有操作方便快速、特異性強、檢測條件要求低、靈敏度高的特點，分析檢出限可達10-8ug/ul，適用于肉制品、飼料和毛皮類產(chǎn)品中貉源性成分的檢測。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104611455
【申請?zhí)枴緾N201510092834
【發(fā)明人】孫偉麗, 李光玉, 王卓, 劉晗璐, 鐘偉, 楊雅涵, 樊燕燕
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年3月2日