本發(fā)明涉及一種藻類高質(zhì)量細胞核和細胞器DNA的分離方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

藻類是一個多樣性較高的生物類群，在整個群體中占據(jù)著非常重要的位置，而且在整個生命類群中屬于比較古老的類群。隨著分子生物學的發(fā)展，藻類的基因組學的研究將有助于我們更加清晰的了解藻類的獨特之處，獲得更加豐富的基因信息，從而來揭示其神秘的機制。過去幾年中，隨著高通量技術(shù)的成熟及成本的下降，藻類基因組（核基因組和細胞器基因組）已經(jīng)取得了較大的突破，這些研究成果不僅有助于幫助我們了解藻類一些特殊的性狀和分子機制，而且有助于加強我們對藻類乃至光合生物的起源和進化的認識；此外，現(xiàn)在很多學者致力于利用分子生物學的技術(shù)來進行優(yōu)良藻種的選育，從基因組信息來探索一條適合藻類分子育種的新途徑，進而提高優(yōu)良藻種的選育速度。因此，建立藻類基因組對揭示其生命原理及促進藻類產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有深遠意義。

目前由于新一代高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，很多非模式生物的全基因組測序工作開始進行或者已經(jīng)完成，擺脫了以往非模式生物遺傳背景匱乏的現(xiàn)象。作為海洋低等物種的藻類，盡管已有一些藻類的基因組工作完成，但相對于高等植物而言，對其基因組的研究數(shù)量還是相當匱乏的；這是由于藻類DNA中多糖、多酚、高拷貝質(zhì)體和線粒體DNA的存在，制約了藻類核基因組測序工作的進展。所以首先獲得高質(zhì)量和高分子量的藻類核DNA是進行相關(guān)工作的第一步，也是所有工作的前提條件。

對于藻類物種來說，由于其在生長過程中會產(chǎn)生多酚、多糖等次級代謝產(chǎn)物，增加了DNA提取的難度。隨著對藻類的進一步研究，發(fā)現(xiàn)在藻類的總DNA中存在著高拷貝的質(zhì)體和線粒體DNA，這就意味著在實驗過程中只可以得到核DNA占很少比例的DNA，如果用這種DNA來進行高通量測序，不僅會增加測序的成本，而且會降低我們對于藻類基因組信息了解的準確性，很難利用生物信息學手段將細胞核DNA和細胞器DNA分離開，成為目前藻類DNA相關(guān)工作的瓶頸因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種藻類高質(zhì)量細胞核和細胞器DNA的分離方法，實現(xiàn)通過生物信息學手段分離獲得高質(zhì)量的核DNA和細胞器DNA，主要流程包括材料的培養(yǎng)，分離細胞核，利用脈沖場電泳分分離核DNA和細胞器DNA，利用熒光定量技術(shù)檢測質(zhì)體、線粒體和核DNA中的含量，利用高通量測序技術(shù)檢測質(zhì)體、線粒體和核DNA的含量。該方法有效解決了藻類DNA中細胞核DNA和細胞器DNA的分離難題及藻類DNA提取過程中多糖多酚干擾現(xiàn)象，具有分離DNA純度高、操作精準度高、成本低等優(yōu)勢，對促進藻類基因?qū)W發(fā)展及藻類優(yōu)良藻種的選育具有重要意義。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)上述技術(shù)效果：

一種藻類高質(zhì)量細胞核和細胞器DNA的分離方法，具體包括以下步驟：

（1）材料的培養(yǎng)：

把培養(yǎng)至成體的材料用滅菌的海水洗刷3次，然后用吸水紙吸干材料，稱量儲存待用，每次實驗需要5g材料。

（2）分離細胞核：

①取5g材料在液氮中用研缽和研杵研磨，然后迅速地移動至50ml預冷的1xHB緩沖液中；在4℃孵育30分鐘，每隔5分鐘輕輕攪拌；

②將提取液用500目篩絹過濾以除去未消化的組織；

③選用10μm的網(wǎng)格，通過過濾除去細胞碎片；

④將濾液分裝到離心管中，然后在2000g/min、4℃條件下離心20分鐘；

⑤離心完以后棄上清，然后再次加入1xHB緩沖液清洗細胞核至無色，細胞核懸浮在750μl的1xHB緩沖液中；

⑥用等體積的1.4%低熔點瓊脂糖包埋分離的細胞核；

⑦將形成的膠塊放在4℃孵育1小時；

⑧然后用20倍體積的含1%十二烷基磺酸鈉、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液在65℃條件下裂解切成條的膠塊，裂解時間48小時；

⑨去除裂解緩沖液，加入20ml的1mol/L的EDTANa₂去除裂解液中的蛋白酶；

⑩最后將膠塊保存在0.5M的EDTANa₂中待用；

（3）利用脈沖場電泳分離細胞核DNA和細胞器DNA：

①制備一塊1%的瓊脂糖凝膠，將包埋的含有細胞核的膠塊填充在點樣孔；

②設置脈沖場電泳的分離條件為:分離片段的范圍大小為100-1000kb，電壓為120，轉(zhuǎn)角60°，分離12小時，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果；

③將細胞核和細胞器DNA條帶分別切下來，利用低熔點瓊脂糖酶消化膠條，回收DNA，即為細胞核DNA和細胞器DNA。

本發(fā)明提供一種藻類高質(zhì)量細胞核和細胞器DNA的分離方法，其特征在于所述分離細胞核過程中的裂解緩沖液為：含1%十二烷基磺酸鈉、0.5MEDTANa₂和1mg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液。

上述步驟（2）中第⑧步中的膠塊裂解溫度為：50℃。

上述步驟（3）中第③步中的低熔點瓊脂糖酶的酶活為 1000U/ml,工作濃度為 200μl凝膠塊紅加入2U低熔點瓊脂糖酶，消化溫度為60℃，消化時間為 60min。

本發(fā)明提供一種藻類高質(zhì)量細胞核和細胞器DNA的分離方法，實現(xiàn)通過脈沖電泳分離獲得高質(zhì)量的核DNA和細胞器DNA，突破了傳統(tǒng)通過超高速離心獲取質(zhì)體DNA的技術(shù)手段，提高了質(zhì)體DNA的純度，不但降低DNA分離成本，也有效解決了藻類DNA中細胞核DNA和細胞器DNA的分離難題及藻類DNA提取過程中多糖多酚干擾現(xiàn)象，獲取了更加全面的基因組信息，具有分離DNA純度高、操作精準度高、成本低等優(yōu)勢，對促進藻類基因?qū)W發(fā)展及藻類優(yōu)良藻種的選育具有重要意義。

附圖說明

圖1為脈沖場電泳圖譜，其中圖中第一條帶為細胞核DNA，彌散為細胞器DNA；

圖2為利用熒光定量技術(shù)計算核DNA、質(zhì)體DNA和線粒體DNA的比例圖，其中左圖為CTAB法分離后的DNA比例圖，中圖為脈沖分離法核DNA條帶圖，右圖為脈沖分離法細胞器DNA比例圖；

圖3為利用測序技術(shù)計算核DNA、質(zhì)體DNA和線粒體DNA的比例圖，其中左圖為CTAB法分離后的DNA比例圖，右圖為脈沖分離法DNA條帶圖。

具體實施方式

以下通過具體實施例進一步描述本發(fā)明，但所述領(lǐng)域技術(shù)人員應能理解，所述實施例并不以任何方式限定本發(fā)明專利保護的范圍。

實施例1本發(fā)明分離細胞核和細胞器DNA的方法

一種藻類高質(zhì)量細胞核和細胞器DNA的分離方法，具體包括以下步驟：

（1）材料的培養(yǎng)：

把培養(yǎng)至成體的材料用滅菌的海水洗刷3次，然后用吸水紙吸干材料，稱量儲存待用，每次實驗需要5g材料。

（2）分離細胞核：

①取5g材料在液氮中用研缽和研杵研磨，然后迅速地移動至50ml預冷的1xHB緩沖液中；在4℃孵育30分鐘，每隔5分鐘輕輕攪拌；

②將提取液用500目篩絹過濾以除去未消化的組織；

③選用10μm的網(wǎng)格，通過過濾除去細胞碎片；

④將濾液分裝到離心管中，然后在2000g/min、4℃條件下離心20分鐘；

⑤離心完以后棄上清，然后再次加入1xHB緩沖液清洗細胞核至無色，細胞核懸浮在750μl的1xHB緩沖液中；

⑥用等體積的1.4%低熔點瓊脂糖包埋分離的細胞核；

⑦將形成的膠塊放在4℃孵育1小時；

⑧然后用20倍體積的含1%十二烷基磺酸鈉、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液在65℃條件下裂解切成條的膠塊，裂解時間48小時；

⑨去除裂解緩沖液，加入20ml的1mol/L的EDTANa₂去除裂解液中的蛋白酶；

⑩最后將膠塊保存在0.5mol/L的EDTANa₂中待用；

（3）利用脈沖場電泳分離細胞核DNA和細胞器DNA：

①制備一塊1%的瓊脂糖凝膠，將包埋的含有細胞核的膠塊填充在點樣孔；

②設置脈沖場電泳的分離條件為:分離片段的范圍大小為100-1000kb，電壓為120，轉(zhuǎn)角60°，分離12小時，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果；

③將細胞核和細胞器DNA條帶分別切下來，利用低熔點瓊脂糖酶消化膠條，回收DNA，即為細胞核DNA和細胞器DNA；

④純度測定：經(jīng)過純度的測定，DNA溶液中的多糖含量也急劇減少，溶液不再粘稠，A260/280的值在1.7-1.9左右；

（4）利用熒光定量技術(shù)檢測細胞核和細胞器DNA中不同DNA成分的含量

為了進一步驗證細胞器DNA降低的效果，我們先根據(jù)已知的數(shù)據(jù)庫，選取核、質(zhì)體、線粒體上的單拷貝基因，然后根據(jù)Primer5設計引物，構(gòu)建標準質(zhì)粒，繪制標準曲線；同時用CTAB法提取了正常培養(yǎng)的材料的DNA作為對照；以紫菜為例，選取了脂氧合酶（5'CAGGACAAGGAGTCGGAGGA3'，5'CAGAGCCAATGCGAAAGG3'）、rbcL（5'GCAAGAAATGAAGGTCGT3'，5'TCAGCTGTGTCTGTGGAA3'）和cob（5'ACCAATGATTCCGATAAG3'，5'GAGGTGTCCGTCGTAAAG3'）基因，擴增效率分別為91%、97%、95%；

①用Nanodrop2000定量，然后把這三種DNA按照梯度進行稀釋，并用稀釋的DNA進行熒光定量實驗，按照(gE(gCt))/(cpE(cpCt))或(gE(gCt))/(mtE(mtCt))和([{#cpDNA的拷貝數(shù)}/倍性*質(zhì)體基因組的大小]/1C基因組大小)*100公式來計算核基因、質(zhì)體基因、線粒體基因的比例；

②根據(jù)絕對定量的結(jié)果，我們可以看到在用CTAB法提取的總DNA中，核DNA只占21%，質(zhì)體的比例為76%，線粒體的比例為3%；而在用脈沖分離的核DNA中，核DNA的比例增加到了71%，質(zhì)體的比例22.7%，線粒體的比例為6.3%；細胞器DNA的條帶中，質(zhì)體的比例增加到了87.9%，線粒體增加到6.7%，核DNA的比例為5.4%；

（5）利用高通量測序技術(shù)檢測質(zhì)體和線粒體DNA在總DNA和核DNA中的含量

為了進一步確證細胞器DNA減少的效果，將用CTAB法提取的DNA和脈沖分離法提取的DNA構(gòu)建基因組文庫，利用高通量測序進行進一步驗證。用脈沖場電泳分離的總DNA中，核DNA的比例也高達81%；

上述驗證試驗結(jié)果表明，通過本發(fā)明技術(shù)方案，可以很好的分離細胞DNA和細胞器DNA。