Hpv58e6特異性兔單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種HPV58E6特異性兔單克隆抗體及其制備 方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，宮頸癌是發(fā)展中國家女性的主要死亡原因之一。人乳頭瘤病毒HPV感染是 導(dǎo)致宮頸癌的必要因素之一，依其致癌性分為高危型和低危型。人乳頭狀瘤病毒是高物種 特異性的小的DNA腫瘤病毒，通過感染宮頸基底上皮進(jìn)而引起宮頸病變。高危型人乳頭瘤 病毒（HPV)持續(xù)感染已被認(rèn)為是宮頸癌及其癌前病變的主要致病因素。已知的高危型別 HPV有15種，HPV58屬高危型HPV，較HPV16和HPV18少見，其感染例數(shù)占所有HPV感染總 數(shù)的11. 5%?28%，而在全世界范圍內(nèi)僅為0?3%。中國內(nèi)地尤其是東南地區(qū)，是全球 HPV58高發(fā)區(qū)之一，流行病學(xué)研宄表明中國多個(gè)地區(qū)宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN)和宮頸癌患者 中HPV58陽性率甚至高于HPV18,僅次于HPV16。HPV58E6、E7是主要的原癌蛋白，具有使宿 主細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能。E6和E7這兩個(gè)病毒蛋白總在HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)。E6結(jié)合細(xì) 胞內(nèi)的泛素連接酶E6-AP(E6-associatedprotein)，使p53泛素化降解，不能轉(zhuǎn)位入核，從 而抑制P53發(fā)揮細(xì)胞阻滯與誘導(dǎo)凋亡的作用。E6蛋白還可以激活端粒酶的表達(dá)并調(diào)節(jié)含盤 狀同源區(qū)域（PDZ)結(jié)構(gòu)域蛋白的活性及腫瘤壞死因子受體，使細(xì)胞達(dá)到永生化。E6與p53 的相互作用可能影響酪氨酸激酶家族（Src)的非受體酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)或使其降解，能激 發(fā)HPV感染細(xì)胞的有絲分裂。
[0003] 冊(cè)￥58屬于冊(cè)￥八9家族，其他還包括冊(cè)￥16,31，33,35,52,67。其基因序列存在很 大程度的相似性。目前市面上僅有HPV16-E6抗體，而沒有HPV58-E6抗體。不同型別人乳 頭瘤病毒具有特異的基因序列，其致癌性也存在明顯的差異。因此制備檢測(cè)HPV58-E6的抗 體對(duì)研宄人乳頭瘤病毒致宮頸癌機(jī)制具有重要的意義。將HPVA9家族的不同HPV型別的序 列進(jìn)行比對(duì)，比較HPV58與HPV16, 31，33, 52,67序列的相似度，找出差異序列，找到HPV58E6 的特異性序列，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)多肽，從而獲得特異性HPV58E6多肽抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種HPV58E6特異性兔單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用， 所述HPV58E6抗體可用于檢測(cè)HPV58E6蛋白。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下方案進(jìn)行實(shí)施：
[0006] 一種HPV58E6特異性兔單克隆抗體，該抗體的基因序列由SEQIDNO. 1所示的重 鏈和SEQIDNO. 2所示的輕鏈組成。
[0007] -種HPV58E6特異性兔單克隆抗體的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)比較HPV58E6 與HPV16E6,HPV31E6,HPV33E6,HPV52E6,HPV67E6 序列，找出 HPV58E6的特異性序列，針對(duì)該特異性序列設(shè)計(jì)多肽ZJM-Ib;ZJM-lb的序列SEQIDNO. 6所 示；
[0009] (2)用ZJM-Ib免疫新西蘭大白兔，取免疫后的新西蘭大白兔的血清，用ELISA檢測(cè) 血清的抗體滴度，篩選出滴度大于ELISA血清滴度判斷標(biāo)準(zhǔn)的血清樣本；
[0010] (3)將步驟2篩選出的血清樣本進(jìn)一步通過Western Blot檢測(cè)血清的抗體特異 性，篩選出抗體陽性的大白兔；
[0011] (4)將篩選出的大白兔的脾細(xì)胞與融合伴侶細(xì)胞240E-W2進(jìn)行細(xì)胞融合，之后 鋪板到96孔培養(yǎng)板，在1640AB培養(yǎng)基（含有體積分?jǐn)?shù)為9 %的血清，體積分?jǐn)?shù)為1 %的 GlutaMAX)中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后換液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)5天，對(duì)上清進(jìn)行ELISA篩 選，找到陽性細(xì)胞克隆；
[0012] (5)將陽性細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)6天（1640AB培養(yǎng)基，含有體積分?jǐn)?shù) 為9 %的血清，體積分?jǐn)?shù)為1 %的GlutaMAX)，取細(xì)胞上清液，用ELISA測(cè)定上清液的滴度； 將上清液20倍稀釋后，用ELISA測(cè)定稀釋液的滴度，篩選出上清液和稀釋液滴度OD值均大 于〇. 3的細(xì)胞上清液樣本；
[0013] (6)將步驟5篩選出的細(xì)胞上清液樣本進(jìn)行抗體WesternBlot檢測(cè)，進(jìn)一步篩選 出表達(dá)HPV58E6特異性抗體的克??；
[0014] (7)針對(duì)每個(gè)克隆，提取RNA，用引物F1/R1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到多個(gè)重鏈cDNA 和多個(gè)輕鏈cDNA;將cDNA分別構(gòu)建到pTT5質(zhì)粒表達(dá)載體中，將包含重鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒 與包含輕鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒進(jìn)行兩兩配對(duì)，共轉(zhuǎn)染到HEK-293-6E細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)； 引物F1/R1的基因序列分別如SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8所示；
[0015] (8)取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，進(jìn)行ELISA檢測(cè)；篩選IgG濃度最高且滴度OD值大于 0. 3的配對(duì)，即為HPV58E6特異性兔單克隆抗體的重鏈和輕鏈配對(duì)。
[0016] 一種HPV58E6特異性兔單克隆抗體的應(yīng)用，該應(yīng)用為將HPV58E6特異性兔單克隆 抗體應(yīng)用于檢測(cè)HPV58E6蛋白。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易操作，周期短，易于獲得所需抗體。 本方法通過設(shè)計(jì)特異性多肽段，可以獲得特異性強(qiáng)的抗體。通過設(shè)計(jì)重鏈輕鏈表達(dá)質(zhì)粒， 可以獲得高效的重組抗體，明顯縮短了時(shí)間。將HPV58E6特異性兔單克隆抗體可用于檢測(cè) HPV58E6蛋白，檢測(cè)特異性高，靈敏度高。
【附圖說明】
[0018] 圖1是檢測(cè)血清抗體westernblot圖，圖中，1和3上樣樣本為pEGFP-Cl-HPV58E6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所提蛋白2和4上樣樣本為pEGFP-Cl空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所提蛋 白；1和2所用一抗為ZJM-I兔#YK-353以I:1000倍比稀釋，3和4所用一抗為ZJM-I兔 #YK-353以I:1000倍比稀釋加5ug多肽阻斷劑；
[0019] 圖2是檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清western blot圖，圖中，左邊4條帶為 PEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所提蛋白，中間4條帶為pEGFP-Cl-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染293T細(xì)胞所提蛋白，右邊4條帶為pEGFP-Cl空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所提蛋白；所用一 抗為：1所用一抗為ZJM-1-5以1:100稀釋；2所用抗體為ZJM-1-9以1:100稀釋；3所用抗 體為ZJM-1-27以1:100稀釋；4所用抗體為YK-353抗血清以1:1000稀釋；
[0020] 圖 3 是檢測(cè)重組抗體westernblot圖，圖中，HPV58E6 為pEGFP-Cl-HPV58E6 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染組，HPV16E6為pEGFP-Cl-HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；所用一抗為：IB-5為ZJM-lb-5以1:100 稀釋，IB-9 為ZJM-lb-9 以 1:100 稀釋，IB-27 為ZJM-lb-27 以 1:100 稀釋；
[0021] 圖4是重組抗體SDS-PAGE純度測(cè)定結(jié)果圖；
[0022] 圖 5 是檢測(cè)HPV58E6 表達(dá)westernblot圖，圖中，1 為pEGFP-Cl-HPV16E6 質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染組，2為pEGFP-Cl-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，3為pEGFP-Cl空載質(zhì)粒組，4為空白對(duì)照組，5為 marker。所用一抗為：使用HPV58E6特異性兔單克隆抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 本實(shí)施例制備HPV58E6特異性兔單克隆抗體，包括以下步驟：
[0026] 第1步、多肽合成及交聯(lián)
[0027]從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 搜索出HPV58E6、HPV16E6、HPV31E6、 HPV33E6、HPV52E6、HPV67E6 的序列，并比較HPV58E6 與HPV16E6,HPV31E6,HPV33E6， HPV52E6,HPV67E6序列，找出HPV58E6的特異性序列，針對(duì)該特異性序列設(shè)計(jì)兩條多肽，即 為特異性HPV58E6多肽抗原ZJM-Ia和ZJM-Ib;兩條特異性HPV58E6多肽抗原的序列分別 為VCWRPRRRQTQV(SEQIDN0.5)和ETSVHEIELKCV(SEQIDN0.6)。
[0028] 第2步、免疫動(dòng)物和血清滴度測(cè)定
[0029] 免疫方案：采用標(biāo)準(zhǔn)免疫方案進(jìn)行免疫，每只兔子實(shí)施5-6次注射免疫，取2-3次 血清用于測(cè)試。每次注射免疫時(shí)，把分裝好的抗原解凍并與弗氏完全佐劑（CFA)(第一次注 射免疫）或弗氏不完全佐劑（后面的免疫注射）充分混勻并采用皮下注射方式免疫兔子。 具體如下：
[0030] 用HPV58E6兩條多肽抗原免疫4只新西蘭大白兔（YK-350、YK-351、YK-352、 YK-353)，免疫辦法如表1所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種HPV58E6特異性兔單克隆抗體，其特征在于，該抗體的基因序列由SEQ ID NO. I 所示的重鏈和SEQ ID NO. 2所示的輕鏈組成。
2. -種權(quán)利要求1所述的HPV58E6特異性兔單克隆抗體的制備方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟： (1) 比較HPV58E6與HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E6序列，找出HPV58E6 的特異性序列，針對(duì)該特異性序列設(shè)計(jì)多肽ZJM-Ib ;ZJM-lb的序列SEQ ID NO. 6所示； (2) 用ZJM-Ib免疫新西蘭大白兔，取免疫后的新西蘭大白兔的血清，用ELISA檢測(cè)血清 的抗體滴度，篩選出滴度大于ELISA血清滴度判斷標(biāo)準(zhǔn)的血清樣本； (3) 將步驟2篩選出的血清樣本進(jìn)一步通過Western Blot檢測(cè)血清的抗體特異性，篩 選出抗體陽性的大白兔； (4) 將篩選出的大白兔的脾細(xì)胞與融合伴侶細(xì)胞240E-W2進(jìn)行細(xì)胞融合，之后鋪板到 96孔培養(yǎng)板，在1640AB培養(yǎng)基(含有體積分?jǐn)?shù)為9%的血清，體積分?jǐn)?shù)為1%的GlutaMAX)中 進(jìn)行克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后換液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)5天，對(duì)上清進(jìn)行ELISA篩選，找到陽性 細(xì)胞克隆； (5) 將陽性細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)6天(在1640AB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng) 基中含有體積分?jǐn)?shù)為9%的血清，體積分?jǐn)?shù)為1%的GlutaMAX)，取細(xì)胞上清液，用ELISA測(cè)定 上清液的滴度；將上清液20倍稀釋后，用ELISA測(cè)定稀釋液的滴度，篩選出上清液和稀釋液 滴度OD值均大于0. 3的細(xì)胞上清液樣本； (6) 將步驟5篩選出的細(xì)胞上清液樣本進(jìn)行抗體Western Blot檢測(cè)，進(jìn)一步篩選出表 達(dá)HPV58E6特異性抗體的克隆； (7) 針對(duì)每個(gè)克隆，提取RNA，用引物F1/R1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到多個(gè)重鏈cDNA和多 個(gè)輕鏈cDNA ;將cDNA分別構(gòu)建到pTT5質(zhì)粒表達(dá)載體中，將包含重鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒與 包含輕鏈cDNA的ρΤΤ5質(zhì)粒進(jìn)行兩兩配對(duì)，共轉(zhuǎn)染到ΗΕΚ-293-6Ε細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；弓丨 物F1/R1的基因序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示； (8) 取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，進(jìn)行ELISA檢測(cè)；篩選IgG濃度最高且滴度OD值大于0. 3的 配對(duì)，即為HPV58E6特異性兔單克隆抗體的重鏈和輕鏈配對(duì)。
3. -種權(quán)利要求1所述的HPV58E6特異性兔單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用為 將HPV58E6特異性兔單克隆抗體用于檢測(cè)HPV58E6蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明制備了HPV58-E6特異性兔單克隆抗體，包括如下步驟：設(shè)計(jì)HPV58E6特異性多肽段,合成多肽段并交聯(lián)到兩種載體。將合成好的多肽抗原免疫新西蘭大白兔，測(cè)定血清滴度，Western Blot檢測(cè)抗體特異性，然后將脾細(xì)胞與融合伴侶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合培養(yǎng)后，取上清檢測(cè)抗體滴度及特異性,篩選出特異度及效價(jià)最好的融合細(xì)胞,將融合細(xì)胞裂解提取RNA，做RT-PCR，獲得抗體重輕鏈cDNA, 構(gòu)建入pTT5質(zhì)粒載體，將包含重輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293-6E細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)獲得重組抗體，即為HPV58-E6單克隆抗體。此抗體可用于Western Blot檢測(cè)HPV58型癌基因E6的表達(dá)。
【IPC分類】G01N33-68, C07K16-08, G01N33-577
【公開號(hào)】CN104610448
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510054024
【發(fā)明人】呂衛(wèi)國, 鄒健, 程曉東, 李陽, 章鑒洋, 謝幸
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月3日