本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種在酵母細(xì)胞中異源表達(dá)制備纖維二糖差向異構(gòu)酶的方法。
背景技術(shù)：
：糖類化合物亦稱為碳水化合物，是自然界中存在最為廣泛的一大類物質(zhì)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)因單糖的構(gòu)成、連接方式、糖鏈的長度和空間構(gòu)型等的不同而呈現(xiàn)多樣性，并決定了其獨(dú)特的生物學(xué)功效。大量的研究已證明，功能性寡糖具有獨(dú)特的生理功能，如改善人類和動物腸道微生物中益生菌的菌群和數(shù)量、促進(jìn)維生素和礦物質(zhì)的吸收以及提高機(jī)體免疫能力等等。糖類化合物的代謝與生物酶是不可分割的，許多生物酶，譬如糖苷水解酶類、糖基轉(zhuǎn)移酶類、糖苷磷酸化酶類和糖類異構(gòu)酶/差向異構(gòu)酶類對于糖類化合物的代謝起著決定性的作用，對于功能糖產(chǎn)品的工業(yè)化制備和生產(chǎn)有著極其重要的意義。纖維二糖差向異構(gòu)酶(Cellobiose2-epimerase，EC5.1.3.11，CE)最早在白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)中被發(fā)現(xiàn)，該酶能夠?qū)⒗w維素和乳糖還原端的D-葡萄糖差向異構(gòu)化為D-甘露糖，是目前已知的碳水化合物異構(gòu)酶/差向異構(gòu)酶中唯一可以對寡糖進(jìn)行差向異構(gòu)化的酶。來源于白色瘤胃球菌的纖維二糖差向異構(gòu)酶(RaCE)具有催化纖維寡糖、乳糖和表乳糖(Epilactose)的差向異構(gòu)化能力，對乳糖和纖維二糖的轉(zhuǎn)化效率約為30％。已知的纖維二糖差向異構(gòu)酶主要來源于以下微生物，即脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)、海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermusmarinus)、嗜熱細(xì)菌DSM6724(Dictyoglomusturgidum)、溶纖維真細(xì)菌(Eubacteriumcellulosolvens)和白色瘤胃球菌(R.albus)。目前已知的纖維二糖差向異構(gòu)酶最適pH值均為中性，但來源物種不同其最適溫度也各異，如來源于嗜熱菌海洋紅嗜熱鹽菌(R.arinus)和嗜熱細(xì)菌DSM6724(D.turgidum)的纖維二糖差向異構(gòu)酶最適溫度在70-80℃，而來源于白色瘤胃球菌(R.albus)的纖維二糖差向異構(gòu)酶最適溫度是30℃。纖維二糖差向異構(gòu)酶差向異構(gòu)化乳糖的產(chǎn)物表乳糖。研究表明，表乳糖能顯著提高鈣、鐵在大鼠腸道內(nèi)的吸收以及促進(jìn)大鼠腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的增殖，顯示出益生元特性。在酶法制備表乳糖工藝中，如何獲得高活性高表達(dá)量的纖維二糖差向異構(gòu)酶是大量制備表乳糖的關(guān)鍵因素之一，但是由于大腸桿菌表達(dá)體系的局限性，如胞內(nèi)表達(dá)、蛋白表達(dá)量低、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，使得在實(shí)際生產(chǎn)中難以大量獲取制備表乳糖所需的纖維二糖差向異構(gòu)酶。目前對纖維二糖差向異構(gòu)酶的異源表達(dá)都是在大腸桿菌(Escherichiacoli)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行的。2008年ShigeakiIto等對來源于白色瘤胃球菌(R.albus)的纖維二糖差向異構(gòu)酶在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行了異源表達(dá)，2012年Jung-EunKim等對來源于嗜熱細(xì)菌DSM6724(D.turgidum)的纖維二糖差向異構(gòu)酶在E.coliER256中進(jìn)行了異源表達(dá)。而將纖維二糖差向異構(gòu)酶在畢赤酵母(Pichiapastoris)中進(jìn)行異源表達(dá)還未見任何報(bào)道。畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)，如胞外表達(dá)、蛋白表達(dá)量高、蛋白穩(wěn)定性好、回收簡便等，且操作簡單。畢赤酵母比桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、簡單、廉價(jià)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何制備纖維二糖差向異構(gòu)酶。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種制備纖維二糖差向異構(gòu)酶的方法。本發(fā)明所提供的制備纖維二糖差向異構(gòu)酶的方法，可為以酵母細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)，制備蛋白甲或蛋白乙；所述蛋白甲為纖維二糖差向異構(gòu)酶；所述蛋白乙包括纖維二糖差向異構(gòu)酶，還包括信號肽和/或標(biāo)簽肽。上述方法中，所述信號肽可為促使蛋白分泌到細(xì)胞外的分泌信號肽。所述信號肽具體可為alpha信號肽。上述方法中，“以酵母細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)，制備蛋白甲或蛋白乙”的實(shí)現(xiàn)方式可包括如下步驟：(1)將基因甲或基因乙導(dǎo)入所述酵母細(xì)胞，得到重組酵母細(xì)胞；所述基因甲為編碼所述蛋白甲的DNA分子；所述基因乙為編碼所述蛋白乙的DNA分子；(2)培養(yǎng)重組酵母細(xì)胞，得到所述蛋白甲或所述蛋白乙。上述方法中，所述基因甲可通過重組表達(dá)載體甲導(dǎo)入所述酵母細(xì)胞。所述基因乙可通過重組表達(dá)載體乙導(dǎo)入所述酵母細(xì)胞。所述重組表達(dá)載體甲可為含有所述基因甲并表達(dá)所述蛋白甲的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體乙可為含有所述基因乙并表達(dá)所述蛋白乙的重組質(zhì)粒。上述方法中，所述蛋白甲可為a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的功能相同的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2可由389個氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a3)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述方法中，所述蛋白乙可為b1)或b2)或b3)：b1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；b2)在序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；b3)將b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的功能相同的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列4可由486個氨基酸殘基組成。上述方法中，所述基因甲可為c1)或c2)或c3)：c1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；c2)與c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白甲的DNA分子；c3)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白甲的DNA分子。上述方法中，所述基因乙可為d1)或d2)或d3)：d1)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白乙的DNA分子；d3)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白乙的DNA分子。序列表中序列1可由1170個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3可由1461個核苷酸組成，序列表中序列3的核苷酸編碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼所述蛋白甲或所述蛋白乙的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的所述蛋白甲或所述蛋白乙的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白甲或所述蛋白乙，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼所述蛋白甲或所述蛋白乙的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述方法中，所述重組表達(dá)載體甲為在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入所述基因甲得到的重組質(zhì)粒。上述方法中，所述重組表達(dá)載體乙為在表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入所述基因乙得到的重組質(zhì)粒。所述表達(dá)載體可為載體pPIC9K。所述重組表達(dá)載體具體可為重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE。所述重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE為將載體pPIC9K的EcoRI識別序列和NotI識別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1至1167位所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。上述任一所述的方法中，所述酵母細(xì)胞可為畢赤酵母。所述畢赤酵母具體可為畢赤酵母GS115。所述重組酵母細(xì)胞具體可為將重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，得到的重組酵母細(xì)胞。所述重組酵母細(xì)胞具體可為將重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE-WT轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，得到的重組酵母細(xì)胞。上述任一所述重組表達(dá)載體甲或上述任一所述重組表達(dá)載體乙也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述重組酵母細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述重組表達(dá)載體甲或上述任一所述重組表達(dá)載體乙，或，上述任一所述重組酵母細(xì)胞在制備纖維二糖差向異構(gòu)酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白甲或上述任一所述蛋白乙也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述基因甲或上述任一所述基因乙也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的方法可制備纖維二糖差向異構(gòu)酶，且制備的纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活力高、穩(wěn)定性好，對表乳糖的生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。附圖說明圖1為重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的TLC檢測結(jié)果。圖2為SDS-PAGE檢測結(jié)果。圖3為實(shí)施例1步驟五中表乳糖含量的測定結(jié)果。圖4為表乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC檢測結(jié)果。圖5為乳糖溶液的HPLC檢測結(jié)果。圖6為反應(yīng)液的HPLC檢測結(jié)果。圖7為不同間隔時(shí)間取樣時(shí)重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化率。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。畢赤酵母GS115和載體pPIC9K均為Invitrogen公司的產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶EcoRI和限制性內(nèi)切酶NotI均為NEB公司的產(chǎn)品。瓊脂粉、生物素、蛋白胨(peptone)和無氨基酵母氮源(YNB)均為索萊寶生物科技有限公司的產(chǎn)品。表乳糖標(biāo)準(zhǔn)品為美國藥典委員會(USP)的產(chǎn)品。甲醇、甘油、氯化鈉、葡萄糖、乳糖均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司的產(chǎn)品。蛋白胨(tryptone)和酵母提取物均為OXOID公司的產(chǎn)品。載體pEASY-T1為北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為CT111-01。LB液體培養(yǎng)基：將酵母提取物0.5g、蛋白胨(tryptone)1.0g和氯化鈉1.0g用適量蒸餾水溶解，然后用蒸餾水定容至100mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121℃滅菌20min。YPD液體培養(yǎng)基：將蛋白胨(peptone)2.0g、酵母提取物1.0g和葡萄糖2.0g用適量蒸餾水溶解，然后用蒸餾水定容至100mL，115℃滅菌30min。YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉并使其濃度為2％(w/v)。MD固體培養(yǎng)基：將2.0g瓊脂糖溶于80mL蒸餾水中，121℃滅菌15min；待溫度冷卻至50℃后，在超凈臺加入10mL10×YNB、10mL10×葡萄糖和0.2mL500×生物素。10×YNB：13.4g無氨基酵母氮源(YNB)溶于100mL蒸餾水中，過濾滅菌，4℃保存。10×葡萄糖：10.0g葡萄糖溶于10mL去離子水，過濾除菌，4℃保存。500×生物素：將20mg生物素溶于100mL蒸餾水中，過濾滅菌。BMGY培養(yǎng)基：將酵母提取物l0.0g和蛋白胨(peptone)20.0g溶于700mL去離子水，121℃滅菌15min；冷卻后加入100mLpH6.0、1M磷酸鉀緩沖液、100mL10×YNB、2mL500×生物素和100mL10×甲醇，4℃保存。10×甲醇：5mL甲醇與95mL去離子水混合，過濾除菌，4℃保存。BMMY培養(yǎng)基：將酵母提取物l0.0g和蛋白胨(peptone)20.0g溶于700mL去離子水，121℃滅菌15min；冷卻后加入100mLpH6.0、1M磷酸鉀緩沖液、100mL10×YNB、2mL500×生物素和100mL10×甘油，4℃保存。10×甘油：100mL甘油與900mL去離子水混合，濕熱滅菌，4℃保存。TLC檢測的具體步驟如下：將1μL樣本液點(diǎn)樣于TLC分析板上進(jìn)行TLC檢測(展層劑為正丁醇：乙酸：水＝2:1:1(v/v/v)，顯色劑為硫酸：甲醇＝5:95(v/v))。以混合品(由表乳糖標(biāo)準(zhǔn)品和乳糖按質(zhì)量濃度比為1:1混合而成)和乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)對照。HPLC-ELSD檢測條件：色譜系統(tǒng)為Waters2695高效液相色譜；檢測器為蒸發(fā)光檢測器(ELSD)；色譜柱為Sugar-D(20I.D×250mm)；柱溫為30℃；流動相為乙腈：水＝4:1(v/v)；流速為1.0mL/min；檢測時(shí)間為30min；ELSD條件為：霧化溫度45℃，蒸發(fā)溫度60℃。實(shí)施例1、重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的制備一、重組質(zhì)粒pPIC9k-RaCE的構(gòu)建1、采用人工合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子作為模板，采用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1200bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。。F1：5’-CCCGGAATTCATGATGATAAGTGAGATAAGACA-3’；R1：5’-AAATATGCGGCCGCGATATCTACTCCGCGTGTG-3’。2、將步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pEASY-T1連接，得到中間質(zhì)粒。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切中間質(zhì)粒，回收約1200bp的酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切載體pPIC9K，回收約9.3kb的載體骨架。5、將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pPIC9K的EcoRI識別序列和NotI識別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1至1167位所示的DNA分子。重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE中，序列表的序列1自5’末端起第1至1167位所示的DNA分子與載體骨架上alpha分泌因子的編碼序列融合，形成序列表中的序列3所示的融合基因，表達(dá)序列表中的序列4所示的融合蛋白。理論上，融合蛋白的分子量為43.7kDa。二、重組酵母細(xì)胞的獲得和鑒定1、重組酵母細(xì)胞的獲得(1)用限制性內(nèi)切酶SacI酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-RaCE，獲得線性化質(zhì)粒。(2)采用電擊法將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(轉(zhuǎn)化過程中，需涂布在MD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h)，得到重組酵母細(xì)胞。2、重組酵母細(xì)胞的鑒定隨機(jī)選取步驟1獲得的8個重組酵母細(xì)胞(依次命名為重組酵母細(xì)胞1-重組酵母細(xì)胞8)進(jìn)行鑒定。(1)將重組酵母細(xì)胞(重組酵母細(xì)胞1、重組酵母細(xì)胞2、重組酵母細(xì)胞3、重組酵母細(xì)胞4、重組酵母細(xì)胞5、重組酵母細(xì)胞6、重組酵母細(xì)胞7或重組酵母細(xì)胞8)的單克隆接種于1mLBMGY培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)72h，得到培養(yǎng)體系1。(2)將培養(yǎng)體系1按1:100(v/v)接種于0.5mLBMMY培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)96h(培養(yǎng)過程中，每24h加入甲醇并使其在體系中的濃度為1％(v/v)，第一次加入甲醇的時(shí)間為培養(yǎng)24h后)，得到培養(yǎng)體系2。(3)取培養(yǎng)體系2，8000rpm離心10min，收集上清液。(4)TLC檢測(a1)制備反應(yīng)體系(80μL)：將10μL上清液和70μL乳糖溶液(溶劑為水)混合，得到反應(yīng)體系；反應(yīng)體系中，乳糖的初始濃度為10mg/mL。(a2)完成步驟(a1)后，取反應(yīng)體系，30℃水浴4h，得到樣本液。(a3)完成步驟(a1)后，進(jìn)行TLC檢測。TLC檢測結(jié)果見圖1(混標(biāo)為混合品，1為重組酵母細(xì)胞1，2為重組酵母細(xì)胞2，3為重組酵母細(xì)胞3，4為重組酵母細(xì)胞4，5為重組酵母細(xì)胞5，6為重組酵母細(xì)胞6，7為重組酵母細(xì)胞7，8為重組酵母細(xì)胞8)。結(jié)果表明，重組酵母細(xì)胞1、重組酵母細(xì)胞2和重組酵母細(xì)胞7均可將乳糖差向異構(gòu)為表乳糖，因此，重組酵母細(xì)胞1、重組酵母細(xì)胞2和重組酵母細(xì)胞7均鑒定為陽性克隆。將重組酵母細(xì)胞1命名為RaCE/GS115-1。將重組酵母細(xì)胞2命名為RaCE/GS115-2。將將重組酵母細(xì)胞7命名為RaCE/GS115-7。三、對照酵母細(xì)胞的獲得按照上述步驟二中1的方法，將重組質(zhì)粒pPIC9k-RaCE替換為載體pPIC9K，其它步驟均不變，得到對照酵母細(xì)胞。四、重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的制備1、將酵母細(xì)胞(RaCE/GS115-1、RaCE/GS115-2、RaCE/GS115-7、對照酵母細(xì)胞或畢赤酵母GS115)的單克隆接種于200mLBMGY培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)體系甲。2、將培養(yǎng)體系甲按1:100(v/v)接種至100mLBMMY培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)96h(培養(yǎng)過程中，每24h加入甲醇并使其在體系中的濃度為1％(v/v)，第一次加入甲醇的時(shí)間為培養(yǎng)24h后)，得到培養(yǎng)體系乙。3、取培養(yǎng)體系乙，8000rpm離心10min，收集上清液，即為粗酶液。將上清液進(jìn)行SDS-PAGE。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(最左邊的泳道為蛋白Marker，1為RaCE/GS115-1，2為RaCE/GS115-2，7為RaCE/GS115-7)。結(jié)果表明，融合蛋白(即重組纖維二糖差向異構(gòu)酶)存在于培養(yǎng)RaCE/GS115-1、RaCE/GS115-2或RaCE/GS115-7得到的上清液中，而不存在于培養(yǎng)對照酵母細(xì)胞或畢赤酵母GS115的上清液中。融合蛋白顯示單一分子量條帶，對應(yīng)分子量為43.7kDa，與理論上的蛋白大小完全一致。采用Bradford法(BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[J].AnalyticalBiochemistry,1976,72(1-2):248-54.)檢測粗酶液中的蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果表明，培養(yǎng)RaCE/GS115-1、RaCE/GS115-2和RaCE/GS115-7獲得的上清液中蛋白濃度依次為0.32mg/mL、0.36mg/mL和0.35mg/mL。五、重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活測定1、取步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-1收集的粗酶液，用BMMY培養(yǎng)基稀釋100倍，得到待測酶液甲。取步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-2收集的粗酶液，用BMMY培養(yǎng)基稀釋100倍，得到待測酶液乙。取步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-7收集的粗酶液，用BMMY培養(yǎng)基稀釋100倍，得到待測酶液丙。取步驟四中培養(yǎng)對照酵母細(xì)胞收集的粗酶液，用BMMY培養(yǎng)基稀釋100倍，得到待測酶液丁。取步驟四中培養(yǎng)畢赤酵母GS115收集的粗酶液，用BMMY培養(yǎng)基稀釋100倍，得到待測酶液戊。2、測定重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活力測定重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活力的方法具體如下：(1)取1mL待測酶液(待測酶液甲、待測酶液乙、待測酶液丙、待測酶液丁或待測酶液戊)，加入9mL乳糖溶液(溶劑為水)，得到反應(yīng)體系；反應(yīng)體系中，乳糖的初始濃度為10mg/mL；(2)完成步驟(1)后，取反應(yīng)體系，先30℃水浴1h、2h、3h、4h或24h，然后96℃金屬浴15min，最后冰浴5min，終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液；(3)完成步驟(2)后，取反應(yīng)液，離心，收集上清液并用0.22μm濾膜過濾，得到上樣液；(4)將上樣液、表乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為水)和乳糖溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為水)分別進(jìn)行HPLC-ELSD(上樣量均為5μL)，通過檢測峰面積來測定重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活力，每單位重組纖維二糖差向異構(gòu)酶活力的定義為在30℃條件下，每分鐘生成1μmol表乳糖所需的酶量；然后計(jì)算重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的比酶活。重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活力(U/mL)＝表乳糖含量(μmol/mL)÷60(min)×10(反應(yīng)體系)×100(稀釋倍數(shù))表乳糖含量(g/L)＝表乳糖峰面積(mAu*s)×10mg/mL÷47542030(mAu*s)乳糖含量(g/L)＝乳糖峰面積(mAu*s)×10mg/mL÷53541927(mAu*s)重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的比酶活(U/mg)＝重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶活力(U/mL)÷蛋白含量(mg/mL)。步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-1收集的粗酶液、步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-2收集的粗酶液和步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-7收集的粗酶液的表乳糖含量詳見圖3。測定結(jié)果如下：步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-1收集的粗酶液的酶活力為57.81U/mL，比酶活為180.24U/mg；步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-2收集的粗酶液的酶活力為66.14U/mL，比酶活為181.62U/mg；步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-7收集的粗酶液的酶活力為57.44U/mL，比酶活為161.42U/mg；比文獻(xiàn)(ItoS,TaguchiH,HamadaS,etal.Enzymaticpropertiesofcellobiose2-epimerasefromRuminococcusalbusandthesynthesisofrareoligosaccharidesbytheenzyme[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2008,79(3):433-41.)記載的利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的比酶活(比酶活為3.5U/mg)大大提高。步驟四中培養(yǎng)對照酵母細(xì)胞收集的粗酶液的酶活力為0U/mL；步驟四中培養(yǎng)畢赤酵母GS115收集的粗酶液的酶活力為0U/mL。實(shí)施例2、重組纖維二糖差向異構(gòu)酶在制備表乳糖中的應(yīng)用反應(yīng)液(體積為400mL)：將乳糖溶液(溶劑為水)和100mL實(shí)施例1步驟四中培養(yǎng)RaCE/GS115-2收集的上清液混合，得到反應(yīng)液；反應(yīng)液中，乳糖的初始濃度為200g/L。反應(yīng)條件：37℃水浴24h。實(shí)驗(yàn)過程中，間隔時(shí)間(即反應(yīng)1h、反應(yīng)2h、反應(yīng)3h、反應(yīng)4h和反應(yīng)24h)取反應(yīng)液，作為樣本液。將樣本液、表乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為水)和乳糖溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為水)分別進(jìn)行TLC檢測和HPLC-ELSD檢測。計(jì)算不同間隔時(shí)間取樣時(shí)，乳糖差向異構(gòu)為表乳糖的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率＝表乳糖濃度(mg/mL)/乳糖初始濃度(mg/mL)×100％。表乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC檢測結(jié)果見圖4(保留時(shí)間為13.963min)。乳糖溶液的HPLC檢測結(jié)果見圖5(保留時(shí)間為17.753min)。間隔時(shí)間24h取的反應(yīng)液的HPLC檢測結(jié)果見圖6(表乳糖的保留時(shí)間為13.933，乳糖的保留時(shí)間為17.810)。不同間隔時(shí)間取樣時(shí)的轉(zhuǎn)化率的結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，重組纖維二糖差向異構(gòu)酶逐漸差向異構(gòu)乳糖為表乳糖，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到24％。<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所全國畜牧總站<120>一種在酵母細(xì)胞中異源表達(dá)制備纖維二糖差向異構(gòu)酶的方法<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1170<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atgatgataagtgagataagacatgaactgacagatcacattataccattctggaacaag60ctgcgcgatgatgagaacgggggattctacggatacctcagctacgggctggaacttgac120aagaaggcagataagggtgttatactgcattcgaggatactgtggttctattcaaacgct180tatatgacactgggcggtgatgagcttcttgacaatgcaaagcacgcttatgagttcata240aagaacaactgtatcgactatgaatacggtggagtatactggatgatggactttgagggc300aagtctgcggataccatgaagcatacttacaatatcgcttttgctatatatgcgctgtca360agctattacagagcgagcggtgacaaggaagctctcgcgctggcatacaggctttttgag420gacatagaaaagaatactcttgatgagtacggctaccgcgaagcttttgacaggcagtgg480aggcttgtggataatgaggcgctcagcgagaacggtctgaaggctgacaagaccatgaat540gctatacttcaccttattgaagcgtatactgagctgtacaaggcagacggtaacgagaag600gtagctgacaggctgaaattccagttgggacagatgagggatatagtatatacccccgat660accaatgccctgaaggtattctttgatacagctttcaatctggtcggagatatacattcc720tacgggcatgacattgaagccacatggcttatggacagagcctgcgatgtactgggcgat780gaggatctgaaaaagcagttcgctgaaatgaacctgaagatatcccataatatacaggat840atagctcttgaggacggtgcactgaacaatgagcgcgacaagaacgagatagacaagacc900cgcgtatggtgggtacaggctgaggctgttgtgggattcataaatgcttatcagcacagc960ggcgatgaaaagttccttgaatctgcaaagagcgtatgggagaatatcaaggagtacatc1020atagacaagcgtgagggcggtgaatggtattccgaggtcacctttgaacatactcctcac1080gactacaaggaaacggtcggtccctggaagtgtccttatcataacggcagaatgtgtatg1140gaagtcatcacacgcggagtagatatctga1170<210>2<211>389<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2MetMetIleSerGluIleArgHisGluLeuThrAspHisIleIlePro151015PheTrpAsnLysLeuArgAspAspGluAsnGlyGlyPheTyrGlyTyr202530LeuSerTyrGlyLeuGluLeuAspLysLysAlaAspLysGlyValIle354045LeuHisSerArgIleLeuTrpPheTyrSerAsnAlaTyrMetThrLeu505560GlyGlyAspGluLeuLeuAspAsnAlaLysHisAlaTyrGluPheIle65707580LysAsnAsnCysIleAspTyrGluTyrGlyGlyValTyrTrpMetMet859095AspPheGluGlyLysSerAlaAspThrMetLysHisThrTyrAsnIle100105110AlaPheAlaIleTyrAlaLeuSerSerTyrTyrArgAlaSerGlyAsp115120125LysGluAlaLeuAlaLeuAlaTyrArgLeuPheGluAspIleGluLys130135140AsnThrLeuAspGluTyrGlyTyrArgGluAlaPheAspArgGlnTrp145150155160ArgLeuValAspAsnGluAlaLeuSerGluAsnGlyLeuLysAlaAsp165170175LysThrMetAsnAlaIleLeuHisLeuIleGluAlaTyrThrGluLeu180185190TyrLysAlaAspGlyAsnGluLysValAlaAspArgLeuLysPheGln195200205LeuGlyGlnMetArgAspIleValTyrThrProAspThrAsnAlaLeu210215220LysValPhePheAspThrAlaPheAsnLeuValGlyAspIleHisSer225230235240TyrGlyHisAspIleGluAlaThrTrpLeuMetAspArgAlaCysAsp245250255ValLeuGlyAspGluAspLeuLysLysGlnPheAlaGluMetAsnLeu260265270LysIleSerHisAsnIleGlnAspIleAlaLeuGluAspGlyAlaLeu275280285AsnAsnGluArgAspLysAsnGluIleAspLysThrArgValTrpTrp290295300ValGlnAlaGluAlaValValGlyPheIleAsnAlaTyrGlnHisSer305310315320GlyAspGluLysPheLeuGluSerAlaLysSerValTrpGluAsnIle325330335LysGluTyrIleIleAspLysArgGluGlyGlyGluTrpTyrSerGlu340345350ValThrPheGluHisThrProHisAspTyrLysGluThrValGlyPro355360365TrpLysCysProTyrHisAsnGlyArgMetCysMetGluValIleThr370375380ArgGlyValAspIle385<210>3<211>1461<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgct60ccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggt120tactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaat180aacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggta240tctctcgagaaaagagaggctgaagcttacgtagaattcatgatgataagtgagataaga300caggaactgacagatcacattataccattctggaacaagctgcgcgatgatgagaacggg360ggattctacggatacctcagctacgggctgggacttgacaagaaggcagataagggtgtt420atactgcattcgaggatactgtggttctattcaaacgcttatatgacactgggcggtgat480gagcttcttgacaatgcaaagcacgcttatgagttcataaagaacaactgcatcgactat540gaatacggtggagtatactggatgatggactttgagggcaagcctgcggataccatgaag600catacttacaatatcgcttttgctatatatgcgctgtcaagctattacagagcgagcggt660gacaaggaagctctcgcgctggcatacaggccttttgaggacatagaaaagaatactctt720tatgagtacggctaccgcgaagcttttgacaggcagtggaggcttgtggataatgaggcg780ctcagcgagaacggtctgaaggctgacaagaccatgaatgctatacttcaccttattgaa840gcgtataccgagctgtacaaggcagacggtaacgagaaggtagctgacaggctgaagttc900cagctgggacagatgagggatatagtatatacccccgatacaaatgcgctgaaggtattc960tttgatacagctttcaatctggtcggagatatacattcctacgggcatgacattgaagcc1020acatggcttatggacagagcctgcgatgtactgggcgatgaggatctgaaaaagcagttc1080gctgaaatggacctgaagatatcccataatatacaggatatagctcttgaggacggtgcg1140ctgaacaatgagcgcgacaagaacgagatagacaagacccgcgtatggtgggtacaggct1200gaggctgttgtgggattcataaatgcttatcagcacagcggcgatgaaaagttccttgaa1260tctgcaaagagcgtatgggagaatatcaaggagtacatcatagacaagcgtgagggcggt1320gaatggtattccgaggtcacctttgaccatactcctcacgactataaggaaacggtcggt1380ccctggaagtgtccttatcataacggcagaatgtgtatggaagtcatcacacgcggagta1440gatatcgcggccgcgaattaa1461<210>4<211>486<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>4MetArgPheProSerIlePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSerSer151015AlaLeuAlaAlaProValAsnThrThrThrGluAspGluThrAlaGln202530IleProAlaGluAlaValIleGlyTyrSerAspLeuGluGlyAspPhe354045AspValAlaValLeuProPheSerAsnSerThrAsnAsnGlyLeuLeu505560PheIleAsnThrThrIleAlaSerIleAlaAlaLysGluGluGlyVal65707580SerLeuGluLysArgGluAlaGluAlaTyrValGluPheMetMetIle859095SerGluIleArgGlnGluLeuThrAspHisIleIleProPheTrpAsn100105110LysLeuArgAspAspGluAsnGlyGlyPheTyrGlyTyrLeuSerTyr115120125GlyLeuGlyLeuAspLysLysAlaAspLysGlyValIleLeuHisSer130135140ArgIleLeuTrpPheTyrSerAsnAlaTyrMetThrLeuGlyGlyAsp145150155160GluLeuLeuAspAsnAlaLysHisAlaTyrGluPheIleLysAsnAsn165170175CysIleAspTyrGluTyrGlyGlyValTyrTrpMetMetAspPheGlu180185190GlyLysProAlaAspThrMetLysHisThrTyrAsnIleAlaPheAla195200205IleTyrAlaLeuSerSerTyrTyrArgAlaSerGlyAspLysGluAla210215220LeuAlaLeuAlaTyrArgProPheGluAspIleGluLysAsnThrLeu225230235240TyrGluTyrGlyTyrArgGluAlaPheAspArgGlnTrpArgLeuVal245250255AspAsnGluAlaLeuSerGluAsnGlyLeuLysAlaAspLysThrMet260265270AsnAlaIleLeuHisLeuIleGluAlaTyrThrGluLeuTyrLysAla275280285AspGlyAsnGluLysValAlaAspArgLeuLysPheGlnLeuGlyGln290295300MetArgAspIleValTyrThrProAspThrAsnAlaLeuLysValPhe305310315320PheAspThrAlaPheAsnLeuValGlyAspIleHisSerTyrGlyHis325330335AspIleGluAlaThrTrpLeuMetAspArgAlaCysAspValLeuGly340345350AspGluAspLeuLysLysGlnPheAlaGluMetAspLeuLysIleSer355360365HisAsnIleGlnAspIleAlaLeuGluAspGlyAlaLeuAsnAsnGlu370375380ArgAspLysAsnGluIleAspLysThrArgValTrpTrpValGlnAla385390395400GluAlaValValGlyPheIleAsnAlaTyrGlnHisSerGlyAspGlu405410415LysPheLeuGluSerAlaLysSerValTrpGluAsnIleLysGluTyr420425430IleIleAspLysArgGluGlyGlyGluTrpTyrSerGluValThrPhe435440445AspHisThrProHisAspTyrLysGluThrValGlyProTrpLysCys450455460ProTyrHisAsnGlyArgMetCysMetGluValIleThrArgGlyVal465470475480AspIleAlaAlaAlaAsn485當(dāng)前第1頁1 2 3