本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種RNA反義純化方法。

背景技術(shù)：

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是長達(dá)兩百個核苷酸以上的轉(zhuǎn)錄本，絕大多數(shù)位于細(xì)胞核內(nèi)。雖然lncRNA沒有編碼任何蛋白質(zhì)，但它們在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)依然具有特異性，這說明lncRNA具有重要的生物學(xué)意義。在測序技術(shù)的幫助下，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種lncRNA，但這些lncRNA的生物學(xué)功能依然還是個謎。

2013年，Jesse M.Engreitz教授開發(fā)了RNA反義純化(RNAantisensePurification，RAP)技術(shù)，該技術(shù)可以在轉(zhuǎn)錄后水平鑒定RNA與RNA及相關(guān)DNA和蛋白質(zhì)的互作。其原理如下：首先用紫外交聯(lián)固定細(xì)胞，以維持如lncRNA等調(diào)控RNA與RNA、RBP的相互作用，然后進(jìn)行細(xì)胞裂解，接著用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針組與靶l(wèi)ncRNA雜交，基于生物素和鏈霉親和素相互作用的原理，用鏈霉親和素磁珠來分離、純化探針-基因或蛋白質(zhì)復(fù)合體，最后從純化的復(fù)合體中分離蛋白質(zhì)或RNA，以進(jìn)行下游的分析。

RAP技術(shù)被不同領(lǐng)域的研究者們廣泛采用。如Engreitz J M等(2013)利用RAP技術(shù)通過研究LncRNA Xist成功地闡釋了Xist使X染色體失活的作用機(jī)理(Engreitz J M,Pandyajones A,Mcdonel P,et al.The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome[J].Science,2013,341(6147):L35-L38.)。隨著人們進(jìn)一步認(rèn)識非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮的重要作用，研究者對RAP技術(shù)進(jìn)行不斷的完善，旨在闡明lncRNA在機(jī)體內(nèi)與內(nèi)源性RNA、蛋白質(zhì)的互作關(guān)系。2014年，Engreitz J M及其同事們運(yùn)用RAP技術(shù)研究了核內(nèi)小RNA U1和lncRNA Malat1與前體mRNA互作的作用機(jī)理。通過使用不同交聯(lián)試劑及交聯(lián)條件，改進(jìn)的RAP技術(shù)能夠進(jìn)一步研究體內(nèi)RNA-RNA互作關(guān)系及RNA在染色體上的定位及參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Engreitz J,Sirokman K,Mcdonel P,et al.RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites[J].Cell,2014,159(1):188-99.)。

然而，現(xiàn)有RAP技術(shù)因磁珠會吸附非特異性的核酸及蛋白質(zhì)、探針組與RNA雜交的效率不高、核酸及蛋白質(zhì)等產(chǎn)品回收效率不高等問題而存在特異性低、靈敏度不佳的缺點(diǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種RNA反義純化方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種RNA反義純化方法，包含以下步驟：

S1、細(xì)胞的交聯(lián)、裂解及基因組DNA的消化，得到RNA樣品；

S2、探針組溶液的制備：將生物素標(biāo)記的各探針溶解后混合，于85℃變性3min，快速轉(zhuǎn)移冰浴，得到探針組溶液；

S3、磁珠預(yù)處理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸隨機(jī)引物封閉鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠；

S4、探針組-磁珠復(fù)合物的制備：將探針組溶液加入到預(yù)處理后的磁珠中，得到探針組-磁珠復(fù)合物；

S5、反義純化：向RNA樣品中加入探針組-磁珠復(fù)合物，65℃變性10min，37℃、42℃和45℃各洗滌2次，每次洗滌5min，得到RNA-探針組-磁珠復(fù)合物；

S6、RNA的洗脫：將RNA-探針組-磁珠復(fù)合物加入RNA ElutionBuffer混勻，95℃加熱2min，收集上清，向上清中加入Proteinase K Buffer和Proteinase K，溫育消化得到洗脫后的RNA；

S7、RNA的純化：向洗脫后的RNA中加入等洗脫體積的苯酚-氯仿-異戊醇混合液混勻，離心收集上層水相，向水相中加入5M NaCl溶液、glycogen和無水乙醇，混勻后-80℃沉淀1～16h，離心棄上清，加入預(yù)冷的80％乙醇，離心棄上清，室溫靜置風(fēng)干，加入無RNase水，65℃溫育15min。

優(yōu)選地，步驟S1中取約1×10⁸個細(xì)胞，去除培養(yǎng)基后用PBS洗滌一次，進(jìn)行紫外交聯(lián)，向交聯(lián)后細(xì)胞中加入15ml預(yù)冷的PBS并短暫置于冰上，收集細(xì)胞，4℃400g離心3min收集細(xì)胞沉淀；向細(xì)胞沉淀中加入1.4ml預(yù)冷的Lysis Buffer、5μl RNase Inhibitor，充分吹打裂解，抽動混勻3次，冰浴靜置裂解10min，向裂解液中加入4.8μl DNase Salt Stock、15μl DNase，37℃溫育10min；轉(zhuǎn)移樣品到冰浴環(huán)境，快速加入20μl 0.5M EDTA、10μl 0.5M EGTA、5μl 1M DTT并充分混勻；加入等體積2×Hybridization Buffer，充分混勻后冰上靜置10min；4℃16000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新無RNase離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)選地，步驟S2中每條探針用1×TES配制成100倍nmol的探針溶液，將所有探針溶液混合，取5μl混合液變性處理。

優(yōu)選地，步驟S3磁珠預(yù)處理的方法為：用1ml 10mM Tris-HCl pH7.5重懸磁珠，顛倒混勻后磁力架上收集磁珠去上清，再重復(fù)洗滌2次；用1ml1×Hybridization Buffer重懸磁珠，顛倒混勻后磁力架上收集磁珠去上清；再向磁珠中加入1ml含BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物的1×TES，室溫孵育30min后去除TES溶液。

優(yōu)選地，步驟S3中TES中BSA的濃度為0.05～0.5wt％，寡核苷酸隨機(jī)引物的濃度為10～20μmol/L。

優(yōu)選地，步驟S3中寡核苷酸隨機(jī)引物為20bp以內(nèi)的DNA序列。

優(yōu)選地，步驟S4制備探針-磁珠復(fù)合物的方法為：將探針組溶液加入預(yù)處理后的磁珠中，并加入100μl 2×TES，25℃溫和旋轉(zhuǎn)混合30min，磁力架上收集磁珠去上清；用0.35ml 1×TES洗滌磁珠兩次，去除TES。

優(yōu)選地，步驟S5中向RNA樣品中加入探針組-磁珠復(fù)合物，65℃溫育變性10min，用含0.5mM PMSF的Wash Buffer 37℃、42℃、45℃各洗滌2次，每次洗滌5min并磁力架上靜置1min收集磁珠棄上清；用500μl Wash Buffer懸浮磁珠，35℃搖動洗滌2～4min，磁力架上收集磁珠并去上清，并重復(fù)洗滌3～6次，得到RNA-探針組-磁珠復(fù)合物。

優(yōu)選地，步驟S6中向RNA-探針組-磁珠復(fù)合物中加入50μl RNA Elution Buffer充分混勻后，95℃加熱2min，磁力架上收集磁珠并轉(zhuǎn)移上清至新無RNase離心管中，重復(fù)上述步驟一次；再向上清中加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg Proteinase K，50℃溫育消化1h。

優(yōu)選地，步驟S7中RNA的純化方法為：向洗脫后的RNA樣品中加入等洗脫體積的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，顛倒混勻15s；13000g 4℃離心10min，收集上層水相，轉(zhuǎn)移到新無RNA酶離心管中；向水相中加入20μl 5M NaCl、2μl Glycogen、600μl無水乙醇，充分顛倒混勻后-80℃沉淀1～16h；4℃16100g離心30min，棄上清；加入1ml預(yù)冷的80％乙醇，4℃16100g離心10min，棄上清；室溫靜置風(fēng)干10min；加入20～30μl RNase-free water，65℃溫育15min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

①本發(fā)明通過預(yù)先使用BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物封閉磁珠，降低了磁珠的非特異性吸附。BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物的大小正合適，既能封閉磁珠增強(qiáng)實驗的特異性，又不會過大而影響探針與RNA的結(jié)合。

②本發(fā)明中磁珠首先與探針孵育，去除多余探針后再與RNA孵育，過量探針封閉鏈霉親和素與蛋白質(zhì)、核酸等的非特異性結(jié)合，提高檢測特異性，靈敏度高；雜交后經(jīng)梯度溫度多次洗滌，保證磁珠充分結(jié)合探針并結(jié)合目標(biāo)RNA，提高雜交效率。

附圖說明

圖1為實施例1中純化RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為Maker，泳道2為純化后的RNA樣品。

圖2為實施例1中檢測miRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖a為本發(fā)明結(jié)果圖，圖b為對比例1實驗結(jié)果圖，圖c為對比例2實驗結(jié)果圖。泳道1為Maker，泳道2為input組(10％)；泳道3為實驗組；泳道4為NC組。

圖3為實施例2中純化RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為Maker，泳道2為純化后的RNA樣品。

圖4為實施例2中檢測lincRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖a為本發(fā)明結(jié)果圖，圖b為對比例1實驗結(jié)果圖，圖c為對比例2實驗結(jié)果圖。泳道1為Maker，泳道2為input組(10％)；泳道3為實驗組；泳道4為NC組。

具體實施方式

為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實施方式做進(jìn)一步說明。本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。

實施例1

CTNNB1為編碼catenin beta 1蛋白的mRNA，物種為人類。針對CTNNB1 mRNA開展RAP實驗，靶基因為hsa-miR-214。探針的設(shè)計和用生物素標(biāo)記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在此不再贅述。鏈霉親和素偶聯(lián)在磁珠(BeaverBeads^TM Streptavidin，海貍生物科技有限公司)上，并和脫硫生物素親和結(jié)合；RNA與磁珠-RNA探針孵育，經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合RNA等去除；最后，再用洗脫液(針對鏈霉親和素)進(jìn)行洗脫，純化后可以驗證RNA類型。具體步驟如下：

S1、細(xì)胞的交聯(lián)、裂解及基因組DNA的消化，得到RNA樣品

S11、培養(yǎng)和收集細(xì)胞

本實施例中使用cCL-RAP細(xì)胞培養(yǎng)或PAR-CL細(xì)胞培養(yǎng)方式。采用15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，cCL-RAP細(xì)胞的培養(yǎng)使用含10v/v％FCS DMEM，PAR-CL細(xì)胞的培養(yǎng)使用含100μM 4SU及10v/v％FCS DMEM。培養(yǎng)結(jié)束時每皿約2×10⁷個細(xì)胞，每次實驗需要5皿細(xì)胞，共計約1×10⁸個細(xì)胞。

S12、交聯(lián)細(xì)胞

去除培養(yǎng)基后，向培養(yǎng)皿中加入0.3ml PBS，搖動洗滌一次后，充分去除殘余PBS并將培養(yǎng)皿置于冰上；將培養(yǎng)皿置于紫外燈10～15cm距離，0.15J cm²254nm UV交聯(lián)約1min(cCL)，或者365nm UV交聯(lián)約1min(4SU-labeled，PAR-CL)。交聯(lián)結(jié)束后，盡快向培養(yǎng)皿中加入15ml預(yù)冷的PBS并短暫靜置于冰上；用細(xì)胞刮收集細(xì)胞；4℃400g離心3min收集細(xì)胞沉淀，去除上清。

S13、裂解細(xì)胞

向細(xì)胞沉淀中加入1.4ml預(yù)冷的Lysis buffer、5μl RNase Inhibitor，并充分吹打充分裂解；使用0.4mm針頭口徑注射器，抽動混勻3次，冰浴靜置裂解10min；裂解樣品立即使用或-80℃保存一周內(nèi)使用。

S14、消化基因組DNA

向細(xì)胞裂解液中添加4.8μl 1×DNase salt stock、15μl DNase(20U)，37℃溫育10min；轉(zhuǎn)移樣品到冰浴環(huán)境，快速加入20μl 0.5M EDTA、10μl 0.5M EGTA、5μl 1M DTT并充分混勻；將細(xì)胞裂解液按0.5ml、0.5ml、0.2ml及0.05ml分為四管，分別為標(biāo)示實驗組1樣品、實驗組2樣品(平行試驗)、NC組樣品和input組樣品；向NC組和各實驗組樣品中分別加入等體積2×Hybridization Buffer，充分混勻后冰上靜置10min；4℃16,000g離心10min轉(zhuǎn)移上清至新無RNase離心管中；NC組、input組和各實驗組樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

S2、探針組溶液的制備：將生物素標(biāo)記的各探針溶解后混合，于85℃變性3min，快速轉(zhuǎn)移冰浴，得到探針組溶液。本實施例中，實驗組的探針組含有8條探針，NC組的探針組含有3條探針。具體序列如表1和表2所示。

表1、實驗組用探針序列

表2、NC組用探針序列

以實驗組為例說明探針組溶液的制備：向各條探針中加入100倍nmol數(shù)μl的1×TE，假如探針為1nmol的粉末，則加入100μl的TE，充分渦旋混勻后微離心后，都轉(zhuǎn)移到同一離心管中，加入1×TE調(diào)整每條探針濃度為10pmol/μl，得到探針混合液；取5μl探針混合液，其中每條探針含量為50pmol，探針總量為n×50pmol，n為探針數(shù)目；85℃變性3min后，快速轉(zhuǎn)移冰浴，得到實驗組用探針組溶液。采用相同的方法可以制備NC組用探針組溶液。

S3、磁珠預(yù)處理：使用BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物封閉鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。

磁珠濃度為400pmol/100μl，每1pmol探針需要1pmol磁珠，按n(探針數(shù)目)×100μl/(400pmol/50pmol)鏈霉親和素磁珠標(biāo)準(zhǔn)，為實驗組準(zhǔn)備磁珠，磁力架上收集磁珠并去上清；加入1ml 10mM Tris-HCl pH 7.5充分重懸后，顛倒混勻10次，磁力架上收集磁珠并去上清，重復(fù)洗滌2次；加入1ml 1×Hybridization Buffer充分重懸后，顛倒混勻10次，磁力架收集磁珠并去上清。向磁珠加入1ml含0.05～0.5wt％BSA和10～20μmol/L寡核苷酸隨機(jī)引物的1×TES，室溫孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。采用相同的方法可以制備NC組用磁珠。

S4、探針組-磁珠復(fù)合物的制備：將探針組溶液加入到預(yù)處理后的磁珠中，得到探針組-磁珠復(fù)合物。

將制備的實驗組探針組溶液加入實驗組用預(yù)處理后的磁珠中，并加入100μl 2×TES，25℃旋轉(zhuǎn)溫和混合30min，磁力架上收集磁珠并去上清，加入0.35ml 1×TES，溫和旋轉(zhuǎn)洗滌磁珠，置于磁力架上去除洗滌液，重復(fù)洗滌一次，得到實驗組用探針組-磁珠復(fù)合物。采用相同的方法制備NC組用探針組-磁珠復(fù)合物。

S5、反義純化

實驗組樣品中加入準(zhǔn)備的實驗組用探針組-磁珠復(fù)合物；垂直混勻器上65℃溫育變性10min，37℃孵育雜交180min，37℃洗滌2次、42℃洗滌2次、45℃洗滌2次，每次垂直混勻器搖動洗滌5min，洗滌用Wash Buffer，在使用前預(yù)熱到相應(yīng)洗滌溫度并加入0.5mM PMSF，洗滌后在磁力架上靜置1min收集磁珠棄上清；最后一次洗滌后加入500μl Wash Buffer懸浮磁珠，35℃搖動洗滌2～4min后磁力架上收集磁珠并去上清，并重復(fù)3～6次，得到實驗組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物。采用相同的方法制備NC組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物。

S6、RNA的洗脫

實驗組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物樣品磁珠加入50μl RNA Elution Buffer充分混勻后，95℃加熱2min；磁力架收集磁珠并轉(zhuǎn)移上清至新無RNase離心管中，重復(fù)上述步驟一次；加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg Proteinase K，50℃溫育消化1h，得到實驗組用洗脫后的RNA樣品。采用相同的方法洗脫NC組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物，得到NC組用洗脫后的RNA樣品。

向input組樣品中加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg Proteinase K、50μl RNA Elution Buffer，50℃溫育消化1h，得到input組用RNA樣品。

S7、RNA的純化

向?qū)嶒灲M用洗脫后的RNA樣品中加入等洗脫體積的(125μl)苯酚-氯仿-異戊醇混合液，顛倒混勻15s；13000g 4℃離心10min，收集上層水相并轉(zhuǎn)移到新無RNA酶離心管中；加入20μl 5M NaCl、2μl Glycogen、600μl無水乙醇，充分顛倒混勻后-80℃沉淀1～16h；4℃16100g離心30min，棄上清；加入1ml預(yù)冷的80％乙醇，4℃16100g離心10min，棄上清；室溫靜置風(fēng)干10min；加入20～30μl RNase-free water，冰上靜置保存；65℃溫育15min，充分溶解RNA及去除殘余DNA酶活性，得到純化后的實驗組樣品。采用相同的方法處理NC組用洗脫后的RNA樣品和input組用RNA樣品，分別得到純化后的NC組樣品和input組樣品。

對純化后的RNA樣品進(jìn)行了miRNA檢測，具體方法如下。取5μl RNA樣品開展1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA富集效果，結(jié)果顯示檢測到明顯的RNA富集(如圖1)。取2μl RNA樣品Agilent 2100檢測RNA濃度及片段大小范圍，檢測結(jié)果顯示富集得到的RNA濃度為6.9ng/μl，大小范圍為200～700bp，均在正常范圍之內(nèi)。取2μl RNA樣品nanodrop檢測RNA純度及濃度，結(jié)果顯示其純度為：OD260/280為1.91，濃度為8.9ng/μl，兩次檢測結(jié)果相近，說明已成功完成RNA的富集及純化。

為了更好的說明本發(fā)明的效果，發(fā)明人還進(jìn)行了兩組對照，對照組1采用傳統(tǒng)方法(Jesse Engreitz.RNA Antisense Purification(RAP):Experimental Protocols.2014.)檢測has-MiR-214基因；對照組2采用本發(fā)明RAP試劑盒檢測內(nèi)參U6基因。

使用QiagenmiScript Reverse Transcription Kit(218061)逆轉(zhuǎn)錄RNA樣品，具體方法參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書；參考2×Taq PCR試劑盒說明書配置20μl PCR擴(kuò)增體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5～10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物開展瓊脂糖凝膠電泳(2％～3％)，結(jié)果如圖2所示。靶基因hsa-miR-214擴(kuò)增片段長度為約90bp(圖2a)，與對照組1(圖2b)的結(jié)果相比，均處于正確范圍，但比傳統(tǒng)方法有更好的濃度和純度。F引物序列為ACAGCAGGCACAGACAGGCAG(SEQ ID NO：12)，R引物為試劑盒自帶引物。對照組2(圖2c)中U6擴(kuò)增片段長度為94bp，F(xiàn)引物序列為：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO：13)；R引物序列為：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO：14)。

實施例2

SENP1為編碼SUMO1/sentrin specific peptidase 1蛋白的mRNA，物種為人類。針對SENP1mRNA開展RAP實驗，靶基因為lincRNA-p21。

S1、細(xì)胞的交聯(lián)、裂解及基因組DNA的消化，得到RNA樣品。具體方法與實施例1相同。

S2、探針組溶液的制備：除實驗組用探針組的序列不同外，本實施例中探針組溶液制備的具體方法與實施例1相同。

本實施例中，實驗組的探針組含有10條探針，NC組的探針組含有3條探針(與實施例1相同)。具體序列如表3所示。

表1、實驗組用探針序列

S3、磁珠預(yù)處理：與實施例1相同。

S4、探針組-磁珠復(fù)合物的制備：與實施例1相同。

S5、反義純化：與實施例1相同。

S6、RNA的洗脫：與實施例1相同。S7、RNA的純化：與實施例1相同。

為了更好的說明本發(fā)明的效果，發(fā)明人還進(jìn)行了兩組對照，對照組1采用傳統(tǒng)方法(Jesse Engreitz.RNA Antisense Purification(RAP):Experimental Protocols.2014.)檢測lincRNA-p21基因；對照組2采用本發(fā)明RAP試劑盒檢測GAPDH基因。

對純化后的RNA樣品進(jìn)行了lincRNA檢測，具體方法如下。取5μl RNA樣品開展1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA富集效果，結(jié)果顯示檢測到明顯的RNA富集(結(jié)果如圖3所示)；取2μl RNA樣品Agilent 2100檢測RNA濃度及片段大小范圍，檢測結(jié)果顯示富集得到的RNA濃度為8.9ng/μl，大小范圍為500～3000bp均在正常范圍之內(nèi)；取2μl RNA樣品nanodrop檢測RNA純度及濃度，結(jié)果顯示其純度為：OD260/280為1.94，濃度為10.2ng/μl，兩次檢測結(jié)果均證明已成功完成RNA的富集及純化。

使用(TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(D6210A))逆轉(zhuǎn)錄RNA樣品，具體方法參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書；參考2×Taq PCR試劑盒說明書配置20μl PCR擴(kuò)增體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5～10μl擴(kuò)增產(chǎn)物開展瓊脂糖凝膠電泳(2％～3％)，結(jié)果如圖4所示。靶基因lincRNA-p21擴(kuò)增片段長度為156bp(圖4a)，與傳統(tǒng)方法(圖4b)的相比，結(jié)果均處于正確范圍，但比傳統(tǒng)方法有更加清晰的條帶，濃度和純度更佳，引物序列為：F為TGCAGAGCGTTTTGTTTGTC(SEQ ID NO：25)；R為CAGCCTCTGGGAAGAAAATG(SEQ ID NO：26)。對照GAPDH擴(kuò)增片段長度為189bp(圖4c)，引物序列為：F為CGGCTACTAGCGGTTTTACG(SEQ ID NO：27)；R為AAGAAGATGCGGCTGACTGT(SEQ ID NO：28)。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序列表

<110>廣州伯信生物科技有限公司

<120>一種RNA反義純化方法

<160>28

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>71

<213>人工合成

<400>1

ccatcaaatc agcttgagta gccattgtcc acgctggatt ttcaaaacag ttgtatggta 60

tacttcaaat a 71

<210>2

<211>68

<213>人工合成

<400>2

tttcagcatc tgtgatggtt cagccaaacg ctggacatta gtgggatgag cagcatcaaa 60

ctgtgtag 68

<210>3

<211>67

<213>人工合成

<400>3

gccataagct aaaatttgaa ggcagtctgt cgtaatagcc aagaatttaa catttgtttt 60

gttgagc 67

<210>4

<211>69

<213>人工合成

<400>4

gaagctgaac aagagtccca aggagacctt ccatcccttc ctgtttagtt gcagcatctg 60

aaagattcc 69

<210>5

<211>67

<213>人工合成

<400>5

gttttcaatg ggagaataaa gcagctgcac aaacaatgga atggtattta gtcctctgat 60

aacaatt 67

<210>6

<211>70

<213>人工合成

<400>6

gatatccaag gggttctccc tgggcaccaa tatcaagtcc aagatcagca gtctcattcc 60

aagccattgg 70

<210>7

<211>69

<213>人工合成

<400>7

gatccattct tgtgcattct tcacttcttg agtcactccc aaaatccatt tgtattgtta 60

ctcctcgac 69

<210>8

<211>67

<213>人工合成

<400>8

aaactgtcca aaacaaggtt ccaaataaca cctcttactg atttacccta cccatacata 60

tcccaaa 67

<210>9

<211>68

<213>人工合成

<400>9

caaacggcgg attgaccgta atgggatagg tcacgttggt gtagatgggc gcatcgtaac 60

cgtgcatc 68

<210>10

<211>67

<213>人工合成

<400>10

caccacatac aggccgtagc ggtcgcacag cgtgtaccac agcggatggt tcggataatg 60

cgaacag 67

<210>11

<211>67

<213>人工合成

<400>11

ccaatccgcg ccggatgcgg tgtatcgctc gccacttcaa catcaacggt aatcgccatt 60

tgaccac 67

<210>12

<211>21

<213>人工合成

<400>12

acagcaggca cagacaggca g 21

<210>13

<211>17

<213>人工合成

<400>13

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210>14

<211>20

<213>人工合成

<400>14

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210>15

<211>67

<213>人工合成

<400>15

tttctgatgg tggcactagc gatatcacat ctcagggaga taccacagag taggagagtt 60

ggagaaa 67

<210>16

<211>70

<213>人工合成

<400>16

gtgagtcttt caaagtattt ttactggaac taagacatcg agacaggtgt aaaggaaaat 60

gtgtggtggg 70

<210>17

<211>68

<213>人工合成

<400>17

aagtagaact gggagttgga gtctgggaat ctttcacttt cagtaaaatc acagagtctg 60

atccttca 68

<210>18

<211>67

<213>人工合成

<400>18

aagcccttct ctttacttcg ctccatcagc atattcatgt agaaattgat gatctcatca 60

ttgagcc 67

<210>19

<211>71

<213>人工合成

<400>19

agagtattct gcaggcttca ttgtttatcc cacccatgga gtcgtaatag gtaatattct 60

tctttctaaa g 71

<210>20

<211>67

<213>人工合成

<400>20

tagacaacaa agagctggtc ccccacatgg tcaaggtctg ctaagtgaga cagtcttcac 60

aagagtt 67

<210>21

<211>68

<213>人工合成

<400>21

ctggtggttt ttatccctac cttttgccca tgccctttcc tacttcttag taaggcctaa 60

caacaaga 68

<210>22

<211>69

<213>人工合成

<400>22

aaacacccta ctcatagggg ctgggatctc tgtgtgctgg aatttggaaa atggaaataa 60

atctacagg 69

<210>23

<211>71

<213>人工合成

<400>23

actaaacgag cttgtataaa acagtaaaat tttcaaataa gcccagggaa aaagcacaat 60

gctggaaaga a 71

<210>24

<211>68

<213>人工合成

<400>24

cacctttcaa gttgttgctt acatacagta aataccaaga accagacaat attccaggag 60

tcctgcaa 68

<210>25

<211>20

<213>人工合成

<400>25

tgcagagcgt tttgtttgtc 20

<210>26

<211>20

<213>人工合成

<400>26

cagcctctgg gaagaaaatg 20

<210>27

<211>20

<213>人工合成

<400>27

cggctactag cggttttacg 20

<210>28

<211>20

<213>人工合成

<400>28

aagaagatgc ggctgactgt 20