一種棉花脅迫應(yīng)答相關(guān)蛋白GhGeBP及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的植物遺傳改良技術(shù)及植物生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種棉 花脅迫應(yīng)答相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]GeBP(GLlenhancerbindingprotein)是植物中特有的一種轉(zhuǎn)錄因子家族，擬南 芥中包含23個成員，陸地棉中發(fā)現(xiàn)該家族5個成員基因。JulienCurabaetal. (2003) 曾報道GeBP主要是營養(yǎng)器官的分生組織和幼嫩的葉原基表達(dá)，作為抑制子決定葉片細(xì)胞 分化命運；Chevalieretal. (2008)研究表明，GeBP和類GeBP蛋白編碼一類非保守的新 型包含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，并且這類蛋白參與到Cytokininpathway中，抑 制ARR基因?qū)?xì)胞分裂素應(yīng)答的負(fù)調(diào)控作用。Perazzaetal. (2011)研究結(jié)果為CPR5 (CONSTITUTIVEEXPRESSOROFPATHOGENESIS-RELATEDGENES5)和GeBP/GPLs在調(diào)控細(xì)胞 膨大方面起相反作用。但是關(guān)于GeBP在植物抗逆方面的作用尚無研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種蛋白及其編碼基因和其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白名稱 為GhGeBP,來源于陸地棉（Gossypiumhirsutum)。
[0004] 本發(fā)明所述蛋白是如下1)或2)的蛋白：
[0005] 1)序列表中的SEQIDNs.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0006] 2)將序列表中的SEQIDNs. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加且與植物脅迫應(yīng)答相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0007] 序列表中SEQID N2. 2所示的氨基酸序列由389個氨基酸殘基組成。
[0008] 上述1)和2)中的GhGeBP蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物 表達(dá)得到。上述1)和2)中的GhGeBP蛋白的編碼基因可通過將序列表中SEQIDNs. 1的 第88-1254位核苷酸所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一 個或幾個堿基對的錯義突變后得到。
[0009] 編碼所述GhGeBP蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010] 所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可以 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0011] 本發(fā)明的又一個目的是提供所述蛋白的編碼基因。
[0012] 所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一：
[0013] 1)序列表中SEQIDNs:1第88-1254位的核苷酸序列；
[0014] 2)編碼序列表中SEQIDN2 :2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；
[0015] 3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDN2 :1限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列；
[0016] 4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白 質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以 上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0017] 上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0? 1%SDS和IXSSC，0? 1%SDS各洗膜一次。
[0018] 其中，序列表中的SEQIDN2 :1由1378個核苷酸組成，其開放閱讀框架（ORF)為 自5'末端第88-1254位核苷酸，編碼序列表中SEQIDN2 :2所示的蛋白質(zhì)，即本發(fā)明所述 的GhGeBP蛋白。
[0019] 含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0020] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0021] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的 3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。 所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá) 載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動 子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載 體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物 進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化 的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記 物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莠劑基因）等。 從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0022] 擴(kuò)增本發(fā)明所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023] 本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明所述蛋白、編碼基因和含有所述編碼基因的重 組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在下述至少一種中的應(yīng)用：
[0024] 1)調(diào)節(jié)植物鹽脅迫應(yīng)答；
[0025] 2)調(diào)節(jié)植物ABA脅迫應(yīng)答。
[0026] 所述調(diào)節(jié)植物鹽脅迫應(yīng)答為使植物的耐鹽性增強(qiáng)；
[0027] 所述調(diào)節(jié)植物ABA脅迫應(yīng)答為使植物的耐ABA性增強(qiáng)。
[0028] 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花；所 述棉花具體為陸地棉（Gossypiumhirsutum)。
[0029] 本發(fā)明的還一個目的是提供本發(fā)明所述的蛋白、編碼基因和含有所述編碼基因的 重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌在培育在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0030] 具體的，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下至少一種性狀：1)植物的耐鹽性增強(qiáng)；2)植物 的耐ABA性增強(qiáng)。
[0031] 具體的所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉 花；所述棉花具體為陸地棉（Gossypiumhirsutum)。
[0032] 本發(fā)明再一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將本發(fā)明所述的編碼基 因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物。
[0033] 所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀：1)植物的耐鹽性 增強(qiáng)；2)植物的耐ABA性增強(qiáng)。
[0034] 具體的，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或 棉花；所述棉花具體為陸地棉（Gossypiumhirsutum)。
[0035] 本發(fā)明從陸地棉中克隆出棉花GhGeBP基因，成功構(gòu)建植物過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，與對照相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥比非轉(zhuǎn)基因擬南芥 耐鹽性和耐ABA性提高，因此本發(fā)明豐富了培育高耐鹽棉花品種的基因資源。
【附圖說明】
[0036] 圖1為150mMNaCl脅迫處理陸地棉"中G5"0. 5h后，中G5不同組織部位的GhGeBP 基因差異表達(dá)情況，其中CK為正常對照組結(jié)果，NaCl表示鹽脅迫處理組結(jié)果。
[0037] 圖2為部分轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR鑒定結(jié)果圖，其中CK+表示以質(zhì)粒DNA為模 板，CK-表示野生型擬南芥DNA為模板。
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 陸地棉品種"中G5"種子(王坤波，崔榮霞，王春英等.棉花新材料中G5主要特 點.中國棉花.2000, 24.)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲 得。
[0041] 實施例1、棉花GhGeBP基因的制備
[0042] 以陸地棉（GossypiumhirsutumL.)品種中G5水培苗為材料分別提取基因組DNA 和總RNA;將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;分別以基因組DNA和cDNA為模板，以GhGlF和 GhGlR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上述PCR擴(kuò)增的引物序列如下：
[0043] GhGlF :5' ATTTGCTATTGCCTCCTTCCCTGTT3'
[0044]GhGIR:5 'GAGCTACAGATACCCCCCATGATTG3 '
[0045]PCR反應(yīng)體系為50ii1,反應(yīng)體系為：2ii1模板（cDNA或基因組DNA),Iii1引物 (10iiM)，5ii110XLAbuffer, 8illdNTP(2.5mMeach), 0.5illLA-Taq酶，34. 5illddH20。
[0046]PCR反應(yīng)程序為：94°C5min，lcycle;94°C30s，60°C30s，72°C90s(2min)， 30cycles；72°CIOmin,4°C00,lcycle〇
[0047] 將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收片段，連接至pMD18-T vector(TAKARA，D101A)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a菌株，37°C倒置過夜暗培養(yǎng)。經(jīng)過藍(lán) 白斑篩選，挑取單克隆，菌落PCR驗證陽性克隆，將陽性克隆菌液送樣測序。測序結(jié)果表明， 以基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的片段與以cDNA為模板擴(kuò)增得到的片段大小相同，通過分析 測序結(jié)果，對比cDNA序列與基因組DNA序列，發(fā)現(xiàn)該基因無內(nèi)含子；上述PCR擴(kuò)增得到核酸 片段具有序列表中SEQIDN2:l的核苷酸序列，共1378bp，其中編碼區(qū)長1167bp(不包括 終止子)，該編碼區(qū)序列如序列表中SEQIDNs: 1中第88-1254位核苷酸所示，編碼序列表 中SEQIDN2 :2所示的氨基酸序列，共389個氨基酸殘基，分子量為43KD，等電點為5. 03。 將該具有序列表中SEQIDN2 :1中第88-1