本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種cDNA的特異性分子標(biāo)簽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在過去的二三十年里，二代測序的大規(guī)模序列分析技術(shù)極大的推動(dòng)了基因組和轉(zhuǎn)錄組的序列分析。轉(zhuǎn)錄組的測序因?yàn)椴恍枰獙?duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組預(yù)先設(shè)計(jì)探針并且可以檢測未知轉(zhuǎn)錄本，已經(jīng)逐漸取代傳統(tǒng)的基因表達(dá)譜芯片成為首選的轉(zhuǎn)錄組分析方案。轉(zhuǎn)錄組是指在某一特定階段，由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄出來的全部RNA，包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組學(xué)就是從RNA水平研究基因的表達(dá)情況，在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的規(guī)律。與基因組不同，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究包含了時(shí)間和空間的限定，同一細(xì)胞在不同的生長時(shí)期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析需要數(shù)萬至數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞，這種基于群體水平的方法將大量的基因表達(dá)取平均值進(jìn)行分析，無法揭示細(xì)胞之間基因表達(dá)的異質(zhì)性。另外，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞數(shù)目稀少又難以培養(yǎng)時(shí)，這種傳統(tǒng)的分析方法就無能為力了，就需要用到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的分辨率精確到單個(gè)細(xì)胞，為辨別異質(zhì)性群體中各種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組特征提供了有力的工具。傳統(tǒng)的建庫方法使用超聲波、霧化等方法片段化DNA，需要較大量的起始材料，然后通過末端修復(fù)、添加接頭等步驟實(shí)現(xiàn)。然而基于單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序起始總RNA量極少，這種方法不適合，這是讓許多潛在用戶感到失望的一點(diǎn)。構(gòu)建cDNA文庫是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的關(guān)鍵技術(shù)步驟，其方法包括分離單細(xì)胞、細(xì)胞裂解、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、cDNA片段化與加接頭、文庫擴(kuò)增幾個(gè)步驟。單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序起始總RNA量極少，在不去除核糖體RNA的情況下使用多聚胸腺嘧啶(oligo-dT)作為逆轉(zhuǎn)錄引物獲得大量的全長cDNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換(template-switching)活性在cDNA的3｀端加上一段接頭序列，這段接頭序列可用于全長cDNA擴(kuò)增進(jìn)而得到整個(gè)mRNA的序列，從而避免3｀端的偏好性。使用轉(zhuǎn)座酶的建庫方法可以在打斷的同時(shí)在片段化DNA兩端加上接頭，將繁瑣的DNA片段化、末端修復(fù)和連接反應(yīng)等步驟變?yōu)榱艘徊胶唵蔚拿复俜磻?yīng)，這種方法極大的減少了起始模板量和樣品處理時(shí)間。轉(zhuǎn)錄組的研究可以從整體水平上來研究基因功能和基因結(jié)構(gòu)，揭示生物過程的分子機(jī)理，量化各轉(zhuǎn)錄本在其中的表達(dá)水平變化，因此被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、藥物研發(fā)、基礎(chǔ)研究以及臨床診斷等領(lǐng)域。然而，確定兩個(gè)不同物種或單一樣品中不同基因的絕對(duì)數(shù)量豐度很有挑戰(zhàn)性，由于PCR擴(kuò)增的偏好性，不同表達(dá)量的mRNA在經(jīng)過后續(xù)建庫的PCR擴(kuò)增后反應(yīng)出來的信息具有不準(zhǔn)確性，后續(xù)的生物信息分析數(shù)據(jù)無法真實(shí)的反應(yīng)基因表達(dá)量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是在于提供一種cDNA的特異性分子標(biāo)簽及其應(yīng)用，該特異性分子標(biāo)簽加在每一個(gè)cDNA的5｀端，使每一個(gè)基因都是獨(dú)一無二的，后續(xù)的信息分析可以根據(jù)該特異性分子標(biāo)簽的序列量化樣品中每一個(gè)基因。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種cDNA的特異性分子標(biāo)簽，其全長序列中包含：通用引物序列；轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7；隨機(jī)序列：(N)n，N為隨機(jī)序列，共n個(gè)；和poly(T)序列；其中，所述通用引物序列如SEQIDNO.1所示，轉(zhuǎn)座酶接頭序列如SEQIDNO.2所示，poly(T)序列共有30個(gè)T堿基即T30VN。優(yōu)選的，本發(fā)明所述cDNA的特異性分子標(biāo)簽，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，具體序列如下：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN，其中，N為隨機(jī)序列，共n個(gè)，N選自A、T、C、G；優(yōu)選的，n為5-10。本發(fā)明所述cDNA的特異性分子標(biāo)簽在cDNA建庫中的應(yīng)用。所述cDNA的特異性分子標(biāo)簽還應(yīng)用于利用轉(zhuǎn)座酶打斷的cDNA建庫中。本發(fā)明還提供一種利用轉(zhuǎn)座酶打斷的cDNA建庫方法，其包括如下步驟：1)分離單細(xì)胞，將單細(xì)胞裂解后釋放總RNA；以mRNA為模板、權(quán)利要求1或2所述特異性分子標(biāo)簽為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，使所述特異性分子標(biāo)簽加在第一鏈cDNA的5’端，且在逆轉(zhuǎn)錄過程中，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換活性在第一鏈cDNA的3’端加上一段接頭序列，該接頭序列與如SEQIDNO.1所示的通用引物序列相同；以第一鏈cDNA為模板，以如SEQIDNO.1所示的通用引物序列為引物通過PCR擴(kuò)增合成帶特異性分子標(biāo)簽的全長cDNA，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；2)將步驟1)所得全長cDNA與轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物進(jìn)行孵育，完成cDNA片段化和加接頭，其中轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物包括轉(zhuǎn)座酶和退火接頭；3)使用上游引物N7和下游引物N5對(duì)步驟2)得到的片段化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，上游引物N7的序列如SEQIDNO.4所示：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG，下游引物N5的序列如SEQIDNO.5所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC；4)對(duì)步驟3)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得帶特異性分子標(biāo)簽的cDNA的5`端文庫。進(jìn)一步，步驟2)中，所述轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物的制各方法包括：配制體系：配制體系：轉(zhuǎn)座酶(10U)12-15μL、退火接頭5μL、包埋緩沖液12-15μL，總體積33μL，用移液器輕輕吹打混勻，將配好的反應(yīng)體系置于PCR儀上30℃反應(yīng)1.5小時(shí)，-20℃保存。所述轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物中的轉(zhuǎn)座酶為Tn5家族轉(zhuǎn)座酶，野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶、突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶均適用于本發(fā)明；所述退火接頭的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具體為：CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA。再，步驟2)中，所述的cDNA片段化和加接頭方法包括：配制反應(yīng)混合液：所述轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物3-7μl，轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)緩沖液4-8μl；將5`端加上所述特異性分子標(biāo)簽的cDNA與反應(yīng)混合液混合，用移液器吹打混勻；在PCR儀中55℃反應(yīng)10-15min。本發(fā)明所述的特異性分子標(biāo)簽共有4n種，通過其上poly(T)序列的30個(gè)T堿基與mRNA上的poly(A)尾退火互補(bǔ)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，特異性分子標(biāo)簽加在第一鏈cDNA的5’端，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換活性在第一鏈cDNA的3’端加上一段與通用引物序列相同的接頭序列；通過如SEQIDNO.1所示的通用引物可擴(kuò)增合成得到帶特異性分子標(biāo)簽的全長cDNA，該全長cDNA無3`和5`偏好性。本發(fā)明所述的使用轉(zhuǎn)座酶打斷的建庫方法，在cDNA片段化過程中，片段化斷口的兩端被加上轉(zhuǎn)座酶的退火接頭，即除cDNA的3`和5`端外，片段化的DNA的兩端都有相同的退火接頭序列P5(如SEQIDNO.6所示)；而cDNA的5`端特異性分子標(biāo)簽上帶有轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7，因此利用帶有轉(zhuǎn)座酶接頭序列(如SEQIDNO.2所示)的N7引物和帶有退火接頭序列(如SEQIDNO.6所示)的N5引物就可以通過PCR反應(yīng)富集cDNA的5`端。后續(xù)的生物信息分析可以通過標(biāo)記在每一個(gè)cDNA的5`端上的特異性分子標(biāo)簽中的隨機(jī)序列來區(qū)別文庫中每一個(gè)cDNA的來源，實(shí)現(xiàn)cDNA的絕對(duì)定量。在全長cDNA制備過程中，本發(fā)明所述特異性分子標(biāo)簽加在第一鏈cDNA的5’端，從而給每一條mRNA打上了一條隨機(jī)的分子標(biāo)簽，使每一個(gè)基因都是獨(dú)一無二的，在后續(xù)的cDNA5`端富集過程中即使有不同程度的偏好性，但對(duì)于相同分子標(biāo)簽的cDNA，可以記為來源于同一個(gè)拷貝，因此生物信息數(shù)據(jù)分析時(shí)通過分子標(biāo)簽的不同就可以區(qū)分不同來源的mRNA，從而對(duì)mRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行精確的定量。本發(fā)明的有益效果：(1)與現(xiàn)有cDNA建庫中常用的序列相比，本發(fā)明設(shè)計(jì)的分子標(biāo)簽有4個(gè)不同的序列部分組成，這4個(gè)部分分別發(fā)揮不同的作用：通用引物序列：逆轉(zhuǎn)錄過程中由于逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換活性在cDNA的3`端加上一段與通用引物相同的序列，通過通用引物可擴(kuò)增合成得到帶特異性分子標(biāo)簽的全長cDNA；轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7：全長cDNA的5`端特異性分子標(biāo)簽上帶有轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7，并且在cDNA片段化過程中，片段化的DNA的兩端都有相同的退火接頭序列P5，使用帶有轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7(如SEQIDNO.2所示)的上游引物N7和帶有退火接頭序列P5(如SEQIDNO.6所示)的下游引物N5就可以通過PCR反應(yīng)僅富集cDNA的5`端；隨機(jī)序列：標(biāo)記每一個(gè)mRNA分子；poly(T)序列：與mRNA的3`端poly(A)序列互補(bǔ)配對(duì)，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。(2)與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)座酶打斷建庫方法相比，本發(fā)明的cDNA建庫中所使用轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物中的接頭序列只有一種退火接頭序列P5，通過帶有轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7的上游引物N7和帶有退火接頭序列P5的下游引物N5在PCR過程中可以丟棄兩端都是退火接頭序列P5的DNA片段而僅富集cDNA的5`端。后續(xù)的信息分析只需要cDNA的5`端的序列就能知道其代表的mRNA，無需得到全長的cDNA序列信息。(3)本發(fā)明所提供的分子標(biāo)簽加在每一個(gè)cDNA的5`端，使每一個(gè)基因都有獨(dú)一無二的分子標(biāo)簽，后續(xù)的信息分析可以根據(jù)標(biāo)簽的序列量化樣品中每一個(gè)基因，精確度大大提高。(4)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性分子標(biāo)簽應(yīng)用于構(gòu)建cDNA文庫時(shí)，所需起始總量RNA低(1-1000個(gè)細(xì)胞、10pg-10ng)，單個(gè)細(xì)胞即可作為起始模板進(jìn)行高效擴(kuò)增，解決了稀有樣本量不足的難題；同時(shí)大大減少了RNA樣本的處理，從而避免了樣品的損失，提高了操作的成功率。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1設(shè)計(jì)cDNA的特異性分子標(biāo)簽cDNA的特異性分子標(biāo)簽包含：A、通用引物序列，如SEQIDNO.1所示，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增全長cDNA，通用引物具體序列如下：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC；B、轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7，如SEQIDNO.2所示，具體序列如下：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG；C、隨機(jī)序列(N)n，其中，N為隨機(jī)序列，共n個(gè)；D、poly(T)序列，共30個(gè)T堿基即T30VN；通過基因合成方法合成cDNA分子標(biāo)簽，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN，其中，N為隨機(jī)序列，共n個(gè)，N選自A、T、C、G；優(yōu)選的，n為5-10。實(shí)施例2制備帶所述特異性分子標(biāo)簽的全長cDNA選擇人的293細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，利用南京諾唯贊(Vazyme)的Discover-scWTAKitV2(N711)試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增。所用到的試劑及材料均由該試劑盒提供，例如，單細(xì)胞裂解液、RNaseInhibitor、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、DTT、TSOligo、逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真酶等。(1)樣品準(zhǔn)備1)按照以下順序配制10×SampleBuffer，用移液器輕輕混勻，并短暫離心收集。表1組分體積單細(xì)胞裂解液19μlRNaseInhibitor1μl總體積20μl2)取1μl的10×SampleBuffer到0.2ml的PCR管中，再加入4μl的無核酸酶純水(Nuclease-freeH2O)。3)單細(xì)胞的分離取新鮮培養(yǎng)的293細(xì)胞懸浮液，在常溫下離心收集，棄培養(yǎng)液加PBS重懸，在倒置顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞的選取分離，并將分離得到的單細(xì)胞加入到步驟2)含10×SampleBuffer的0.2ml的PCR管中，輕彈管壁混勻，室溫孵育5min。(2)第一鏈cDNA合成1)將裂解后的樣品置于冰上，按照表2配制反應(yīng)混合液，再將4μl反應(yīng)混合液加入到6μl裂解好的單細(xì)胞樣品中，用移液器輕輕混勻，短暫離心收集后置于冰上。表2組分體積如SEQIDNO.3所示的特異分子標(biāo)簽2μldNTP2μl總體積4μl2)在PCR儀中72℃反應(yīng)3min，結(jié)束后立即置于冰上2min。3)將PCR儀預(yù)熱至42℃?zhèn)溆谩?)按照表3配制反應(yīng)混合液，用移液器輕輕混勻，短暫離心收集后置于冰上。表3組分體積Nuclease-freeH2O2.5μl步驟2)反應(yīng)產(chǎn)物10μl逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μlDTT1μlRNaseInhibitor0.5μlTSOligo1μl逆轉(zhuǎn)錄酶1μl總體積20μl5)進(jìn)行如表4所示PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物置于冰上，產(chǎn)物為第一鏈cDNA合成產(chǎn)物。表4熱蓋105℃42℃90min70℃15min4℃維持這一步逆轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA，并在cDNA的3’端加上一段與通用引物序列相同的接頭序列。(3)帶分子標(biāo)簽的全長cDNA擴(kuò)增通過如SEQIDNO.1所示的通用引物序列為引物通過PCR擴(kuò)增合成全長cDNA，具體步驟如下：1)配置如表5所示的PCR反應(yīng)液，用移液器輕輕混勻，短暫離心收集后置于冰上。表52)在PCR儀中運(yùn)行如表6所示程序：表6(4)PCR產(chǎn)物純化使用南京諾唯贊(Vazyme)的VAHTSDNACleanBeads(N411)吸附PCR產(chǎn)物，80％的乙醇清洗磁珠，ElutionBuffer洗脫，所得到的產(chǎn)物即為帶特異性分子標(biāo)簽的全長cDNA。實(shí)施例3使用轉(zhuǎn)座酶的DNA建庫方法使用南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的(Vazyme)TruePrepDNALibraryPrepKitV2forIllumina(TD503)試劑盒進(jìn)行，所用到的試劑及材料均由該試劑盒提供，例如，轉(zhuǎn)座酶緩沖液、PCR緩沖液、高保真酶等。轉(zhuǎn)座酶及包埋緩沖液由南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的(Vazyme)Tn5Transposome(S111)試劑盒提供。(1)接頭包埋配置如表7所示的反應(yīng)體系，用移液器輕輕吹打混勻，將配好的反應(yīng)體系置于PCR儀上30℃反應(yīng)1.5小時(shí)，得到轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物，-20℃保存。表7(2)帶分子標(biāo)簽的全長cDNA片段化1)在滅菌PCR管中依次添加如表8所示各反應(yīng)組分，使用移液器輕輕吹打混勻。表8組分體積1ngcDNA1μl轉(zhuǎn)座酶緩沖液4μl轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物5μlddH2O40μlTotal50μl2)進(jìn)行如表9所示PCR反應(yīng)，立即向反應(yīng)產(chǎn)物中加入5μl的5×TS，使用移液器輕輕吹打混勻，室溫放置5min。表9熱蓋105℃55℃10min10℃Hold(3)PCR富集cDNA的5’端1)配置如表10所示PCR反應(yīng)液，用移液器輕輕混勻，短暫離心收集后置于冰上。表10其中，上游引物N7的序列如SEQIDNO.4所示：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTCTCGTGGGCTCGG，其中xxxxxxxx為index序列；下游引物N5的序列如SEQIDNO.5所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxTCGTCGGCAGCGTC，xxxxxxxx為index序列。2)在PCR儀中運(yùn)行如表11所示程序：表11(3)PCR產(chǎn)物純化使用南京諾唯贊(Vazyme)生物科技有限公司生產(chǎn)的VAHTSDNACleanBeads(N411)吸附PCR產(chǎn)物，80％的乙醇清洗磁珠，ElutionBuffer洗脫，最終得到的產(chǎn)物即為富集到cDNA的5’端的文庫。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。序列表<110>南京諾唯贊生物科技有限公司<120>一種cDNA的特異性分子標(biāo)簽及其應(yīng)用<160>6<210>SEQIDNO.1<211>25<212>DNA<213>人工合成AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC<210>SEQIDNO.2<211>34<212>DNA<213>人工合成GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG<210>SEQIDNO.3<211>61<212>DNA<213>人工合成AAGCAGTGGTATACGCAGAGTACGTTCGTGGGCTCGGTTCATAAGAGACAGNNNNNNNT30VN<210>SEQIDNO.4<211>39<212>DNA<213>人工合成CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG<210>SEQIDNO.5<211>43<212>DNA<213>人工合成AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC<210>SEQIDNO.6<211>29<212>DNA<213>人工合成CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA當(dāng)前第1頁1 2 3