本發(fā)明涉及基因擴增技術(shù)，尤其涉及一種人類線粒體的全基因組擴增方法。
背景技術(shù)：
：線粒體DNA(mtDNA)是細胞的第二套遺傳物質(zhì)。人類的mtDNA共16569個核苷酸，呈雙鏈環(huán)狀，其中有37個基因，編碼13種蛋白質(zhì)。mtDNA突變率高于核DNA，并且缺乏修復(fù)能力。mtDNA突變會引起一系列遺傳病，例如Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON)、肌陣攣性癲癇伴碎紅肌纖維病(MERRF)等。通過選擇合適的引物，對線粒體基因組全環(huán)進行擴增和測序，以尋找可能的致病性mtDNA突變。選用多對引物對線粒體基因組全環(huán)進行擴增的技術(shù)存在以下缺陷：首先，核基因組中存在線粒體假基因，若引物擴增區(qū)域較短，引物極易與核基因組DNA結(jié)合，造成非特異擴增，實驗結(jié)果無法排除假基因的干擾；其次，部分遺傳病是由mtDNA大片段重復(fù)或缺失造成的，若選用多對引物擴增，得到的數(shù)個DNA片段無法進行重復(fù)或缺失的分析，無法準(zhǔn)確輔助診斷病因。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，為了覆蓋mtDNA全長，準(zhǔn)確讀取變異信息，并有效排除假基因的干擾，本發(fā)明提供一種人類線粒體的全基因組擴增方法，使用一對引物代替多對引物對mtDNA全環(huán)進行擴增。本發(fā)明的目的是通過以下方案實現(xiàn)：一種用于人類線粒體的全基因組擴增的引物對，所述引物對如下：mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG。本發(fā)明的另一方面為一種人類線粒體的全基因組擴增方法，采用上述引物對，以人全基因DNA為模板，進行PCR擴增,產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選地，所述PCR擴增時，PCR反應(yīng)體系為：優(yōu)選地，所述PCR擴增時，退火溫度為68-69℃。優(yōu)選地，所述PCR擴增時，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1分鐘；98℃變性10秒，68℃退火延伸16分鐘，45個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。優(yōu)選地，所述瓊脂糖凝膠為1.2％瓊脂糖凝膠。優(yōu)選地，所述人全基因DNA采用如下步驟提?。?1)分裝400μL紅細胞裂解液到1.5mL離心管，加入200μL全血，混勻；56℃孵育10min；(2)13000g離心1min，棄上清液，加入200μL紅細胞裂解液，混勻后加入10μLProteaseK，混勻；(3)13000g離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中，加入400μL異丙醇，混勻，混勻后可看到DNA沉淀析出；(4)13000g離心1min，棄上清，加入400μL70％乙醇漂洗沉淀；重復(fù)操作一次；(5)開蓋使乙醇完全揮發(fā)，加入100μLDNase/RNase-Free去離子水使沉淀完全溶解。(6)使用分光光度計檢測DNA濃度和純度。優(yōu)選地，所述人全基因DNA提取的步驟(6)中DNA濃度和純度如下表所示：有益效果：mtDNA中存在保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物，即可得到人mtDNA全序列的通用擴增引物。由于mtDNA是環(huán)狀的，根據(jù)mtDNA中的保守序列設(shè)計一對引物，進行長片段PCR擴增，即可得到mtDNA全序列。將使用此引物擴增的PCR產(chǎn)物進行純化后構(gòu)建文庫，使用illumina測序平臺進行測序，得到的序列拼接后與GeneBank中一致，證實為人線粒體環(huán)基因組全序列。本發(fā)明的人類線粒體的全基因組擴增方法相較于分段擴增，采用全環(huán)擴增的方法，優(yōu)勢是檢測點突變的同時，可以發(fā)現(xiàn)線粒體DNA的大片段重復(fù)和缺失。線粒體DNA全基因組的擴增很大程度上依賴引物設(shè)計的優(yōu)良與否，本發(fā)明提供了一種特定引物對，減少了人類線粒體DNA序列測序時大量消耗的引物設(shè)計和優(yōu)化時間，提高了擴增的準(zhǔn)確性及擴增效率。附圖說明圖1是不同樣本使用瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果圖示；A1-B4為八例不同的血液樣本，其中A3和A4樣本患者具有Kearns-Sayre綜合征臨床表現(xiàn)。具體實施方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明進行詳細的解釋。提取人全基因DNA采用如下步驟：(1)分裝400μL紅細胞裂解液(天根生化科技有限公司血液基因組DNA提取試劑盒組分)到1.5mL離心管，加入200μL全血，混勻；56℃孵育10min；(2)13000g離心1min，棄上清液，加入200μL紅細胞裂解液，混勻后加入10μLProteaseK(天根生化科技有限公司)，混勻；(3)13000g離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中，加入400μL異丙醇，混勻，混勻后可看到DNA沉淀析出；(4)13000g離心1min，棄上清，加入400μL70％乙醇漂洗沉淀；重復(fù)操作一次；(5))開蓋使乙醇完全揮發(fā)，加入100μLDNase/RNase-Free去離子水(天根生化科技有限公司)使沉淀完全溶解。(6)使用分光光度計檢測DNA濃度和純度，其記錄結(jié)果如下表所示：一種人類線粒體的全基因組擴增方法，采用的引物對如下：mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG以上述方法提取的人全基因DNA為模板，進行PCR擴增,產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；所述瓊脂糖凝膠為1.2％瓊脂糖凝膠。所述PCR擴增時，PCR反應(yīng)體系為：所述PCR擴增時，PCR反應(yīng)條件為：步驟循環(huán)數(shù)溫度(℃)時間11941minute2459810seconds6816minutes317210minutes414Hold即，所述PCR擴增時，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1分鐘；98℃變性10秒，68℃退火延伸16分鐘，45個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。如圖1所示，mtDNA全長16569bp，圖1中A1左側(cè)為mtDNA標(biāo)準(zhǔn)Maker,A1，A2，B1-4共6例樣本擴增產(chǎn)物均約為16kb，與mtDNA理論片段大小相符。A3和A4樣本擴增產(chǎn)物片段明顯小于16kb，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化，構(gòu)建文庫并使用illumina平臺測序，將測序結(jié)果與GeneBank比對后證實這兩例樣本分別存在9131bp和9546bp缺失，與臨床初步診斷兩位患者患有Kearns-Sayre綜合征相符。約90％的Kearns-Sayre綜合征患者由線粒體DNA缺失突變引起，缺失范圍為1.1-10kb。反應(yīng)時間為16分鐘這是片段長度(16569bp)決定的，改變延伸時間，會導(dǎo)致得到的片段不是正確的結(jié)果。申請人嘗試過改變退火溫度，只有當(dāng)退火溫度為68℃，擴增成功率最高，約為90％；當(dāng)退火溫度為69℃時，擴增成功率約為80％，其他溫度均遠遠低于70％(此處比例不合適，請發(fā)明人根據(jù)實際情況進行修改)，不利于本申請目的的實現(xiàn)。本申請的方法在試驗過程中，根據(jù)不同的保守序列，共設(shè)計3對引物。除本發(fā)明所述引物外，另兩對引物序列如下：hmtF:AACCAAACCCCAAAGACACC；hmtR:TTTATGGGGTGATGTGAGCC。1-mtF:CCTACAAGCCTCAGAGTACTTCGAGTCT；1-mtR:AGATGCCGTCGGAAATGGTGAAGGG。選取多例人基因組DNA樣本，使用設(shè)計的3對引物進行擴增，擴增使用的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與本發(fā)明一致。擴增產(chǎn)物使用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。電泳檢測16000bp左右有明顯條帶，無其他的非特異性擴增片段視為擴增成功。使用hmtF/hmtR引物對擴增成功率約為60％-70％，使用1-mtF/1-mtR引物對擴增成功率低于50％，使用mtDNA-F/mtDNA-R引物對擴增成功率約為90％。因此，申請人選定了mtDNA-F/mtDNA-R引物對作為本申請所述技術(shù)方案的引物對。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護范圍為準(zhǔn)。<110>北京信諾佰世醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司<120>一種人類線粒體的全基因組擴增方法<130>101577<160>6<170>Premierprimer5.0<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1acttttaaccagtgaaattgacctgcc<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2aagagacagctgaaccctcgtgg<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3aaccaaaccccaaagacacc<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tttatggggtgatgtgagcc<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>5cctacaagcctcagagtacttcgagtct<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6agatgccgtcggaaatggtgaaggg當(dāng)前第1頁1 2 3