專利名稱：梅毒心磷脂和特異性抗體IgG免疫印跡試劑盒及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體 檢測(cè)免疫印跡試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播 性疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或者 胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液，播散全身，使機(jī)體幾乎所有 的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏 期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言“由于有高敏度檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒 是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，至今梅毒依然是 世界范圍的公共衛(wèi)生問題，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大約有1200萬的患者，其 中60萬孕婦患者([1]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測(cè)方 法的選擇.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.2010,20(10) :1491-1494)。事實(shí)上，梅毒的感染現(xiàn)狀可 能要比想象中的更讓人悲觀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試 驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測(cè)兩大類型。梅毒特異性抗體IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗體分別于2周和4周后產(chǎn)生，即使患者經(jīng)過足夠治療，其仍能長期存在，甚至終身不消 失([2]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體 聯(lián)合檢測(cè).中國皮膚性病學(xué)雜志.2010，152 (0 =446-448)；而另一種抗體物質(zhì)反應(yīng)素產(chǎn) 生較晚，一般在受感染后5 7周產(chǎn)生，而且晚期梅毒、梅毒治療后期以及潛伏梅毒可能 陰性，因此梅毒特異性抗體的陽性率、敏感性顯著高于反應(yīng)素。TP-IgM是梅毒感染后，機(jī) 體最先出現(xiàn)的特異性抗體。只要有活的梅毒螺旋體存在，其TP-IgM將會(huì)維持在一定的水 平。Martina H 等([3]MartinaH, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61-66.)認(rèn)為TP-IgM是梅毒早期感染并活動(dòng)的一項(xiàng)血清 學(xué)標(biāo)志，李步榮等([4]李步榮，賀軍濤，張毅，等.梅毒螺旋體IgM抗體檢測(cè)的臨床意義 [J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，觀(16) :1495-1497)認(rèn)為TP-IgM與TP-DNA —樣，代表著梅 毒傳染性指標(biāo)。在排除近期抗梅毒治療的前提下，TP-IgM若不轉(zhuǎn)陰，提示體內(nèi)可能殘存梅 毒螺旋體或治療不徹底。TP-IgM陰轉(zhuǎn)者隨訪時(shí)再轉(zhuǎn)陽性，表明再次感染梅毒([5]RaWStr0n SA, Mehta S，Bromberg K，et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specificIgM enzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in thediagnosis ofmaternal and congenital syphilis[J]. Sex Transm Dis，2004，31(2) 123-1 )。盡管TP-IgM陰性不能完全排除傳染性，但TP-IgM陽性必定提示該患者具有傳染性。TP-IgG的出現(xiàn)要遲于IgM，能長期存在，甚至終身不消失，因此，TP-IgG是梅毒診斷和流 行病學(xué)調(diào)查的一項(xiàng)重要指標(biāo)([6]Li-Rong Lin, Zuo-Gen Fu,Bing Dan，et al. Development of a colloidalgold-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponemapallidum with TPN17 and TPN47. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，68 :193-200.)。早期的血清學(xué)方法使用完整梅毒螺旋體作為抗原，研究和診斷用的TP是以TP感 染兔睪丸獲得，這種方法存在花費(fèi)大、獲得的TP量少且不純(混有宿主蛋白)、與其他病原 體存在交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)，因此假陽性也時(shí)有發(fā)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及及梅毒螺旋 體抗原的相繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于梅毒實(shí)驗(yàn)已經(jīng)越來越多。目前研究比較多的TP抗 原有 TPNl7、TPN47、TPNl5、TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重組 DNA 技 術(shù)制備的重組抗原可以克服完整TP抗原的缺點(diǎn)，能快速、經(jīng)濟(jì)地制備無限量特異重組TP抗 原。梅毒特異性抗體檢測(cè)方法包括梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(FTA-ABS)及免疫印跡技術(shù) (Western-Blot)等，其特異性均較高。一般地，TPPA，ELISA作為臨床初篩，當(dāng)血清學(xué)陽性， 或臨床診斷有困難時(shí)，需要采用FTA-ABS &Wfestern-bl0t作為確認(rèn)試驗(yàn)。其中，F(xiàn)TA-ABS需 要熒光顯微鏡，而且其結(jié)果判斷需要訓(xùn)練有素和較豐富經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員才能完成，因此，其 應(yīng)用推廣受到一定的限制。采用Western-blot方法制成的試劑盒，一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室均可完 成，不需要特殊設(shè)備，判讀也簡單明了。現(xiàn)市售的ffestern-blot試劑均為進(jìn)口試劑，價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒 及其制備方法。本發(fā)明所述梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒設(shè)有載體板、 硝酸纖維膜、梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線、對(duì)照線，梅毒特異性IgG抗體 和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷 脂IgG抗體檢測(cè)線處包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體； 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人Y鏈抗體。所述梅毒特異性重組抗原可為TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性 重組抗原等。所述載體板可采用PVC板。所述梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以 下步驟1)制備梅毒特異性重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達(dá)，得梅毒特異性重組抗原。2)制備心磷脂抗原豬心肌組織經(jīng)低溫速凍后風(fēng)干，研磨成粉狀后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通過硅膠層析柱洗脫，提取純度95%以上的心磷脂抗原；3)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜總抗體檢測(cè)線上包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照 線處包被人IgG抗體，晾干；4)制備抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn) 定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；5)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記采用過碘酸鈉法進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記；6)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè) 線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線處包 被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，和 酶標(biāo)記的抗人IgG抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印 跡試劑盒。在步驟1)、3)、6)中，所述梅毒特異性重組抗原可為TPW5、TPW7、TPN37、 TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原等。在步驟2)中，所述甲醇和氯仿，按體積比甲醇氯仿可為2:1;在步驟3)中，所述梅毒特異性重組抗原的濃度可為l ^ig/mL;點(diǎn)樣量可為 1 μ L/cm，所述心磷脂抗原的濃度可為0. 003% 0. 03%，點(diǎn)樣量可為1 μ L/cm。在步驟4)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價(jià)在1 IO7以上。在步驟5)中，所述辣根過氧化物酶的底物可由0.03% (W/V)的過氧化氫和 0. 07% (W/V)的二氨基聯(lián)苯胺組成。本發(fā)明提供了一種采用免疫印跡技術(shù)建立梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體 檢測(cè)試劑盒，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG 抗體的檢測(cè)。該檢測(cè)方法所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測(cè) 簡便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。


圖1為本發(fā)明所述梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒中膜條 實(shí)施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果模式示意圖。在圖2中，J為使用前的示意圖，I為無效試驗(yàn)(產(chǎn) 品質(zhì)量問題)，H為陰性結(jié)果，A F為梅毒特異性IgG抗體陽性結(jié)果；G為抗心磷脂IgG抗 體陽性結(jié)果2為梅毒特異性TPN-15-IgG抗體檢測(cè)線，3為梅毒特異性TPN_17_IgG抗體檢測(cè) 線，4為梅毒特異性TPN-37-IgG抗體檢測(cè)線，5為梅毒特異性TPN-44. 5_IgG抗體檢測(cè)線，6 為梅毒特異性TPN-47-IgG抗體檢測(cè)線，7為心磷脂IgG抗體檢測(cè)線，8為對(duì)照線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
參見圖1，本發(fā)明所述梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒實(shí)施 例設(shè)有載體板1、梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線2 7，對(duì)照線8和硝酸纖 維膜(NC膜)9。硝酸纖維膜9粘貼在載體板1上表面，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢 測(cè)線2 7和對(duì)照線8依次設(shè)在硝酸纖維膜9上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗 體檢測(cè)線處分別包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原和心磷脂 抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體。所述載體板采用PVC板。所述梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以 下步驟1)制備 TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47 梅毒特異性重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達(dá)，得TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原。2)制備心磷脂抗原豬心肌組織經(jīng)低溫速凍后風(fēng)干，研磨成粉狀后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通過硅 膠層析柱洗脫，提取純度95%以上的心磷脂抗原。。3)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜總抗體檢測(cè)線上包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47重組 抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，晾干。4)制備抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn) 定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用ELISA的方法鑒定McAb效價(jià)在1 IO7 以上。5)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記采用過碘酸鈉法進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。6)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè) 線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線處包 被TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包 被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，和酶標(biāo)記的抗人IgG抗體及其底物共同組裝成梅毒特異 性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒。以下給出采用梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒檢測(cè)患者的 臨床標(biāo)本1)標(biāo)本采用0. 01mol/L PBS緩沖液進(jìn)行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. Olmol/LPBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)，并編號(hào)。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3次，每次5min。5)加酶結(jié)合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結(jié)合物(采用辣根過氧化物酶 標(biāo)記的抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體)，于室溫(18 25°C)在搖擺搖床上溫育 30mino6)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在 搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結(jié)果判斷將檢測(cè)膜條放置在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后判斷結(jié)果。任何蛋白靶標(biāo)出 現(xiàn)的特異性條帶，均可判斷為陽性，確診為梅毒(見圖2)。以下給出梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的性能檢定1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點(diǎn)、無裂縫，膠帶無 開膠，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標(biāo)本符合率用TP-IgG抗體、TRUST陽性的不同滴度的陽性參比血清各50 份采用梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒檢定，計(jì)算陽性符合率。陽 性參比血清的確定采用FTA-ABS(德國歐蒙公司)法和TRUST(廈門英科新創(chuàng))確定的臨床 標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比血清檢定，計(jì)算陽性符合率。陰性參比血清 的確定采用TPPA(日本富士株式會(huì)社)和TRUST(廈門英科新創(chuàng))法確定的臨床標(biāo)本。4)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒， 用特征性血清檢測(cè)，要求陽性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié) 果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒， 用特征性血清檢測(cè)，要求陽性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié) 果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。7)交叉反應(yīng)采用本梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，進(jìn) 行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾 病的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。8)穩(wěn)定性檢測(cè)應(yīng)用Arrhenius法則，將梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體 免疫印跡試劑盒放置37°C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，確保成品在室溫干燥條 件下保存，有效期為18個(gè)月。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例1將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè) 線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線處包 被TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，和酶標(biāo)記的抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體及其 底物共同組裝成梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒。1)標(biāo)本采用0. 01mol/L PBS緩沖液進(jìn)行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. Olmol/LPBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)，并編號(hào)。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結(jié)合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結(jié)合物(采用辣根過氧化物酶 標(biāo)記的抗人IgG特異性片段Y鏈單克隆抗體)，于室溫(18 25°C)在搖擺搖床上溫育 30mino6)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在 搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結(jié)果判斷將檢測(cè)膜條放置在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后判斷結(jié)果。任何蛋白靶標(biāo)出 現(xiàn)的特異性條帶，均可判斷為陽性，確診為梅毒(見圖2)。實(shí)施例2與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜僅由TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5梅毒 特異性重組抗原和心磷脂抗原組成，不含有TPN47梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施 例1相同。實(shí)施例3與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜僅由TPW5、TPW7、TPN37、TPN47梅毒特 異性重組抗原和心磷脂抗原組成，不含有TPN44. 5梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施 例1相同。實(shí)施例4與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜僅由TPW5、TPW7、TPN44. 5、TPN47梅毒 特異性重組抗原和心磷脂抗原組成，不含有TPN37梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施 例1相同。實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜僅由TPW5、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒 特異性重組抗原和心磷脂抗原組成，不含有TPm7梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施 例ι相同。實(shí)施例6與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜僅由TPW7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒 特異性重組抗原和心磷脂抗原組成，不含有TPN15梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實(shí)施 例1相同。
實(shí)施例7與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本為腦脊液標(biāo)本，結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8性能驗(yàn)證試驗(yàn)按實(shí)施例1的方案制備梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免 疫印跡試劑盒，然后進(jìn)行性能驗(yàn)證。1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點(diǎn)、無裂縫，膠帶無 開膠，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標(biāo)本符合率用TP-IgG抗體陽性和TRUST陽性的不同滴度的陽性參比血 清各50份采用梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒檢定，計(jì)算陽性符合 率。陽性參比血清的確定采用FTA-ABS(德國歐蒙公司)法和TRUST(廈門英科新創(chuàng))確定 的臨床標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比血清檢定，計(jì)算陽性符合率。陰性參比血清 的確定采用TPPA(日本富士株式會(huì)社)法確定的臨床標(biāo)本。4)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒， 用特征性血清檢測(cè)，要求陽性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié) 果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒， 用特征性血清檢測(cè)，要求陽性血清檢測(cè)結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié) 果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。7)交叉反應(yīng)采用本梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，進(jìn) 行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾 病的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。8)穩(wěn)定性檢測(cè)應(yīng)用Arrhenius法則，將梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體 免疫印跡試劑盒放置37°C 20天后檢測(cè)，以上各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，確保成品在室溫干燥條 件下保存，有效期為18個(gè)月。
權(quán)利要求
1.梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于設(shè)有載體板、硝 酸纖維膜、梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線、對(duì)照線，梅毒特異性IgG抗體和 心磷脂IgG抗體檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂 IgG抗體檢測(cè)線處包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體；辣 根過氧化物酶標(biāo)記抗人Y鏈抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特 征在于所述梅毒特異性重組抗原為TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組 抗原。
3.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒，其特 征在于所述載體板采用PVC板。
4.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備 方法，其特征在于包括以下步驟1)制備梅毒特異性重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表 達(dá)，得梅毒特異性重組抗原；2)制備心磷脂抗原豬心肌組織經(jīng)低溫速凍后風(fēng)干，研磨成粉狀后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通過硅膠層 析柱洗脫，提取純度95%以上的心磷脂抗原；3)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜總抗體檢測(cè)線上包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處 包被人IgG抗體，晾干；4)制備抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體以人IgG特異性片段Y鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分 泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；5)抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記采用過碘酸鈉法進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記；6)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線和 對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線處包被梅 毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，和酶標(biāo) 記的抗人IgG抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制 備方法，其特征在于在步驟1) >3)、6)中，所述梅毒特異性重組抗原為ΤΡ^5、ΤΡ^7、ΤΡΝ37、 TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原。
6.如權(quán)利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備 方法，其特征在于在步驟幻中，所述甲醇和氯仿，按體積比甲醇氯仿為2 1 ；
7.如權(quán)利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備 方法，其特征在于在步驟3)中，所述梅毒特異性重組抗原的濃度為1 ％ig/mL ；點(diǎn)樣量為，1 μ L/cm，所述的心磷脂抗原的濃度為0. 003% 0. 03%，點(diǎn)樣量為1 μ L/cm。
8.如權(quán)利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備 方法，其特征在于在步驟4)中，采用ELISA的方法鑒定McAb效價(jià)在1 IO7以上。
9.如權(quán)利要求4所述的梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體免疫印跡試劑盒的制備 方法，其特征在于在步驟幻中，所述辣根過氧化物酶的底物由0.03% (W/V)的過氧化氫和 0. 07% (W/V)的二氨基聯(lián)苯胺組成。
全文摘要
梅毒心磷脂和特異性抗體IgG免疫印跡試劑盒及其制備，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)載體板、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線、對(duì)照線，檢測(cè)線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體檢測(cè)線處包被梅毒特異性重組抗原和心磷脂抗原，在對(duì)照線處包被人IgG抗體；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人γ鏈抗體。先制備梅毒特異性重組抗原，再制備心磷脂抗原，然后硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣，制備抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在標(biāo)記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶后制備免疫印跡試劑盒?？捎糜谌?、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中梅毒特異性IgG抗體和心磷脂IgG抗體的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102081096SQ20111002740
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者劉莉莉, 張忠英, 楊天賜, 林麗蓉 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院