專利名稱：通過用自體血清培養(yǎng)自體角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來生產(chǎn)用于生成皮膚的自體皮膚片 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于形成皮膚敷料或片的方法，所述皮膚敷料或片用于對(duì)患者中的皮膚損失進(jìn)行覆蓋、使其治愈、結(jié)斑、減輕。特別地，本發(fā)明涉及用于在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施的生產(chǎn)皮膚的方法。
背景技術(shù)：
目前，深度燒傷以及由不同創(chuàng)傷或疾病引起的其他皮膚組織損失造成皮膚損傷， 這些損傷需要對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行護(hù)理覆蓋。已經(jīng)用直接獲自患者自身皮膚的皮膚移植物實(shí)施這種覆蓋。該方法盡管有效，但在獲得所述移植物的區(qū)域(大腿、背部、臀部)中產(chǎn)生顯著的瘢痕(照片I)。此外，該方法必須在實(shí)施了全麻或局麻的外科手術(shù)中進(jìn)行，這產(chǎn)生了任何外科手術(shù)所固有的并發(fā)癥，例如嚴(yán)重的疼痛、感染、以及出血、新的手術(shù)、以及死亡(盡管百分率非常低)。此外，這還意味著較高的額外經(jīng)濟(jì)花費(fèi)，例如住院、為治愈而進(jìn)行的會(huì)診、 治療供體區(qū)域的瘢痕、用于手術(shù)的特殊材料以及將患者轉(zhuǎn)移到更綜合的醫(yī)院，等。
皮膚撕脫傷造成對(duì)皮膚上皮組織的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損失，其在體內(nèi)條件中被用成纖維細(xì)胞(其充當(dāng)飼養(yǎng)層(alimentadora))產(chǎn)生的纖維基質(zhì)替換。有多個(gè)報(bào)道涉及角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物用于構(gòu)建皮膚再生片，所有這樣的報(bào)道都述及供體所提供的或來自尸體的細(xì)胞(異體的)，這意味著對(duì)供體和受體兩者實(shí)施多項(xiàng)研究，培養(yǎng)在胎牛血清中，這使得該產(chǎn)品昂貴且在發(fā)展中國(guó)家中不可行，因此，角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物在患者自身的血清(自體的) 中發(fā)育，在作為飼養(yǎng)層的同一患者的成纖維細(xì)胞(自體的)上，并且使用同一患者的角質(zhì)形成細(xì)胞(自體的)，因此當(dāng)覆蓋出血的區(qū)域時(shí)避免了免疫和排斥反應(yīng)，因此提高了侵襲性過程中皮膚的生存力，并且通過該方法在非常短的時(shí)間內(nèi)獲得了完全的上皮化(皮膚生長(zhǎng))， 結(jié)果良好且成本很低。
因此，用于覆蓋受影響區(qū)域的替代機(jī)制一直是世界范圍內(nèi)的研究目標(biāo)。在該范圍內(nèi)，用于生成皮膚的方法尤為突出，其允許替換損失的皮膚并且避免整個(gè)前述創(chuàng)傷。到目前為止，已使用來自尸體的細(xì)胞開發(fā)了此類方法，但該方法有一些缺陷，因?yàn)槭褂脕碜允w的細(xì)胞在很多情況中產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這可產(chǎn)生組織排斥和令人不太滿意的結(jié)果。此外，這些方法的成本是非常高的，因?yàn)槭褂脕碜允w的皮膚意味著實(shí)施多種免疫相容性檢查等，以排除接觸傳染病(例如HIV和肝炎)的可能性。
發(fā)明簡(jiǎn)述
自2008年起，一組外科醫(yī)生和整形外科醫(yī)生開始了這樣的任務(wù)尋找用于生成皮膚而又避免前述并發(fā)癥的方法。因此，他們決定研究這樣的方法由受影響者的非常小份 (3mm)的皮膚生成皮膚，因此確保了使用所培養(yǎng)組織的益處并且避免了不相容風(fēng)險(xiǎn)、高成本和額外疤痕的缺點(diǎn)。
我們由取自患者皮膚的細(xì)胞生成皮膚的方法的優(yōu)點(diǎn)對(duì)于全世界的科學(xué)以及整形外科和醫(yī)學(xué)的未來具有非常重要的意義。其中，重要的是突出以下優(yōu)點(diǎn)
1.該方法不生成除皮膚損傷以外的額外疤痕，因?yàn)閺幕颊咧斜M可能少地且從不可見的位置取出皮膚。
2.不引起患者的創(chuàng)傷，因此不產(chǎn)生疼痛。
3.不具有免疫排斥問題，因?yàn)樗褂玫慕M織取自同一患者。
4.不需要將該方法作為手術(shù)實(shí)施。
5.該方法可由任何專業(yè)的護(hù)士和醫(yī)生來操作。
6.治療患者的醫(yī)院不必要求用于取皮膚的特殊材料(稱為取皮機(jī)(Dermatome)) 及其切割儀器，因?yàn)閮H可使用一次，所以它們成本不利。這些產(chǎn)品對(duì)于本發(fā)明的皮膚培養(yǎng)方法來說不是必須的。
7.生產(chǎn)成本比來自尸體的皮膚便宜約80%，并且美學(xué)結(jié)果要好得多。
8.生產(chǎn)和經(jīng)銷成本比在20X20cm面積上外科操作的成本低50%。
經(jīng)過基本的培訓(xùn)之后，該方法在世界上任何地方(包括發(fā)展中國(guó)家)都是可重復(fù)的，因?yàn)樗兴褂玫牟牧鲜侨魏螌?shí)驗(yàn)室中常用且基本的那些。
下文中給出的簡(jiǎn)要比較分析將顯示鑒于本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案的現(xiàn)有技術(shù)。所述分析的目標(biāo)是突出本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，其賦予用于獲得請(qǐng)求保護(hù)之專利主題的必要特征。
有充足的文獻(xiàn)說明現(xiàn)有技術(shù)，其中很詳細(xì)地描述了所使用的方法并且以所引用的文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，可與實(shí)現(xiàn)上述公開結(jié)論的本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的比較。下文中將給出所述參考文獻(xiàn)，其可供參考。
自很久以前就開發(fā)了用于細(xì)胞培養(yǎng)物的不同方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)物用作出血皮膚區(qū)域的覆蓋物和/或皮膚代用品。本發(fā)明產(chǎn)品的新穎性在于使用同一患者的血清(自體的)由自體細(xì)胞產(chǎn)生，在僅三天內(nèi)獲得皮膚的層。在另一種方法中，我們發(fā)現(xiàn)
1.人皮膚等同物
A.供體或尸體細(xì)胞培養(yǎng)物
該方法不同于本發(fā)明中所開發(fā)的方法，在于樣品由尸體或供體的皮膚部分提供， 并且通過低溫和防腐處理需要多種化學(xué)物質(zhì)和化合物，儲(chǔ)存冷凍的皮膚部分用于以后在對(duì)其有需要的患者中應(yīng)用。這需要對(duì)供體和患者的免疫研究以降低排斥風(fēng)險(xiǎn)。主要差異在于
權(quán)利要求
1.一種利用皮膚產(chǎn)生片或敷料的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟I-*第0天A-獲得自體皮膚和血液樣品；B-消化所述皮膚18小時(shí)；C-從患者的血液中獲得自體血清；II-*第1天D-將自體皮膚的兩層分離；E-將在消化之后獲得的獲自自體皮膚淺表層的角質(zhì)形成細(xì)胞在自體血清中培養(yǎng)和復(fù) 制 72h ；F-培養(yǎng)和復(fù)制在消化之后所產(chǎn)生的獲自深層的自體成纖維細(xì)胞；III-*第 2 天G-更換自體角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基；IV-*第3天H-將成纖維細(xì)胞接種在膠原網(wǎng)上；I-將所培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞在成纖維細(xì)胞和膠原網(wǎng)上接種24h ；V-*第4天J-獲得用于將其自身放置在對(duì)其有需要的個(gè)體上的最終產(chǎn)品例如皮膚片或敷料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟I-A包括以下步驟.1.從患者獲得皮膚樣品，其具有2mm2至4mm2、優(yōu)選3mm2的面積和0.30mm至0. 65mm的厚度，.2.從需要所述(自體的)皮膚的個(gè)體獲得量為約20 50cm3的血液樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2之一所述的方法，其特征在于所述步驟I-B包括以下步驟.3.用約2cm3至10cm3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗所獲得的皮膚樣品；.4.在4°C下將所述自體皮膚樣品在0.25%胰蛋白酶溶液中放置18小時(shí)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-C包括以下步驟.5.將所述自體血液樣品以1200rpm離心10分鐘，獲得10cm3至25cm3血漿；.6.在4°C下儲(chǔ)存所述血漿；.7.通過添加2cm3至5cm3DMEM_HG(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基-高葡萄糖)、2cm3 至5cm3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和0.5cm3至2cm3 10, 0001. U.青霉素、10mg硫酸鏈霉素以及 25/-lg兩性霉素B使所應(yīng)用的胰蛋白酶失活。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-D包括以下步驟.8.隨后在鑷子的幫助下將自體皮膚(外植體)分離成兩層淺表的表皮和包含膠原纖 維的深層真皮；.9.用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)分別清洗所述外植物(兩個(gè)皮膚層)多次(3至10次)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-E包括以下步驟.10.將皮膚的淺表部分收集在無菌管中；.11.將所述管以1200rpm離心10分鐘；.12.棄去上清液；.13.將所產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀重懸于5cm3至10cm3DMEM-HG培養(yǎng)基(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基_高葡萄糖)中；.14.將包含在該液體中的細(xì)胞以約75，000至90，000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在無菌盒中；.15.通過在Neubawer室中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來核實(shí)細(xì)胞密度；.16.將所接種的細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)在37°C下儲(chǔ)存24小時(shí)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-F包括以下步驟 10’ -在步驟9之后，將在消化之后獲得的自體皮膚的深部接種到無菌盒中；.11’ -添加2cm3至5cm3DMEM_HG (Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基-高葡萄糖)和2cm3至 5cm3從需要皮膚之個(gè)體的血液中獲得的血漿；.12’ -將所得物在37°C下儲(chǔ)存48小時(shí)以使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)；.13’ -在48小時(shí)之后將所接種和儲(chǔ)存的成纖維細(xì)胞提取并放置在無菌管中；.14，-將所述管以1200rpm離心10分鐘；.15’ -棄去上清液；.16’-向細(xì)胞沉淀中添加2cm3至5cm3DMEM_HG(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基-高葡萄 糖)和2cm3至5cm3從需要皮膚之個(gè)體的血液中獲得的自體血漿。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-G包括以下步驟.17.儲(chǔ)存24小時(shí)之后提取角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；.18.再次應(yīng)用2cm3至5cm3DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基-高葡萄糖)以及 lcm3至10cm3自體血衆(zhòng)(源自患者的血液)；.19.再次在37°C下儲(chǔ)存24小時(shí)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-H包括以下步驟.20.將步驟16’中所獲得的產(chǎn)品接種在所需大小的膠原網(wǎng)上；.21.核實(shí)自體成纖維細(xì)胞具有90%融合；.22.將該網(wǎng)置于振動(dòng)臺(tái)上最少4小時(shí)；.23.再次在37°C下儲(chǔ)存最少20小時(shí)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I-I包括以下步驟.24.在更換培養(yǎng)基并對(duì)其進(jìn)行儲(chǔ)存24小時(shí)之后，使用2cm3至10cm3磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)從所述盒中分離角質(zhì)形成細(xì)胞；.25.將具有細(xì)胞的該液體放置在無菌管中并以1200rpm離心10分鐘；.26.棄去由離心所產(chǎn)生的上清液；.27.將細(xì)胞沉淀重懸于5cm3至10cm3自體血漿中；..28.將浸入血漿中的角質(zhì)形成細(xì)胞接種到成纖維細(xì)胞和膠原網(wǎng)上，同時(shí)核實(shí)它們具有 250，000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度；.29.將所接種的細(xì)胞在37°C下儲(chǔ)存24小時(shí)；.30.然后觀察融合和細(xì)胞在膠原敷料上的附著從而獲得充足的自體組織皮膚層。
11.一種片或敷料，其特征在于其包含網(wǎng)基質(zhì)，在所述網(wǎng)基質(zhì)上放置膠原，隨后放置角 質(zhì)形成細(xì)胞并且隨后放置成纖維細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的片或敷料，其特征在于使用權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方 法產(chǎn)生所述角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
全文摘要
該方法一般是基于從患者取皮膚樣品和血液樣品并且基于這兩種要素培養(yǎng)皮膚，置于膠原片上以產(chǎn)生敷料，隨后將所述敷料置于對(duì)其有需要的患者上。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103003415SQ201080067724
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者胡安·卡洛斯·桑布拉諾比格爾, 珍妮弗·克里斯蒂娜·高納席爾瓦 申請(qǐng)人:羅德里戈·福西翁·索托帕雷哈, 胡安·卡洛斯·桑布拉諾比格爾, 珍妮弗·克里斯蒂娜·高納席爾瓦