本發(fā)明涉及現(xiàn)代生物技術(shù)之培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，涉及動物細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，具體地說，是一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物及其使用方法。

技術(shù)背景

肝臟是人體內(nèi)最大的器官，也是體內(nèi)少有的具有再生能力的器官。肝臟承擔(dān)著機體內(nèi)重要的生理活動，具有糖原合成和分解、儲藏維生素A、尿素合成、藥物代謝和解毒等功能，對人體的新陳代謝具有至關(guān)重要的作用。肝細胞作為肝臟功能的主要行使者被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床研究，現(xiàn)今的藥物開發(fā)和研究以及肝細胞移植都需要大量具功能的肝細胞。但是，目前的肝細胞主要取自供體肝臟，來源非常有限。而通過體外增殖獲得肝細胞不僅困難而且其肝功能會急劇下降。因此，本領(lǐng)域迫切需要拓展新的肝細胞的來源，以滿足基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的需求。

現(xiàn)有的研究表明：成纖維細胞在一定條件下可以轉(zhuǎn)分化為特定的細胞類型。如果能夠?qū)碓从诓∪说某衫w維細胞轉(zhuǎn)分化為肝細胞或者是具有肝功能的細胞，不但可以解決肝細胞來源的問題，而且可以在細胞移植或者生物人工肝應(yīng)用過程中避免潛在的免疫排斥等問題。目前，有研究機構(gòu)通過限定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)成纖維細胞向肝樣細胞的直接轉(zhuǎn)化，成功地將成纖維細胞誘導(dǎo)為具肝樣功能的細胞，并通過SV40 Large T過表達，促進肝樣細胞的增殖。

由轉(zhuǎn)分化獲得的肝樣細胞具有與原代肝細胞類似的表型及功能，如分泌白蛋白、合成尿素、儲存糖原、部分藥物代謝和轉(zhuǎn)運能力等，并且在體外可以長期穩(wěn)定增殖和維持功能?，F(xiàn)已證實，經(jīng)過細胞移植，肝樣細胞在生物體內(nèi)不但具有再生能力并且不存在潛在的致瘤風(fēng)險。這些研究均表明：肝樣細胞有望代替原代肝細胞用于肝臟藥物研究和臨床應(yīng)用。然而，在藥物研究和臨床應(yīng)用中需要大量的功能肝細胞，如臨床上為肝衰竭成人患者提供肝功能支持的生物人工肝系統(tǒng)常需要10¹⁰-10¹¹功能肝細胞，而通過轉(zhuǎn)分化通常只能獲得10⁶-10⁷功能肝細胞；因此，需要在體外大量培養(yǎng)和擴增肝樣細胞。

在體外培養(yǎng)動物細胞的過程中，培養(yǎng)基是細胞營養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源，因此，培養(yǎng)基的成分直接影響動物細胞的增殖和功能。由于不同動物細胞的代謝特性不同，它們對營養(yǎng)物質(zhì)的需求也不同，故需要根據(jù)動物細胞的特性設(shè)計不同的、有特征的個性化培養(yǎng)基。目前，市場上有一些商業(yè)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可用于肝細胞的培養(yǎng)，例如：DMEM/F12和William E等，其中，William E培養(yǎng)基主要用于原代肝細胞的培養(yǎng)，而DMEM/F12培養(yǎng)基主要用于由ESC、iPSC等分化而來的肝樣細胞的培養(yǎng)。這兩種所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均具有一定的普適性，可用于許多種類細胞的培養(yǎng)，但培養(yǎng)基中必需添加動物來源的血清和其他添加劑。

血清是一種復(fù)雜的混合物，其中含有多種細胞粘附、生長和增殖所需的生長調(diào)節(jié)因子，能夠補充基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或者量不足的營養(yǎng)成分，提供載體蛋白以結(jié)合維生素、脂質(zhì)和金屬離子等，還能提供蛋白酶抑制劑等。但是，由于血清來源于異種動物，成分不明，不同批次的血清差異較大，質(zhì)量難以控制，且存在病毒感染、免疫排斥等風(fēng)險，因此，采用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的動物細胞在藥物研究和臨床應(yīng)用上往往存在較大的限制。要實現(xiàn)肝樣細胞在藥物研究和臨床治療中的可靠或安全應(yīng)用，在其體外培養(yǎng)過程中不能添加動物來源的血清。然而，作為由成纖維細胞轉(zhuǎn)分化而來的肝樣細胞是一種全新來源的細胞，目前還沒有能支持其體外擴增和維持其功能的無血清培養(yǎng)基。

為實現(xiàn)動物細胞的無血清培養(yǎng)，往往需要在商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充一些血清替代物以促進細胞增殖、維持細胞功能。目前，在用的血清替代物常含有一些組成不確定的添加劑，例如蛋白水解物等。研究發(fā)現(xiàn)，在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加B-27及其他組分可以促進肝樣細胞的增殖和功能維持，但所述B-27作為成分不明的組分在臨床應(yīng)用中受到一定限制。因此，為滿足肝樣細胞在藥物研究和臨床治療中的應(yīng)用，需要開發(fā)成分明確的、適于肝樣細胞體外無血清培養(yǎng)和擴增的血清替代物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物，其組分明確，可添加到商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，能支持肝樣細胞體外無血清培養(yǎng)和擴增。本發(fā)明的第二目的是，提供所述替代血清組合物的使用方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案。

一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物，含有多種維生素、氨基酸、細胞因子、蛋白、金屬離子、激素、脂肪酸和抗氧化劑，其特征在于，其各種組分的含量為（以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度計算，單位為毫克/升或微摩爾/升）：

半乳糖 1000～3000mg/L；

丙酮酸鈉 100～120mg/L；

鳥氨酸 100～200mg/L；

脯氨酸 100～300mg/L；

轉(zhuǎn)鐵蛋白 5～10mg/L；

胰島素 10～20mg/L；

牛血清白蛋白 50～2500mg/L；

TGF-α 0.02～0.05mg/L；

EGF 0.02～0.05mg/L；

ZnCl₂ 0.4～0.6mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 0.6～0.8mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.1～0.4mg/L；

MnSO₄ 0.01～0.03mg/L；

孕酮 0.005～0.007mg/L；

腎上腺酮 0.01～0.04mg/L；

三碘甲狀腺原氨酸 0.001～0.004mg/L；

地塞米松 8.0～11.0μM；

煙酰胺 500～700mg/L；

維生素H 1.0～2.0mg/L；

維生素A乙酸酯 0.1～0.3mg/L；

維生素E 1.0～2.0mg/L；

丁二胺 12.0～17.0mg/L；

乙醇胺 1.0～2.0mg/L；

亞硒酸鈉 0.01～0.03mg/L；

過氧化氫酶 1.0～3.0mg/L；

谷胱甘肽 1.0～2.0mg/L；

超氧化物歧化酶 2.0～4.0mg/L；

肉堿 1.0～4.0mg/L；

亞麻酸 1.0～2.0mg/L；

亞油酸 1.0～2.0mg/L。

可選地，所述替代血清組合物以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

為實現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案。

一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的使用方法，其特征在于，采用DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體步驟如下：

（1）配制含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基

所述替代血清組合物含有多種維生素、氨基酸、細胞因子、蛋白、金屬離子、激素、脂肪酸和抗氧化劑，其各種組分的含量為（以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度計算，單位為毫克/升或微摩爾/升）：

半乳糖 1000～3000mg/L；

丙酮酸鈉 100～120mg/L；

鳥氨酸 100～200mg/L；

脯氨酸 100～300mg/L；

轉(zhuǎn)鐵蛋白 5～10mg/L；

胰島素 10～20mg/L；

牛血清白蛋白 50～2500mg/L；

TGF-α 0.02～0.05mg/L；

EGF 0.02～0.05mg/L；

ZnCl₂ 0.4～0.6mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 0.6～0.8mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.1～0.4mg/L；

MnSO₄ 0.01～0.03mg/L；

孕酮 0.005～0.007mg/L；

腎上腺酮 0.01～0.04mg/L；

三碘甲狀腺原氨酸 0.001～0.004mg/L；

地塞米松 8.0～11.0μM；

煙酰胺 500～700mg/L；

維生素H 1.0～2.0mg/L；

維生素A乙酸酯 0.1～0.3mg/L；

維生素E 1.0～2.0mg/L；

丁二胺 12.0～17.0mg/L；

乙醇胺 1.0～2.0mg/L；

亞硒酸鈉 0.01～0.03mg/L；

過氧化氫酶 1.0～3.0mg/L；

谷胱甘肽 1.0～2.0mg/L；

超氧化物歧化酶 2.0～4.0mg/L；

肉堿 1.0～4.0mg/L；

亞麻酸 1.0～2.0mg/L；

亞油酸 1.0～2.0mg/L；

將所述的替代血清組合物各成分按一定劑量加入DMEM/F12中，溶于超純水中，過濾除菌；

（2）準備培養(yǎng)介質(zhì)

①將I型膠原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型膠原終濃度為0.1%（w/v），將溶解液用0.22μm濾膜過濾，然后向培養(yǎng)介質(zhì)中加入50μl/cm² I型膠原溶解液；

②如培養(yǎng)介質(zhì)為多孔板或培養(yǎng)皿，將步驟（2）①的培養(yǎng)介質(zhì)敞蓋置于超凈臺中晾干；

③收集步驟（2）②的培養(yǎng)介質(zhì)前須用紫外線照射培養(yǎng)介質(zhì)30分鐘，待用；

④如培養(yǎng)介質(zhì)為培養(yǎng)瓶，將步驟（2）①的培養(yǎng)介質(zhì)在室溫下孵育2小時，之后將I型膠原溶液倒出，所述培養(yǎng)介質(zhì)用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后待用；

（3）含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基的使用

①將含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基先置于37℃恒溫箱中預(yù)熱15分鐘；

②將肝樣細胞重懸于步驟（1）配制的含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基中，加入步驟（2）②或④的培養(yǎng)介質(zhì)里；

③將步驟（3）②含肝樣細胞的培養(yǎng)介質(zhì)置于37℃、5%CO₂、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每2 天換液一次，培養(yǎng)4～6天后傳代或收獲肝樣細胞；

（4）體外培養(yǎng)的肝樣細胞的傳代或收獲

培養(yǎng)4～6天后，棄去步驟（3）③的培養(yǎng)介質(zhì)里的培養(yǎng)上清液，加入PBS洗滌一次，按25～100μl/cm²加入0.05%（w/v）胰酶溶液至培養(yǎng)介質(zhì)并進行細胞消化，待細胞消化后，按與胰酶溶液體積1:1的比例加入含胰重組抑肽酶（10 EPU/ml）的步驟（1）所述的無血清培養(yǎng)基。

進一步，步驟（1）所述的含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基中DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量為12000mg/L。

進一步，所述培養(yǎng)介質(zhì)為多孔板、培養(yǎng)皿和/或培養(yǎng)瓶。

進一步，所述肝樣細胞以1.2～2×10⁴cells/cm²的密度接入膠原包被的培養(yǎng)介質(zhì)中。

本發(fā)明的積極效果是：

（1）提供了組分明確、可添加到商業(yè)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12中的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物。

（2）提供所述替代血清組合物的使用方法，其操作步驟簡單明確，能支持肝樣細胞體外無血清培養(yǎng)和擴增。

（3）能為肝樣細胞在藥物研究和臨床治療中的應(yīng)用提供積極的支持，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。

附圖說明

圖1是采用實施例1的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝樣細胞1天后的細胞形態(tài)圖。

圖2是采用實施例1的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝樣細胞4天后的細胞形態(tài)圖。

圖3是采用實施例1的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞合成白蛋白的檢測圖。

圖4是采用實施例1的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞糖原積累的檢測圖。

圖5是采用實施例1的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞脂質(zhì)攝取的檢測圖。

圖6是采用實施例2的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基與含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)肝樣細胞的生長曲線對比圖。

圖7是采用實施例2的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基與含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞白蛋白表達對比圖。

圖8是采用實施例3的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基與含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)肝樣細胞的擴增倍數(shù)對比圖。

圖9是采用實施例4的適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝樣細胞的生長圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖介紹本發(fā)明適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的具體實施方式，提供4個實施例。但是應(yīng)該指出，本發(fā)明的實施不限于以下的實施方式。

實施例1

一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的使用方法，其具體步驟如下：

（1）配制適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物

所述替代血清組合物含有多種維生素、氨基酸、細胞因子、蛋白、金屬離子、激素、脂肪酸和抗氧化劑，其各種組分的含量為（以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度計算，單位為毫克/升或微摩爾/升）：

半乳糖 1000mg/L；

丙酮酸鈉 100mg/L；

鳥氨酸 100mg/L；

脯氨酸 200mg/L；

轉(zhuǎn)鐵蛋白 5mg/L；

胰島素 15mg/L；

牛血清白蛋白 500mg/L；

TGF-α 0.02mg/L；

EGF 0.05mg/L；

ZnCl₂ 0.6mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 0.6mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.2mg/L；

MnSO₄ 0.01mg/L；

孕酮 0.007mg/L；

腎上腺酮 0.04mg/L；

三碘甲狀腺原氨酸 0.002mg/L；

地塞米松 8.0μM；

煙酰胺 500mg/L；

維生素H 2.0mg/L；

維生素A乙酸酯 0.3mg/L；

維生素E 1.0mg/L；

丁二胺 15.0mg/L；

乙醇胺 1.5mg/L；

亞硒酸鈉 0.02mg/L；

過氧化氫酶 1.0mg/L；

谷胱甘肽 2.0mg/L；

超氧化物歧化酶 3.0mg/L；

肉堿 1.0mg/L；

亞麻酸 2.0mg/L；

亞油酸 1.0mg/L；

將所述的替代血清組合物各成分按一定劑量加入DMEM/F12中，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量為12000mg/L，溶于超純水中；過濾除菌。

（2）培養(yǎng)介質(zhì)的準備

①將I型膠原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型膠原終濃度為0.1%（w/v），將溶解液用0.22μm濾膜過濾，然后向24孔板中加入50μl/cm² I型膠原溶解液。

②將步驟（2）①的24孔板敞蓋置于超凈臺中晾干。

③收集步驟②的24孔板前須用紫外線照射培養(yǎng)介質(zhì)30分鐘，待用。

（3）含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基的使用

①含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基在使用前，應(yīng)將盛裝該培養(yǎng)基的試劑瓶置于37℃恒溫箱中預(yù)熱15分鐘。

②將肝樣細胞重懸于含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基中，以2×10⁴cells/cm²的密度接入膠原包被的24孔板內(nèi)。

③將接種了肝樣細胞的24孔板置于37℃、5%CO₂、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1 天后開始觀察并記錄肝樣細胞的形態(tài)和生長情況；培養(yǎng)2天后換液；培養(yǎng)4天后觀察并記錄肝樣細胞的形態(tài)和生長情況，并檢測肝樣細胞的白蛋白合成、糖原積累和脂質(zhì)吸收（低密度脂蛋白，LDL）。

培養(yǎng)1天后肝樣細胞的形態(tài)參見圖1，培養(yǎng)4天后肝樣細胞的形態(tài)參見圖2，在培養(yǎng)過程中細胞均呈上皮樣。與培養(yǎng)1天的肝樣細胞相比，經(jīng)過4天體外培養(yǎng)的肝樣細胞數(shù)量有明顯的增長，這說明實施例1的含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基能夠維持肝樣細胞形態(tài)，支持肝樣細胞的體外生長。

對實施例1采用含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞的功能檢測為：

肝樣細胞白蛋白免疫熒光檢測結(jié)果見圖3，圖中亮色的部分表明培養(yǎng)的細胞具有合成白蛋白的能力。

肝樣細胞糖原PAS染色的結(jié)果見圖4，圖中深色的部分表明培養(yǎng)的細胞具有累積糖原的能力。

肝樣細胞DiI-ac-LDL染色的結(jié)果見圖5，圖中亮色的部分表明培養(yǎng)的細胞具有攝入低密度脂蛋白的能力。

上述功能檢測的結(jié)果反映出：肝樣細胞經(jīng)實施例1含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后仍具有合成白蛋白、儲存糖原和攝入脂質(zhì)的肝特異功能。

實施例2

一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的使用方法，其具體步驟如下：

（1）配制適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物

所述替代血清組合物各種組分的含量為（以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度計算，單位為毫克/升或微摩爾/升）：

半乳糖 3000mg/L；

丙酮酸鈉 100mg/L；

鳥氨酸 200mg/L；

脯氨酸 150mg/L；

轉(zhuǎn)鐵蛋白 7.0mg/L；

胰島素 11.0mg/L；

牛血清白蛋白 1000mg/L；

TGF-α 0.03mg/L；

EGF 0.03mg/L；

ZnCl₂ 0.5mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 0.7mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.3mg/L；

MnSO₄ 0.02mg/L；

孕酮 0.006mg/L；

腎上腺酮 0.03mg/L；

三碘甲狀腺原氨酸 0.003mg/L；

地塞米松 10.0μM；

煙酰胺 600mg/L；

維生素H 1.0mg/L；

維生素A乙酸酯 0.2mg/L；

維生素E 2.0mg/L；

丁二胺 15.0mg/L；

乙醇胺 1.5mg/L；

亞硒酸鈉 0.01mg/L；

過氧化氫酶 2.0mg/L；

谷胱甘肽 2.0mg/L；

超氧化物歧化酶 3.0mg/L；

肉堿 2.0mg/L；

亞麻酸 1.0mg/L；

亞油酸 1.0mg/L；

將所述的替代血清組合物各成分按一定劑量加入DMEM/F12中，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量同實施例1，溶于超純水中；過濾除菌。

（2）培養(yǎng)介質(zhì)的準備

（同實施例1）。

（3）含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基的使用（基本同實施例1）

①（同實施例1）。

②將肝樣細胞重懸于含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基中，以1.5×10⁴cells/cm²（等于3×10⁴cells/ml）的密度接入膠原包被的24孔板內(nèi)。

③將接種了肝樣細胞的24孔板置于37℃、5%CO₂、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天。8天中每天取24孔板中的3個孔，洗凈培養(yǎng)基，加入1ml PBS洗滌一遍，按100μl/cm²加入200μl 0.05%（w/v）胰酶消化，待細胞消化后，按1:1比例加入200μl含胰重組抑肽酶（10 EPU/ml）的上述無血清培養(yǎng)基；吹勻細胞懸液后，用血球計數(shù)板計數(shù)，繪制細胞生長曲線。設(shè)置對照組。所述對照組為采用含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基（Hui Lijian等開發(fā)的肝樣細胞含血清培養(yǎng)基，Cell Stem Cell. 2014, 14, 370-384）培養(yǎng)的肝樣細胞。

④肝樣細胞培養(yǎng)的8天中每2天取24孔板中的培養(yǎng)基上清液，用human albumin ELISA kit（bethyl）分別測定肝樣細胞培養(yǎng)2、4、6、8天時培養(yǎng)基上清液中白蛋白的含量。

對實施例2采用含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞的比較分析為：

（1）實施例2采用所述無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞與含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞的生長曲線對比情況見圖6。圖6結(jié)果表明：實施例2培養(yǎng)的肝樣細胞最高活細胞密度達29.1×10⁴cells/ml；含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞最高活細胞密度達32.1×10⁴cells/ml；肝樣細胞在上述兩種培養(yǎng)基中均能擴增10倍左右。因此，實施例2在采用所述的無血清培養(yǎng)基中肝樣細胞的擴增能力與在含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基中是基本相當?shù)摹?/p>

（2）實施例2采用所述無血清培養(yǎng)基與含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞白蛋白表達的對比情況見圖7。圖7結(jié)果表明：肝樣細胞在上述兩種培養(yǎng)基中白蛋白的表達量是基本相當?shù)摹?/p>

實施例3

一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的使用方法，其具體步驟如下：

（1）配制適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物

所述替代血清組合物各種組分的含量為（以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度計算，單位為毫克/升或微摩爾/升）：

半乳糖 2000mg/L；

丙酮酸鈉 120mg/L；

鳥氨酸 200mg/L；

脯氨酸 300mg/L；

轉(zhuǎn)鐵蛋白 10.0mg/L；

胰島素 20.0mg/L；

牛血清白蛋白 2500mg/L；

TGF-α 0.05mg/L；

EGF 0.05mg/L；

ZnCl₂ 0.5mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 0.8mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.4mg/L；

MnSO₄ 0.03mg/L；

孕酮 0.007mg/L；

腎上腺酮 0.04mg/L；

三碘甲狀腺原氨酸 0.004mg/L；

地塞米松 11.0μM；

煙酰胺 700mg/L；

維生素H 1.5mg/L；

維生素A乙酸酯 0.3mg/L；

維生素E 1.5mg/L；

丁二胺 17.0mg/L；

乙醇胺 2.0mg/L；

亞硒酸鈉 0.03mg/L；

過氧化氫酶 3.0mg/L；

谷胱甘肽 1.0mg/L；

超氧化物歧化酶 4.0mg/L；

肉堿 4.0mg/L；

亞麻酸 2.0mg/L；

亞油酸 2.0mg/L；

將所述的替代血清組合物各成分按一定劑量加入DMEM/F12中，無血清培養(yǎng)基中DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量和無血清培養(yǎng)基制備方法同實施例1。

（2）培養(yǎng)介質(zhì)的準備

①將I型膠原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型膠原終濃度為0.1%（w/v），將溶解液用0.22μm濾膜過濾，然后向培養(yǎng)皿中加入50μl/cm² I型膠原溶解液。

②將步驟（2）①的培養(yǎng)皿敞蓋置于超凈臺中晾干。

③收集步驟（2）②的培養(yǎng)皿前須用紫外線照射培養(yǎng)介質(zhì)30分鐘，待用。

（3）含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基的使用（基本同實施例1）

①（同實施例1）。

②將肝樣細胞以1×10⁵cells/ml（1.2×10⁴cells/cm²）的密度接入膠原包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，接種體積為10ml。

③將接種了肝樣細胞的培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO₂、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次液，培養(yǎng)4 天后進行傳代，每次傳代時對肝樣細胞進行計數(shù)。設(shè)置其對照組。所述對照組為采用含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞。

（4）體外培養(yǎng)的肝樣細胞的傳代：吸凈培養(yǎng)基后，加入5ml PBS洗滌一遍，之后吸凈PBS。在培養(yǎng)皿中按25μl/cm²加入2ml 0.05%（w/v）胰酶，置于37℃培養(yǎng)箱中消化5min。當輕拍培養(yǎng)皿即有細胞掉落時，在實施例3的無血清培養(yǎng)基的實驗組中加入2ml胰重組抑肽酶（10EPU/ml），而在含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基的對照組中按照1:1的比例加入含血清培養(yǎng)基，以終止消化。將懸液中的細胞聚團吹散后，加入離心管中，離心后棄去上清液，加入10ml含本發(fā)明的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基或者含有1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基，吹勻計數(shù)，并以1×10⁵cells/ml的密度接入膠原包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO₂、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)傳代，重復(fù)上述操作。

對實施例3采用所述無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞與含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞連續(xù)傳代時細胞增殖倍數(shù)的對比情況見圖8。圖8表明：肝樣細胞在實施例3的無血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代兩次，細胞增殖倍數(shù)分別為11.2±0.6和11.2±0.8倍。而在含1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基的對照組中，肝樣細胞的增殖倍數(shù)分別為11.6±0.4和12.0±0.6倍。因此，實施例3證明：在實施例3的無血清培養(yǎng)基中肝樣細胞是可以連續(xù)傳代的。此外，對于同一代次培養(yǎng)的肝樣細胞，在實施例3的無血清培養(yǎng)基中和在含有1%胎牛血清的HMM培養(yǎng)基中的擴增倍數(shù)無顯著差異。

實施例4

一種適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的使用方法，基本同實施例3。

所不同的是：

（1）配制適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物

所述替代血清組合物各種組分的含量為（以添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度計算，單位為毫克/升或微摩爾/升）：

半乳糖 2000mg/L；

丙酮酸鈉 110mg/L；

鳥氨酸 150mg/L；

脯氨酸 100mg/L；

轉(zhuǎn)鐵蛋白 10.0mg/L；

胰島素 10.0mg/L；

牛血清白蛋白 50mg/L；

TGF-α 0.05mg/L；

EGF 0.02mg/L；

ZnCl₂ 0.4mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 0.8mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.1mg/L；

MnSO₄ 0.03mg/L；

孕酮 0.005mg/L；

腎上腺酮 0.01mg/L；

三碘甲狀腺原氨酸 0.001mg/L；

地塞米松 11.0μM；

煙酰胺 700mg/L；

維生素H 2.0mg/L；

維生素A乙酸酯 0.1mg/L；

維生素E 2.0mg/L；

丁二胺 12.0mg/L；

乙醇胺 1.0mg/L；

亞硒酸鈉 0.03mg/L；

過氧化氫酶 3.0mg/L；

谷胱甘肽 1.5mg/L；

超氧化物歧化酶 2.0mg/L；

肉堿 1.0mg/L；

亞麻酸 1.5mg/L；

亞油酸 1.5mg/L；

將所述的替代血清組合物各成分按一定劑量加入DMEM/F12中，無血清培養(yǎng)基中DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量和無血清培養(yǎng)基配制方法同實施例1。

（2）培養(yǎng)介質(zhì)的準備

①將I型膠原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型膠原終濃度為0.1%（w/v），將溶解液用0.22μm濾膜過濾，然后向培養(yǎng)瓶中加入50μl/cm² I型膠原溶解液。

②將步驟（2）①的培養(yǎng)瓶在室溫下孵育2小時，之后將I型膠原溶液倒出，培養(yǎng)瓶用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后待用。

（3）含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基的使用（基本同實施例1）

①（同實施例1）。

②將肝樣細胞重懸于含適于肝樣細胞體外培養(yǎng)的替代血清組合物的培養(yǎng)基中，以1×10⁵cells/ml（1.3×10⁴cells/cm²）的密度接入膠原包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種體積為10ml。

③將接種了肝樣細胞的培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO₂、飽和水蒸氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換一次液，培養(yǎng)6天后收獲肝樣細胞。

（4）體外培養(yǎng)的肝樣細胞的收獲：吸凈培養(yǎng)上清液后，加入5ml PBS洗滌，之后吸凈PBS。在培養(yǎng)瓶中按40μl/cm²加入3ml 0.05%（w/v）胰酶，消化細胞。當細胞脫離培養(yǎng)瓶時，加入3ml胰重組抑肽酶（10EPU/ml）以終止消化。將懸液中的肝樣細胞聚團吹散，加入離心管中，離心后棄去上清液，加入10ml含本發(fā)明的替代血清組合物的無血清培養(yǎng)基，獲得細胞懸液。

對實施例4采用所述無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝樣細胞接種時和培養(yǎng)6后的細胞數(shù)對比情況見圖9。圖9結(jié)果表明：肝樣細胞在實施例4的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天，培養(yǎng)瓶中細胞數(shù)從接種時1×10⁶個增加到11.9×10⁶個。實施例4證明：在實施例4的無血清培養(yǎng)基中肝樣細胞可以生長并增殖。