一種基于抗甘膽酸特異性抗體的甘膽酸的免疫檢測試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域。具體而言涉及一種甘膽酸半抗原、以及使用該甘膽酸 半抗原制備的抗體以及使用所制備抗體的免疫檢測試劑。具體而言涉及一種甘膽酸時(shí)間分 辨熒光免疫測試條，測試條所用的抗體是用合成的甘膽酸免疫原免疫小鼠制備的甘膽酸特 異性單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘膽酸（Cholyglycine, CG)是膽酸與甘氨酸結(jié)合而成的結(jié)合型膽酸之一。在肝細(xì) 胞內(nèi)，膽固醇經(jīng)過及其復(fù)雜的酶促反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成初級膽汁酸，其中有膽酸（CA)和鵝去氧膽 酸（CD-CA)膽酸、鵝脫氧膽酸（CDCA)和脫氧膽酸（DCA)等。膽酸的類固醇核上有三個羥基 (C3、C7、C12)，側(cè)鏈末端的羧基以肽鍵與甘氨酸結(jié)合，形成甘膽酸，分子量為465. 63,結(jié)構(gòu)如 式1，
[0003]
[0004] 甘膽酸正常代謝途徑為腸一肝循環(huán)，先由肝細(xì)胞合成，經(jīng)毛細(xì)膽管、膽管排入膽 囊，隨同膽汁進(jìn)入十二指腸，幫助食物消化。95%甘膽酸在回腸末端重吸收，經(jīng)門靜脈再回 肝臟，由肝細(xì)胞攝取再利用。正常情況下，肝臟能有效攝取門靜脈血中99%以上的甘膽酸， 僅有1 %甘膽酸進(jìn)入體循環(huán)，因此外周血中甘膽酸含量甚微，正常成人無論空腹或餐后，其 血清甘膽酸濃度穩(wěn)定在低水平。
[0005] 當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞攝取甘膽酸能力下降，致使血中甘膽酸含量增高；膽汁 郁滯時(shí)，肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙，而返流血液循環(huán)的甘膽酸含量增高，也使血甘膽酸含量增 高。臨床證明，各種肝臟疾病如：肝癌、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘膽酸水平均 顯著升高。大量研究表明，肝損傷的生化指標(biāo)中甘膽酸比谷丙轉(zhuǎn)氨酶，膽紅素等傳統(tǒng)的肝功 能檢驗(yàn)指標(biāo)更敏感。甘膽酸結(jié)合其他指標(biāo)的分析可以為肝臟疾病的診斷、治療和預(yù)后分析 提供更多的依據(jù)。此外，甘膽酸水平也是多種膽道系統(tǒng)疾病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥及酒精 性肝損傷等的重要診斷依據(jù)。因此，測定血清甘膽酸是評價(jià)肝細(xì)胞功能及其肝膽系物質(zhì)循 環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一。
[0006] 目前，體外定量測定甘膽酸主要是使用放射免疫分析法（RIA)，化學(xué)發(fā)光免疫分析 法（CLIA)等。放射免疫分析法由于需要專門的放免實(shí)驗(yàn)室及設(shè)施，普通實(shí)驗(yàn)室難以開展， 另外還會對操作人員的健康產(chǎn)生一定危害，目前已很少使用?；瘜W(xué)發(fā)光法靈敏度高，但是測 定速度較慢，且專用的化學(xué)發(fā)光檢測儀器昂貴，不利于基層開展。
[0007] 目前本領(lǐng)域需要制備特異性強(qiáng)、靈敏度高的抗甘膽酸特異性抗體，并用該抗體開 發(fā)出快速、準(zhǔn)確、高效、簡便的甘膽酸檢測試劑，而時(shí)間分辨免疫層析測試條，以其檢測速度 快、操作簡單、靈敏度高等特點(diǎn)，已得到越來越多的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 為了解決現(xiàn)有甘膽酸臨床診斷的不足，本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、簡 便、準(zhǔn)確檢測待測樣本中甘膽酸含量的時(shí)間分辨免疫層析測試條及其制備方法。
[0009] 本發(fā)明還提供一種新的甘膽酸免疫原合成方法，用該方法合成的甘膽酸免疫原免 疫小鼠獲取特異性和親和力高的單克隆抗體，以及使用所獲得的單克隆抗體的時(shí)間分辨層 析測試條。
[0010] 具體而言，本發(fā)明涉及一種甘膽酸半抗原，其結(jié)構(gòu)式如式1，
[0011] 123456 2 其中R為一（CH2)n-，η為2-8的任意整數(shù)，載體蛋白為牛血清白蛋白或者人血 清白蛋白。 3 此外，本發(fā)明還涉及由上述甘膽酸半抗原制備的抗體?？梢允嵌嗫寺】贵w，也可以 是單克隆抗體，尤其是由所述半抗原免疫小鼠得到的單克隆抗體。 4 再次，本發(fā)明還涉及一種檢測甘膽酸的測試條，包括： 5 底板，樣品墊，結(jié)合物釋放墊，反應(yīng)膜，吸水紙； 6 其中在背板上依次放置樣品墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜和吸水紙，并且樣品墊與結(jié) 合物釋放墊的一側(cè)有部分重疊，但樣品墊與反應(yīng)膜不重疊；結(jié)合物釋放墊另一側(cè)與反應(yīng)膜 的一側(cè)部分重疊，但結(jié)合物釋放墊與吸水紙不重疊；反應(yīng)膜的另一側(cè)與吸水紙部分重疊； 并且在反應(yīng)膜上從與結(jié)合物釋放墊部分重疊一側(cè)至與吸水紙部分重疊一側(cè)依次劃有結(jié)核 抗原檢測線和質(zhì)控線，并且檢測線和質(zhì)控線均不與結(jié)合物釋放墊和吸水紙重疊；
[0018] 并且其中與抗甘膽酸特異性單克隆抗體偶聯(lián)的時(shí)間分辨熒光納米粒子位于結(jié)合 物釋放墊中。反應(yīng)膜上的檢測線為卵清蛋白、血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺球蛋白與甘膽 酸衍生物偶聯(lián)物，上述的甘膽酸衍生物如下式2所示，
[0019]
[0020] 其中R為一（CH2)n -，η為2-8的任意整數(shù)。
[0021] 在所述測試條中，所述抗甘膽酸的特異性抗體可以是抗甘膽酸多克隆抗體或者單 克隆抗體，尤其由所述半抗原免疫小鼠得到的單克隆抗體。
[0022] 在所述的測試條，所述乳膠粒子外面包裹氨基葡萄糖凝膠層，內(nèi)部含有鑭系元素。 鑭系元素包括釤、銪、鉞、或其螯合物。
[0023] 在所述的測試條，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或者尼龍膜，尤其是 硝酸纖維素膜。
[0024] 本發(fā)明所述的測試條適用的生物樣品為血漿、血清或者尿液。
[0025] 前述甘膽酸免疫檢測試劑可以用于檢測待測樣本中甘膽酸的含量，所述的待測樣 本為血清、血漿或尿液。
[0026] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：本發(fā)明制備的甘膽酸免疫原特異性強(qiáng)，暴露出甘膽酸 特有的與其它膽汁酸相區(qū)別的甘氨酸部分，制備出的抗甘膽酸單克隆抗體的特異性強(qiáng)、效 價(jià)高，與其他膽汁酸包括膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸等的交叉反應(yīng) < 20%，與其他常見藥物無交叉；而本發(fā)明制備的甘膽酸時(shí)間分辨免疫層析測試條，使用 了時(shí)間分辨熒光納米粒子，與普通熒光微球相比，大幅度消除了非特異性的結(jié)合，檢測信 號的信噪比顯著提高，與膠體金定量方法相比，消除了樣本和背景的干擾，結(jié)果更為準(zhǔn)確， 具有檢測速度快、操作簡單、靈敏度高等特點(diǎn)，具有明顯的臨床檢驗(yàn)優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0027] 圖1是說明本發(fā)明免疫層析測試條與對照化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測結(jié)果的相互關(guān)系 的圖。
[0028] 以下通過【具體實(shí)施方式】可以使本發(fā)明得到更清楚的說明，但本發(fā)明并不局限于以 下實(shí)施例。
[0029] 實(shí)施例一：甘膽酸衍生物的制備及鑒定
[0030] 以下實(shí)施例中所用的甘膽酸衍生物甘氨酸甲酯丁二酸酯化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式4所示：
[0031]
[0032] 該化合物的合成路線如下：
[0033]
[0034] 該衍生物具體的合成步驟如下：
[0035] 化合物2的合成
[0037] (1)將50. 0g(122. 4mmol)化合物1膽酸溶于120mL甲醇，在4°C冰浴攪拌下通氯 化氫氣體3g，加熱回流20分鐘。
[0038] (2)將上述合成溶液冷卻，過濾，干燥，得42. 7g產(chǎn)品，白色固體，產(chǎn)率82. 6%。
[0039] 化合物3的合成
[0041] (1)稱取38. lg(90. 2mmol)化合物2溶于400mL吡啶中，0 °C加入 21. 2g(lll. 2mmol)對甲苯磺酰氯（TsCl)，將此溶液在室溫下攪拌24h，得到合成溶液。
[0042] (2)將上述合成溶液加入水1000ml，用500ml乙酸乙酯萃取兩次，合并有機(jī) 相，5%鹽酸洗，水洗，干燥蒸干。柱色譜純化產(chǎn)品，得35. 3g產(chǎn)品，白色固體，產(chǎn)率67. 9%。
[0043] 化合物4的合成
[0045] (1)稱取 18. 2g(31. 6mmol)化合物 3 和 6. 5g(100.0 mmol)疊氮鈉溶于 120mlDMF 中，60°C反應(yīng)24小時(shí)，得到合成溶液。
[0046] (2)將上述合成溶液加入水1200ml，600ml乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯萃取 液，水洗，干燥，蒸干，柱色譜純化得11. 7g產(chǎn)品，白色固體，產(chǎn)率82. 9%。
[0047] 化合物5的合成
[0049] (1)稱取10. 9g (24. 4mmol)化合物4,溶于50mL的甲醇，再加入50mL 2M的Κ0Η溶 液，加熱至完全溶解，冷卻，加入水500ml，乙酸乙酯500ml，用鹽酸酸化至pHl. 0,得到合成 溶液。
[0050] (2)將上述合成溶液分液，乙酸乙酯層用水洗一次，干燥蒸干，得9. 73產(chǎn)品，白色 固體，產(chǎn)率92. 2%
[0051] 化合物6的合成
[0053] (1)稱取5.3g(12.2mmol)化合物5,甘氨酸甲酯鹽酸鹽4.9g(39.3