本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種熒光共振探針及其應(yīng)用和試劑盒。
背景技術(shù)：
：目前，現(xiàn)有的用于檢測微小RNA(miRNA)的方法主要有Northern印跡分析，微點(diǎn)陣分析和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其中，Northern印跡分析是基于雜交檢測RNA的常用方法，它是最早用于微小RNA分析的幾種方法之一。這種方法簡單易行，大部分實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行操作，不需要額外的資金投入與設(shè)備更新。微點(diǎn)陣分析也是基于雜交的原理來檢測微小RNA，它通過測定特定過程中微小RNA的表達(dá)水平，來分析了解微小RNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及由微小RNA調(diào)控的基因的表達(dá)。微點(diǎn)陣分析采用高密度的熒光標(biāo)記探針與RNA樣本雜交，通過熒光掃描獲得表達(dá)圖譜，借助相應(yīng)軟件進(jìn)行miRNA的表達(dá)分析。由于在設(shè)計(jì)探針時(shí)可以包含所有可用miRNA序列，因此微點(diǎn)陣可以作到高通量的miRNA分析。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通過擴(kuò)增技術(shù)，是指在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。起始目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)越高，就越快觀察到熒光強(qiáng)度的顯著增加。但是，上述的現(xiàn)有檢測方法無法清楚的區(qū)分出或者準(zhǔn)確的檢測出堿基序列差異程度很小(例如只有幾個(gè)或一個(gè)堿基的差異程度)的miRNA片段或者是其他類型的RNA片段或DNA片段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種熒光共振探針，該熒光共振探針能夠檢測或區(qū)分出堿基序列差異程度很小(例如只有幾個(gè)或一個(gè)堿基的差異程度)的靶核酸片段，其具有較高的特異性和靈敏度。本發(fā)明的另一目的在于提供上述熒光共振探針在檢測靶核酸片段中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供上述熒光共振探針在制備靶核酸片段檢測試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種包括上述的熒光共振探針的試劑盒。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種熒光共振探針，適于檢測靶核酸片段，其包括第一熒光探針和第二熒光探針，第一熒光探針具有第一結(jié)合區(qū)和第一識(shí)別區(qū)，第二熒光探針具有第二結(jié)合區(qū)和第二識(shí)別區(qū)，第一結(jié)合區(qū)與第二結(jié)合區(qū)反向互補(bǔ)，第一結(jié)合區(qū)的末端標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)，第二結(jié)合區(qū)的末端標(biāo)記有第二熒光基因，第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊，第一識(shí)別區(qū)和第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ)。上述的熒光共振探針在檢測靶核酸片段中的應(yīng)用。上述的熒光共振探針在制備用于試劑盒中的應(yīng)用。一種試劑盒，其包括上述的熒光共振探針。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的提供的熒光共振探針包括第一熒光探針和第二熒光探針。第一熒光探針具有與靶核酸片段的第一靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ)的第一識(shí)別區(qū)，第二熒光探針具有與靶核酸片段的第二靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ)的第二識(shí)別區(qū)。在檢測時(shí)，如果待測樣品中存在靶核酸片段，則第一熒光探針的第一識(shí)別區(qū)和第二熒光探針的第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；同時(shí)，第一結(jié)合區(qū)與和第二結(jié)合區(qū)通過堿基補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。這樣，靶核酸片段、第一熒光探針以及第二熒光探針三者形成一個(gè)T型結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定狀態(tài)的T型結(jié)構(gòu)能夠使得第一熒光探針上的第一熒光基團(tuán)和第二熒光探針上的第二熒光基因的距離變短，該距離能夠保證第一熒光基因和第二熒光基團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。而該T型結(jié)構(gòu)只有在第一識(shí)別區(qū)和第二識(shí)別區(qū)與靶核酸片段的相應(yīng)靶標(biāo)區(qū)的堿基完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的情況下才穩(wěn)定(只要有一個(gè)堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，T型結(jié)構(gòu)都不穩(wěn)定，不能保證發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移)。這樣，通過激發(fā)第一熒光基因則可檢測到第二熒光基因的熒光發(fā)射信號(hào)，再根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基序列差異程度很小的靶核酸片段的檢測目的，以及通過對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的計(jì)算，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸片段的定性或定量檢測。因此，本發(fā)明提供的熒光共振探針基于一種全新的檢測原理，其不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶核酸片段的定性或定量檢測，還能夠?qū)泻怂崞螐臄?shù)量或類型眾多的且堿基序列差異很小的核酸片段中檢測出來，該堿基序列差異可低至只有一個(gè)堿基的差異，具有較高的特異性和靈敏度，并且其可適用于檢測各種類型的DNA和RNA尤其是miRNA，也可適用于制備試劑盒，具有非常廣闊的應(yīng)用前景和市場價(jià)值。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明提供的熒光共振探針的檢測原理示意圖；圖2為本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)例1的熒光光譜檢測結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)例2的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率檢測結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)例3的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率檢測結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對(duì)本發(fā)明提供的一種熒光共振探針及其應(yīng)用和試劑盒進(jìn)行具體說明。一方面，本發(fā)明提供了一種熒光共振探針，其適于檢測核酸片段，其包括第一熒光探針和第二熒光探針。第一熒光探針具有第一結(jié)合區(qū)和第一識(shí)別區(qū)。容易理解到，第一結(jié)合區(qū)和第一識(shí)別區(qū)相連接。第二熒光探針具有第二結(jié)合區(qū)和第二識(shí)別區(qū)。容易理解到，第二結(jié)合區(qū)和第二識(shí)別區(qū)相連接。第一結(jié)合區(qū)與第二結(jié)合區(qū)反向互補(bǔ)，第一結(jié)合區(qū)的末端標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)(也可以理解為第一熒光基因標(biāo)記在第一結(jié)合區(qū)遠(yuǎn)離第一識(shí)別區(qū)的一端)，第二結(jié)合區(qū)的末端標(biāo)記有第二熒光基因(也可以理解為第二熒光基因標(biāo)記在第二結(jié)合區(qū)遠(yuǎn)離第二識(shí)別區(qū)的一端)。第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊。第一識(shí)別區(qū)和第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ)。本發(fā)明提供的熒光共振探針的檢測原理(如圖1所示)大致如下：首先，第一熒光基因和第二熒光基團(tuán)各自均具有激發(fā)光譜和熒光光譜，且第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊。當(dāng)二者的距離足夠靠近時(shí)，用第一熒光基因的激發(fā)光譜的激發(fā)光激發(fā)第一熒光基因，第一熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光可以激發(fā)第二熒光基因產(chǎn)生熒光，則可以檢測到第二熒光基因的熒光發(fā)射信號(hào)，即發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中，第一熒光基因?yàn)闊晒夤舱衲芰抗w，第二熒光基團(tuán)為熒光共振能量受體。而第一熒光基因和第二熒光基因的之間的距離是熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要因素?；谏鲜鲈?，在檢測時(shí)，將第一熒光探針、第二熒光探針以及待測樣品加入到雜交液是進(jìn)行雜交反應(yīng)，如果待測樣品中存在靶核酸片段，則第一熒光探針的第一識(shí)別區(qū)和第二熒光探針的第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合(第一識(shí)別區(qū)和第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ))。同時(shí)，第一結(jié)合區(qū)與和第二結(jié)合區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合(第一結(jié)合區(qū)與第二結(jié)合區(qū)反向互補(bǔ))。這樣，靶核酸片段、第一熒光探針以及第二熒光探針形成一個(gè)T型結(jié)構(gòu)(如圖1所示，圖1中的最右側(cè)為形成的T型結(jié)構(gòu)，箭頭代表熒光共振能量的轉(zhuǎn)移方向)。該T型結(jié)構(gòu)能夠使得第一熒光基團(tuán)和第二熒光基因的距離變短，該距離能夠確保發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。再通過第一熒光基因的激發(fā)波長進(jìn)行激發(fā)則可檢測到第二熒光基因的熒光發(fā)射信號(hào)。以第二熒光基因的熒光信號(hào)和第一熒光信號(hào)的比值作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，該熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的高低與靶核酸片段的濃度大小相關(guān)，靶核酸片段濃度越大，該熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率就最大。因此，通過對(duì)該熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的檢測和計(jì)算就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸片段的定性或定量檢測。而如果待測樣品中不存在靶核酸片段，則第一熒光探針和第二熒光探針只能依賴第一結(jié)合區(qū)與和第二結(jié)合區(qū)通過堿基反向互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成不穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)。但是雙鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在溫度達(dá)到37℃時(shí)會(huì)發(fā)生解離，因此不發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，通過第一熒光基因的激發(fā)波長進(jìn)行激發(fā)則不能檢測到第二熒光基因的熒光信號(hào)，只能檢測到第一熒光基因的熒光發(fā)射信號(hào)，這樣，相應(yīng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率就非常低。本發(fā)明的發(fā)明人通過長期的研究探索發(fā)現(xiàn)，第一熒光探針的第一識(shí)別區(qū)和第二熒光探針的第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)只有在堿基完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的情況下，才能形成穩(wěn)定T型結(jié)構(gòu)，只有形成穩(wěn)定的T型機(jī)構(gòu)，也才能夠確保發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因此，即使待測樣本中存在其他的核酸片段，這種核酸片段與靶核酸片段相似，或者二者的差異僅是幾個(gè)堿基甚至是一個(gè)堿基，這種相似的核酸片段的存在也不會(huì)導(dǎo)致形成穩(wěn)定的T型結(jié)構(gòu)。那么第二熒光基因的熒光發(fā)射信號(hào)就會(huì)很弱甚至是沒有，相應(yīng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率也很低。所以，基于上述的原理，采用本發(fā)明提供的熒光共振探針在進(jìn)行檢測時(shí)，如果待測樣本中存在對(duì)應(yīng)的靶序列，就能夠形成T型結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率；如果沒有對(duì)應(yīng)的靶核酸片段存在，或存在與靶核酸片段相似的其他核酸片段，則具有較低的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。進(jìn)而將靶核酸片段從數(shù)量眾多的且堿基序列差異很小的核酸片段中檢測出來，該堿基序列差異可低至只有一個(gè)堿基的差異，其具有較高的特異性和靈敏度。優(yōu)選地，第一結(jié)合區(qū)的長度為7-9bp。由于第一結(jié)合區(qū)與第二結(jié)合區(qū)反向互補(bǔ)，應(yīng)當(dāng)很容易地理解到，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度一致。本發(fā)明的發(fā)明人通過長期的研究和探索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)的長度低于了7bp的長度時(shí)，二者存在結(jié)合不穩(wěn)定的情況(容易導(dǎo)致假陰性的結(jié)果)，而高于了9bp又存在不能順利解離的情況(容易導(dǎo)致假陽性的結(jié)果)。所以，第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)的長度均控制在7-9bp的范圍，一方面保證二者能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合時(shí)的穩(wěn)定(避免假陰性的結(jié)果)，另一方面也能夠保證在沒有靶核酸片段的情況下，當(dāng)雜交反應(yīng)溫度在37℃的條件下，第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)之間能夠順利地解離開，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。優(yōu)選地，第一識(shí)別區(qū)的長度為10-12bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為10-12bp。第一識(shí)別區(qū)或第二識(shí)別區(qū)的長度一方面可根據(jù)靶核酸片段的長度進(jìn)行設(shè)計(jì)，另一方面要使得所形成的T型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，確保熒光共振能量的轉(zhuǎn)移發(fā)生。現(xiàn)有的miRNA的長度一般為20-24bp，因此，將第一識(shí)別區(qū)的長度控制在10-12bp的范圍，或第二識(shí)別區(qū)的長度控制在10-12bp的范圍內(nèi)，即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)較短的靶核酸片段的檢測目的，同時(shí)保證形成的T型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有利于發(fā)生熒光共振能量的轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，第一熒光基團(tuán)為Cy3，第二熒光基團(tuán)為Cy5；或者，第一熒光基團(tuán)為Cy5，第二熒光基團(tuán)為Cy5.5；或者，第一熒光基團(tuán)為CFP或GFP，第二熒光基團(tuán)為YFP；或者，第一熒光基團(tuán)為Rluc，第二熒光基團(tuán)為QDs-655。Cy3、Cy5、Cy5.5均是具有不同激發(fā)光譜和熒光光譜的花青素?zé)晒馊玖?，其中，Cy3的激發(fā)光譜為530-550nm、熒光光譜為590-650nm；Cy5的激發(fā)光譜為640-660nm，熒光光譜為660-680nm；Cy5.5的激發(fā)光譜為665-685nm，熒光光譜為684-704nm。CFP為青色熒光蛋白，激發(fā)光譜為426-446nm，熒光光譜為490-510nm。GFP為綠色熒光蛋白，激發(fā)光譜為488-508nm，熒光光譜為508-524nm。YFP為黃色熒光蛋白，激發(fā)光譜為490-510nm，熒光光譜為520-550nm。Rluc為熒光素酶(自發(fā)光)，其熒光光譜為470-490nm；QDs-655為納米熒光量子點(diǎn)(任意波長的光均可以激發(fā))，其熒光光譜為645-665nm。采用上述的熒光能量轉(zhuǎn)移供體-受體的配對(duì)方式，能夠提高熒光能量轉(zhuǎn)移效率，易于檢測并提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步地，第一熒光探針的堿基序列如SEQIDNO.1所示，第一熒光基團(tuán)為Cy3，第一熒光基團(tuán)標(biāo)記于第一熒光探針的3’端，第二熒光探針的堿基序列如SEQIDNO.2所示，第二熒光基團(tuán)為Cy5，第二熒光基團(tuán)標(biāo)記于第一熒光探針的5’端。該熒光共振探針可適用于檢測SEQIDNO.3所示的miR208-a，miR208-a即為RNA型的靶核酸片段。其中，第一熒光探針的第1-11位是第一識(shí)別區(qū)(5’-ACAAGCTTTTT-)，其位于第一熒光探針的5’端，可與miR208-a的第12-22位的第一靶標(biāo)區(qū)(-AAAAAGCUUGU-3’)通過堿基反向互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；第一熒光探針的第12-18位是第一結(jié)合區(qū)(-TTTGATC-3’)，其位于第一熒光探針的3’端；第一熒光基因Cy3標(biāo)記在第一結(jié)合區(qū)的末端即第一熒光探針的3’端。其中，第二熒光探針的第8-18位是第二識(shí)別區(qū)(-GCTCGTCTTAT-3’)，其位于第二熒光探針的3’端，可與miR208-a的第1-11位的第二靶標(biāo)區(qū)(5’-AUAAGACGAGC-)通過堿基反向互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；第二熒光探針的第1-7位是第二結(jié)合區(qū)(5’-GATCAAA-)，其位于第二熒光探針的5’端；第二熒光基因Cy5標(biāo)記在第二結(jié)合區(qū)的末端即第二熒光探針的5’端?；谇笆龅臋z測原理，在檢測時(shí)，SEQIDNO.1所示的第一熒光探針和SEQIDNO.2所示的第二熒光探針與SEQIDNO.3所示的miR208-a可形成穩(wěn)定的T型結(jié)構(gòu)(如圖1所示)。如果待測樣品存在靶核酸片段miR208-a，則可以檢測到較強(qiáng)的第二熒光基因Cy5的熒光發(fā)射信號(hào)，如果待測樣品不存在靶核酸片段miR208-a或者存在于miR208-a序列相似的其他核酸片段，則檢測不到第二熒光基因Cy5的熒光發(fā)射信號(hào)。通過對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的計(jì)算結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)對(duì)miR208-a高特異性和高靈敏度的檢測目的。在此，需要說明的，對(duì)于第一熒光探針的第一識(shí)別區(qū)和第二熒光探針的第二識(shí)別區(qū)的具體堿基序列，設(shè)計(jì)者或使用者均可以根據(jù)所要檢測的靶核酸片段的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。同樣，第一熒光探針的第一結(jié)合區(qū)和第二熒光探針的結(jié)合區(qū)的堿基序列也可以根據(jù)實(shí)際情況自進(jìn)行設(shè)計(jì)。只要是其所設(shè)計(jì)出的堿基序列，使得第一熒光探針和第二熒光探針可與靶核酸片段形成前述的T型結(jié)構(gòu)，用于確保熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，根據(jù)熒光能量的轉(zhuǎn)移效率來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸片段的定性或定量檢測即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另一方面，本發(fā)明還提供了前述的熒光共振探針在檢測靶核酸片段中的應(yīng)用。進(jìn)一步，靶核酸片段為miRNA。當(dāng)然，靶核酸片段也可是其他類型的RNA片段例如mRNA、siRNA等RNA片段，還可以是任何類型的DNA片段。只要是用于核酸片段，即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。進(jìn)一步地，該應(yīng)用包括：將熒光共振探針的第一熒光探針和第二熒光探針加入至雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交液含有鎂離子。鎂離子的濃度優(yōu)選為49-51mM。應(yīng)當(dāng)容易理解：雜交液中加入有待測樣本。另外，待測樣本可以是RNA，也可以是DNA；待測樣本可能含有靶核酸片段、也可能不含有核酸片段。更優(yōu)選地，雜交液包括：濃度為49-51mM的Tris-HCl和濃度為49-51mM的MgCl2；雜交液的pH為7.3-7.5。優(yōu)選地，進(jìn)行雜交反應(yīng)的條件是：時(shí)間29-31min，溫度37-39℃。在待測樣本含有靶核酸片段的情況下，上述的雜交液為靶核酸片段、第一熒光探針以及第二熒光探針提供了一個(gè)適宜的雜交反應(yīng)環(huán)境。在該反應(yīng)環(huán)境中，靶核酸片段、第一熒光探針以及第二熒光探針相互之間的配對(duì)結(jié)合能夠快速準(zhǔn)確地完成，配對(duì)效率高，縮短了雜交反應(yīng)的時(shí)間，僅需半個(gè)小時(shí)即可完成反應(yīng)，用于后續(xù)檢測。目前，現(xiàn)有最好的技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該方法操作復(fù)雜，需要酶的參與，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高。相對(duì)于該技術(shù)，利用本發(fā)明提供的熒光共振探針在檢測靶核酸片段的過程中只需要一步雜交過程，節(jié)約了工作強(qiáng)度，且操作簡單、快捷；雜交反應(yīng)僅需半小時(shí)就可以完成，耗時(shí)短；整個(gè)雜交反應(yīng)體系中不需要酶的參與，成本低(雜交液的成分組成簡單僅包括Tris-HCl、MgCl2)。另一方面，本發(fā)明還提供了前述的熒光共振探針在制備用于檢測靶核酸片段的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的熒光共振探針可以應(yīng)用到制備用于檢測核酸片段的試劑盒的領(lǐng)域中，所制得的試劑盒具有操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，成本低、耗時(shí)短、特異性好和靈敏高等特點(diǎn)。進(jìn)一步地，靶核酸片段為miRNA。當(dāng)然，靶核酸片段也可是其他類型的RNA片段例如mRNA、siRNA等RNA片段，還可以是任何類型的DNA片段。只要是用于核酸片段的檢測，即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括任一項(xiàng)前述的熒光共振探針。該試劑盒可用于檢測靶核酸片段，具有操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，成本低、耗時(shí)短、特異性好和靈敏高等特點(diǎn)。綜上，本發(fā)明提通過的熒光共振探針能夠?qū)泻怂崞螐臄?shù)量或類型眾多的且堿基序列差異很小的核酸片段中檢測出來，該堿基序列差異可低至只有一個(gè)堿基的差異，其具有較高的特異性和靈敏度。且其可適用于檢測各種類型的DNA和RNA尤其是miRNA，具有非常廣闊的應(yīng)用前景和市場價(jià)值。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的熒光共振探針，其包括第一熒光探針和第二熒光探針。第一熒光探針具有第一結(jié)合區(qū)和第一識(shí)別區(qū)。第二熒光探針具有第二結(jié)合區(qū)和第二識(shí)別區(qū)。第一結(jié)合區(qū)的堿基序列與第二結(jié)合區(qū)的堿基序列反向互補(bǔ)，第一結(jié)合區(qū)的末端標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)，第二結(jié)合區(qū)的末端標(biāo)記有第二熒光基因。第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊。第一識(shí)別區(qū)和第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ)。在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為7bp，相應(yīng)地，第二結(jié)合區(qū)的長度也為7bp。在本實(shí)施例中，第一識(shí)別區(qū)的長度為11bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為11bp。第一熒光探針的總長度為18bp，第二熒光探針的總長度為18bp。在本實(shí)施例中，第一熒光基團(tuán)為Cy3，第二熒光基團(tuán)為Cy5。第一識(shí)別區(qū)的堿基序列和第二識(shí)別區(qū)的堿基序列可以根據(jù)待檢測靶核酸片段的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。同樣，第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)的堿基序列也可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)計(jì)，只要二者反向互補(bǔ)即可。采用本實(shí)施例提供的熒光共振探針檢測核酸片段的方法可參考后文的實(shí)施例10提供的方法。實(shí)施例2本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為8bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同。實(shí)施例3本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為9bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同。實(shí)施例4本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為8bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同；第一識(shí)別區(qū)的長度為11bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為12bp；第一熒光基因?yàn)镃y5，第二熒光基因?yàn)镃y5.5。實(shí)施例5本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為9bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同；第一識(shí)別區(qū)的長度為12bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為10bp；第一熒光基因?yàn)镃FP，第二熒光基因?yàn)閅FP。實(shí)施例6本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為8bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同；第一識(shí)別區(qū)的長度為11bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為11bp；第一熒光基因?yàn)镚FP，第二熒光基因?yàn)閅FP。實(shí)施例7本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為8bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同；第一識(shí)別區(qū)的長度為11bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為10bp；第一熒光基因?yàn)镽luc，第二熒光基因?yàn)镼Ds-655。實(shí)施例8本實(shí)施例提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1基本相同。不同的是：在本實(shí)施例中，第一結(jié)合區(qū)的長度為9bp，第二結(jié)合區(qū)的長度與第一結(jié)合區(qū)的長度相同；第一識(shí)別區(qū)的長度為12bp，第二識(shí)別區(qū)的長度為12bp；第一熒光基因?yàn)镃y3，第二熒光基因?yàn)镃y5。實(shí)施例9在實(shí)施例1提供的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，在本實(shí)施例中根據(jù)所要檢測的靶核酸片段即miR208-a的堿基序列(如SEQIDNO.3所示)設(shè)計(jì)得到了具有具體堿基序列的熒光共振探針，其可用于檢測miR208-a。本實(shí)施例提供的熒光共振探針的第一熒光探針和第二熒光探針的具體堿基序列如表1所示。表1.本實(shí)施例提供的用于檢測miR208-a片段的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)探針名稱堿基序列(5’-3’)序列標(biāo)識(shí)符第一熒光探針ACAAGCTTTTTTTTGATC-Cy3SEQIDNO.1第二熒光探針Cy5-GATCAAAGCTCGTCTTATSEQIDNO.2其中，第一熒光探針的第1-11位是第一識(shí)別區(qū)(5’-ACAAGCTTTTT-)，其位于第一熒光探針的5’端，可與miR208-a的第12-22位的第一靶標(biāo)區(qū)(-AAAAAGCUUGU-3’)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；第一熒光探針的第12-18位是第一結(jié)合區(qū)(-TTTGATC-3’)，其位于第一熒光探針的3’端；第一熒光基因Cy3標(biāo)記在第一結(jié)合區(qū)的末端即第一熒光探針的3’端。其中，第二熒光探針的第8-18位是第二識(shí)別區(qū)(-GCTCGTCTTAT-3’)，其位于第二熒光探針的3’端，可與miR208-a的第1-11位的第二靶標(biāo)區(qū)(5’-AUAAGACGAGC-)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；第二熒光探針的第1-7位是第二結(jié)合區(qū)(5’-GATCAAA-)，其位于第二熒光探針的5’端；第二熒光基因Cy5標(biāo)記在第二結(jié)合區(qū)的末端即第二熒光探針的5’端。實(shí)施例10本實(shí)施例提供了上述的熒光共振探針用于檢測靶核酸片段的方法。步驟如下。(1)獲取核酸模板采用常規(guī)方法提取樣品的總RNA或DNA基因組，得到核酸模板即待測樣本。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中，如果已提供核酸模板，則可省略此步驟。(2)雜交反應(yīng)將提取的核酸模板和上述的熒光共振探針的第一熒光探針和第二熒光探針按摩爾比為1:1:1加入至含有雜交液的反應(yīng)試管中進(jìn)行雜交反應(yīng)。其中，雜交反應(yīng)的條件是：時(shí)間30min，溫度37℃。其中，雜交液的包括：濃度為50mM的Tris-HCl，濃度為50mM的氯化鎂；雜交液中的鎂離子(mg2+)濃度為50mM；雜交液的pH為7.4。(3)熒光檢測雜交反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)試管置于檢測儀器(VICTORX4型號(hào)酶標(biāo)儀，美國PE公司)上，用第一熒光基因的激發(fā)波長進(jìn)行激發(fā)，檢測第一熒光基團(tuán)和第二熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，以第二熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度與第一熒光基因的熒光強(qiáng)度的比值作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(FRETRatio)。該熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率大于或等于閾值(0.2)，可判讀為陽性結(jié)果(即核酸模板中存在對(duì)應(yīng)的靶核酸片段)，若小于閾值(0.2)，則判讀為陰性結(jié)果(即核酸模板中存在對(duì)應(yīng)的靶核酸片段)。該熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率越大，核酸模板中含有的靶核酸片段的濃度也就越高。需要說明的是，上述的閾值是可以根據(jù)不同的熒光共振探針、實(shí)驗(yàn)條件等因素進(jìn)行調(diào)整的。本實(shí)施例提供的檢測核酸片段的方法只需要一步雜交過程，其具有操作簡單；雜交僅需半小時(shí)，耗時(shí)短；不需要酶的參與，方便快捷，成本較低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例11本發(fā)明提供了檢測核酸片段的試劑盒，該試劑盒包括實(shí)施例1-9中任一項(xiàng)所述的熒光共振探針。使用該試劑盒對(duì)靶核酸片段檢測的方法可實(shí)施例10，其效果同實(shí)施例10。實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例采用實(shí)施例10提供的檢測核酸片段的方法，檢測實(shí)施例9提供的熒光共振探針的可行性。具體如下。設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，第一個(gè)實(shí)驗(yàn)組：在雜交液中加入實(shí)施例9提供的熒光共振探針的第一熒光探針和第二熒光探針、以及靶核酸片段mir-208a；第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組：在雜交液中加入第一熒光探針和第二熒光探針；第三個(gè)試驗(yàn)組：在雜交液中只加入第二熒光探針。其他步驟同實(shí)施例10，分別檢測上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的熒光發(fā)射信號(hào)，結(jié)果如圖2所示。圖2的結(jié)果顯示(圖2為上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)組檢測出的熒光光譜圖，圖中：a為第一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的熒光光譜曲線，b為第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組的熒光光譜曲線，c為第三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的熒光光譜曲線)，第一個(gè)實(shí)驗(yàn)組能夠檢測到第二熒光基團(tuán)Cy5的熒光發(fā)射信號(hào)(如圖2中的a所示)，說明第一熒光探針、第二熒光探針和靶核酸片段形成了穩(wěn)定的T型結(jié)構(gòu)，發(fā)生了熒光共振能量的轉(zhuǎn)移；第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組只能檢測到第一熒光基因Cy3的熒光發(fā)射信號(hào)，不能檢測到第二熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射信號(hào)(如圖2中的b所示)，說明第一熒光探針和第二熒光探針之間發(fā)生了解離，不能促使熒光共振能量的轉(zhuǎn)移發(fā)生；而第三個(gè)實(shí)驗(yàn)組沒有檢測到熒光發(fā)射信號(hào)(如圖2中的c所示)。由此表明，實(shí)施例9提供的熒光共振探針能夠檢測到相應(yīng)的靶核酸片段mir-208a，對(duì)靶核酸片段有響應(yīng)效果，具有可行性。實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例采用實(shí)施例10提供的檢測核酸片段的方法，以RNA片段作為待測樣本驗(yàn)證實(shí)施例9提供的熒光共振探針的靈敏度和特異性。具體如下。以分別含有mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b、mir-208a的核酸模板溶液以及含有mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b和mir-208a混合核酸模板溶液(mixture)作為待測樣本，檢測實(shí)施例9提供的熒光共振探針的特異性和靈敏度。其中，mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b與mir-208a為同源RNA，其堿基序列如表2所示。表2.實(shí)驗(yàn)例1和實(shí)驗(yàn)例2所用的核酸片段的堿基序列核酸模板名稱堿基序列(5’-3’)mir-208aAUAAGACGAGCAAAAAGCUUGUmir-208bAUAAGACGAACAAAAGGUUUGUmir-195UAGCAGCACAGAAAUAUUGGCmir-155UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUmir-183GUGAAUUACCGAAGGGCCAUAAD-mi208aATAAGACGAGCAAAAAGCTTGTD-mi208bATAAGACGAACAAAAGGTTTGTD-mi208a-1ATAAGACGAACAAAAAGCTTGTD-mi208a-2ATAATACGAGCAAAAAGCTTGTD-mi208a-3ATAAGAAGAGCAAAAAGCTTGT檢測方法同實(shí)施例10。檢測結(jié)果如圖3所示。圖3的結(jié)果顯示(圖中：橫坐標(biāo)為不同類型的RNA片段，縱坐標(biāo)為熒光能量轉(zhuǎn)移效率即熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率)，僅含mir-208a的待測樣本和mixture樣品具有較高的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(分別是1.57、1.37)；而單獨(dú)含有mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b的各待測樣本的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率較低(分別是0.157、0.156、0.158、0.161)，均低于閾值0.2；由此說明，實(shí)施例9所提供的針對(duì)mir-208a檢測的熒光共振探針能夠檢測出mir-208a，且還能夠從同時(shí)含有同源的mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b、mir-208a、mir-208a的mixture待測樣本中將mir-208a分子特異性地檢出，此外，含mir-208b(其與mir-208a的差異僅有3個(gè)堿基，如表2中下劃線部分所示)的待測樣本也沒有陽性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，這就表明，實(shí)施例9所提供的熒光共振探針具有較高的特異性和靈敏度，能夠有效區(qū)分高度相似RNA家族(mir-195、mir-155、mir-183、mir-208b與mir-208a為同源RNA)，其可以用于檢測復(fù)雜生物樣本中的靶核酸片段。實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例采用實(shí)施例10提供的檢測核酸片段的方法，以DNA片段作為待測樣本驗(yàn)證實(shí)施例9提供的熒光共振探針的靈敏度和特異性。以分別含有D-mi208b、D-mi208a-1、D-mi208a-2、D-mi208a-3、D-mi208a的核酸模板溶液作為待測樣本，其中，D-mi208a為靶核酸片段，以空白溶液作為對(duì)照(blank)，檢測實(shí)施例9提供的熒光共振探針的特異性和靈敏度。其中，D-mi208b、D-mi208a-1、D-mi208a-2、D-mi208a-3堿基序列與D-mi208a堿基序列的差異僅為一個(gè)堿基(如表2中的下劃線部分所示)，其堿基序列如表2所示。檢測方法同實(shí)施例10，檢測結(jié)果如圖4所示。圖4的結(jié)果顯示(圖中：橫坐標(biāo)為不同類型的DNA片段，縱坐標(biāo)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率)，只有含D-mi208a的待測樣本具有較高的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(1.57)，而含D-mi208b、D-mi208a-1、D-mi208a-2、D-mi208a-3的各待測樣本的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(分別是0.16399、0.12997、0.21428、0.33725)較低，它們與空白對(duì)照的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率(0.157)差別很小；由此，進(jìn)一步說明，實(shí)施例9提供的熒光共振探針具有非常好特異性和靈敏度強(qiáng)(其能夠檢測出只有一個(gè)堿基差異的核酸片段)；該熒光共振探針不僅適用于RNA檢測尤其適用于需要高特異性和高靈敏度的miRNA的檢測，同時(shí)也能夠適用于DNA的檢測，其同樣具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度。通過實(shí)驗(yàn)例1和2的結(jié)果說明了實(shí)施例9提供的熒光共振探針具有檢測出RNA片段(mir-208a)和DNA片段(D-mi208a)的能力，且其具有較高的特異性和靈敏度(能夠?qū)H為一個(gè)堿基差異的核酸片段檢測出)，這也同樣表明了，實(shí)施例1-8所提供的熒光共振探針具有同樣的檢出能力，也就是說，只要所設(shè)計(jì)出的熒光共振探針具有實(shí)施例1-8任一項(xiàng)所述的熒光共振探針的結(jié)構(gòu)(該結(jié)構(gòu)用于與靶核酸片段反向互補(bǔ)配對(duì)形成T型結(jié)構(gòu))，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶核酸片段的高效檢出和區(qū)分。綜上所述，本發(fā)明提供的熒光共振探針通過第一熒光探針和第二熒光探針的結(jié)構(gòu)的特殊設(shè)置(即第一熒光探針的第一識(shí)別區(qū)和第二熒光探針的第二識(shí)別區(qū)分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標(biāo)區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)反向互補(bǔ)，第一熒光探針的第一結(jié)合區(qū)和第二熒光探針的結(jié)合區(qū)反向互補(bǔ))，使得第一熒光探針和第二熒光探針與對(duì)應(yīng)的靶核酸片段的靶標(biāo)區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合時(shí)能夠形成穩(wěn)定的T型結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定的T型結(jié)構(gòu)能夠確保第一熒光探針上的第一熒光基團(tuán)和第二熒光探針上的第二熒光基因之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，通過對(duì)熒光共振能量的轉(zhuǎn)移效率的計(jì)算，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基序列差異程度很小(低至一個(gè)堿基的差異程度)的靶核酸片段的檢測目的。本發(fā)明提供的熒光共振探針是基于一種全新的檢測原理進(jìn)行核酸片段的檢測，通過T型結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定存在的特殊條件(即第一識(shí)別區(qū)和第二識(shí)別區(qū)要分別與靶核酸片段第一靶區(qū)和第二靶標(biāo)區(qū)完全互補(bǔ)配對(duì))來實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基差異很小(低至一個(gè)堿基的差異)的靶核酸片段的高特異性和高靈敏度的順利檢出或區(qū)分?？傊景l(fā)明實(shí)例提供的熒光共振探針以及檢測方法不僅能夠檢測出RNA片段，還能夠?qū)NA片段進(jìn)行檢測，對(duì)不同類型的靶核酸片段檢測都具有很好的特異性和靈敏度，能將對(duì)應(yīng)的靶核酸片段從數(shù)量或類型眾多的且堿基序列差異很小的核酸片段中檢測出來，該堿基序列差異可低至只有一個(gè)堿基的差異。相應(yīng)的采用本發(fā)明的熒光共振探針進(jìn)行檢測的方法也只需要一步雜交過程，節(jié)約了工作強(qiáng)度，且操作簡單、快捷；雜交反應(yīng)僅需半小時(shí)就可以完成，耗時(shí)短；整個(gè)雜交反應(yīng)體系中不需要酶的參與，成本低。具有非常廣闊的應(yīng)用前景和市場價(jià)值。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>深圳先進(jìn)技術(shù)研究院<120>一種熒光共振探針及其應(yīng)用和試劑盒<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1acaagcttttttttgatc18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2gatcaaagctcgtcttat18<210>3<211>22<212>RNA<213>人工序列<400>3auaagacgagcaaaaagcuugu22當(dāng)前第1頁1 2 3