本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及基因工程干擾素蛋白的凍干制劑生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種重組豬干擾素γ成品凍干制劑的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著近年來全球肉豬養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，我國養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模位于世界前列。然而，養(yǎng)豬業(yè)還存在很多問題，如豬口蹄疫病毒(FMDV)、藍(lán)耳病病毒(PRRSV)和非洲豬瘟病毒(ASFV)，每年都會在不同的季節(jié)暴發(fā)，這些動物一旦感染發(fā)病，具有發(fā)病急、臨床癥狀嚴(yán)重、極易傳播擴散以及病死率和死亡率均較高的特點，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失；目前豬類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復(fù)雜，毒株變異快，其次當(dāng)前還存在疫苗免疫后對部分機體產(chǎn)生的保護力不夠，常導(dǎo)致疫苗免疫失敗。

目前針對豬傳染病常用的藥物治療主要采用人用抗生素和抗病毒化學(xué)藥物進行治療，但是引起的食品藥物殘留問題，給人類健康帶來威脅。干擾素-γ可以作為新型生物佐劑能夠很好的提高當(dāng)前豬疫苗保護力。因此，使用無任何毒副作用的干擾素來治療和預(yù)防豬類病毒性疾病，同時利用重組豬干擾素-γ作為豬類疫苗的佐劑將是當(dāng)前較為關(guān)注的問題。

干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)對干擾素基因核酸序列分析，發(fā)現(xiàn)干擾素是存在于生物體內(nèi)的一種古老的保護因子，而且普遍存在于生物體中。自從Issacs等于1957年發(fā)現(xiàn)干擾素以來，已經(jīng)證明不論高等動物還是低等動物都有干擾素類似物質(zhì)產(chǎn)生。已有研究發(fā)現(xiàn)，由于IFN-γ的免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤獨特作用，重組豬干擾素γ在體外不但能有效抑制豬口蹄疫病毒(FMDV)、藍(lán)耳病病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒、流感病毒和非洲豬瘟病毒(ASFV)的繁殖，同時還對免疫抑制豬具有良好免疫調(diào)節(jié)作用，可有效增強某些疫苗的免疫效果。研究結(jié)果進一步證實，IFN-γ在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測等方面起著重大作用，是現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。

目前重組豬干擾素γ在大腸埃希菌中表達(dá)已有報道，但是工藝均為發(fā)酵菌體中包涵體表達(dá)目的蛋白，導(dǎo)致生產(chǎn)過程中需要對包涵體表達(dá)的蛋白進行變性和復(fù)性，導(dǎo)致生產(chǎn)工藝較復(fù)雜且成本較高，制約了其在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供了一種重組豬干擾素γ成品凍干制劑的制備工藝，重組豬干擾素γ在大腸埃希工程菌菌體破碎后上清中表達(dá)的制備生產(chǎn)工藝，免去了由包涵體形式表達(dá)蛋白需要變性和復(fù)性的制備過程，同時對每一步的制備及生產(chǎn)過程建立了詳細(xì)的技術(shù)參數(shù)以及相應(yīng)的質(zhì)量控制體系，為重組豬干擾素γ產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種重組豬干擾素γ成品凍干制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

(1)以重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種為原料，培養(yǎng)后得到一級生產(chǎn)種子，所述BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌的基因序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示；

(2)將一級生產(chǎn)種子再次培養(yǎng)至OD值為0.8～1.2，制得二級種子菌液；

(3)二級種子菌液經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá)后，離心，得到濕菌體；

(4)濕菌體破碎，離心收集上清液，即得粗制重組豬干擾素γ；

(5)粗制重組豬干擾素γ先后經(jīng)親和層析純化和離子交換層析純化后，即可得到純化后的重組豬干擾素γ；

(6)純化后的重組豬干擾素γ中加入凍干保護劑，真空冷凍干燥，即可得到重組豬干擾素γ成品凍干制劑。

進一步地，所述步驟(5)后還包含對純化后的重組豬干擾素γ進行效價測定、蛋白質(zhì)含量檢測、比活性檢測、純度測定和分子量檢測。

進一步地，所述步驟(1)具體包括以下步驟：開啟表達(dá)重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種一支，加無菌生理鹽水2ml緩沖液溶解成菌懸液，四區(qū)劃線法接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)18～30小時，挑取單個菌落，接種LB固體培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)18～30小時，用LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔，加入30％～40％菌液體積的無菌甘油，定量分裝成1ml/瓶，即可得到一級生產(chǎn)種子。

進一步地，所述步驟(2)具體包括以下步驟：取出一級BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生產(chǎn)種子，置室溫30～40min后，接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)18～30小時，用LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔，按菌液與LB液體培養(yǎng)基體積比1∶10～15接種LB液體培養(yǎng)基，以180～3000r/min的轉(zhuǎn)速37℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD值為0.8～1.2，即可制得二級種子菌液供發(fā)酵罐接種用。

進一步地，所述步驟(3)具體包括以下步驟：配制LB液體培養(yǎng)基，高壓在位滅菌，按培養(yǎng)基量的10％～20％接種二級種子菌液，37℃條件下發(fā)酵，控制pH值為7.0～7.2，通過攪拌速度及通氣量控制溶氧>30％，每小時取樣檢測菌體OD_600nm值，待菌液的OD_600nm值達(dá)到0.6～1.0時加入終濃度為1mmol/L的IPTG，調(diào)整培養(yǎng)溫度至30～32℃，開始誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4～6小時后2～8℃條件下以4000～8000r/min離心15～30min，濕菌體稱重，-20℃凍存。

進一步地，所述步驟(4)具體包括以下步驟：用10～15％菌液體積的10mmol/L pH＝7.2的PBS重懸濕菌體，以壓力800～1500bar的高壓細(xì)胞破碎機破碎，連續(xù)破碎兩次后，再將該懸液置2～8℃條件下，以8000～12000r/min離心10～30min，取上清后，重復(fù)離心一次，收集上清液即得粗制重組豬干擾素γ。

進一步地，所述步驟(5)中，親和層析純化所用洗脫液為10mmol/L pH＝7.2的PBS和300mmol/L咪唑組成的混合液，其pH為8.0。

進一步地，所述步驟(5)中，離子交換層析純化使用25mMTris-HCl和1M NaCl組成的混合溶液進行梯度洗脫，其pH為8.0。

進一步地，所述步驟(6)中具體包括以下步驟：將純化后的重組豬干擾素γ用2～3倍體積10mmol/L pH＝7.2的PBS稀釋后加入終濃度5％體積濃度的甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖凍干保護劑混勻后，以7ml西林瓶分裝，分裝規(guī)格為2.2ml/瓶，半成品經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗、無菌試驗。在生物制品的冷凍干燥過程中，甘露醇一般用作填充劑，在慢速凍結(jié)時會結(jié)晶，從而為活性組分提供支撐結(jié)構(gòu)，而且甘露醇也不會與活性組分發(fā)生反應(yīng)；甘油作為作低溫保護劑比較適合蛋白類生物制品的保護；葡萄糖與蛋白質(zhì)活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，對蛋白質(zhì)活性起保護作用。

進一步地，所述步驟(6)中，真空冷凍干燥的參數(shù)為：半成品分裝后在-40～-30℃的條件下冷凍真空干燥：首先將擱架溫度降溫到-10～-15℃，保持30min～60min，繼續(xù)降溫至-20℃保持30min～60min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并將擱板溫度加熱至-25℃進行一次干燥，保持3～5h得到白色干燥物，隔板逐漸升溫至25～30℃，維持4h，將安瓿瓶壓塞封口，鋁塑蓋壓蓋后保存于2～8℃。

本發(fā)明所制的重組豬干擾素γ成品凍干制劑是一類能誘導(dǎo)豬類細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子及提高機體對抗原的反應(yīng)能力，增強疫苗免疫效果，可采用肌肉注射的方式給藥，治療周期短，療效迅速，能夠用于豬口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬藍(lán)耳病毒和豬流感病毒性疾病的防治，同時也可以作為疫苗的佐劑進行一定比例的配方添加提高疫苗的保護力。

本發(fā)明的優(yōu)點是：使用本發(fā)明提供的制備方法得到的重組豬干擾素γ凍干制劑產(chǎn)品，無論是在純度、蛋白含量、效價和內(nèi)毒素等方面均可達(dá)到獸用生物制品的要求，且生產(chǎn)工藝適合規(guī)?；a(chǎn)。

附圖說明

圖1為發(fā)酵破碎菌體離心后表達(dá)的重組豬干擾素γ蛋白SDS-PAGE圖；M：蛋白Marker；1：空載；2：發(fā)酵破碎后全菌；3：發(fā)酵破碎后上清；4：發(fā)酵破碎后包涵體；

圖2A為重組豬干擾素γ親和層析純化色譜圖；

圖2B為重組豬干擾素γ離子交換層析純化色譜圖；

圖3為重組豬干擾素γ原液純化前后SDS-PAGE圖；M：蛋白Marker；1：重組豬干擾素γ原液；2：重組豬干擾素γ親和層析純化后樣品；3：重組豬干擾素γ離子交換層析洗脫樣(雜蛋白)；4：重組豬干擾素γ離子交換層析純化后目的蛋白樣；

圖4為重組豬干擾素γ原液HPLC檢測純度色譜圖；

圖5為重組豬干擾素γ成品免疫印跡檢測結(jié)果圖；M：蛋白Marker；1：重組豬干擾素γ成品；

圖6為重組豬干擾素γ成品生物學(xué)活性檢測結(jié)果圖；A1～A10為2倍梯度稀釋安徽九川生物科技有限公司重組豬干擾素γ凍干粉針劑企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中第1列為將樣品稀釋10000倍加入第1孔；B1～B10/C1～C10/D1～D10為A1～A10復(fù)孔；11列：PK-15細(xì)胞對照；V列：VSV病毒對照。

具體實施方式

下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明，但這并不僅限于本發(fā)明的范圍。

LB液體培養(yǎng)基的配制方法為：胰化蛋白胨100g；酵母提取物50g；氯化鈉100g用8L純水溶解后，加5M NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加入純水至總體積10L。

重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種的構(gòu)建方法如下：

(1)構(gòu)建克隆載體

特異性PCR引物如下：上游：5'-GCA GGATCC ATGAGTTATACAAC-3’

下游：5'-AAC CTCG AG TTTTGATGCTCTCT-3’

利用設(shè)計的特異性引物進行PCR獲得豬干擾素γ的目的基因，并將目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector并轉(zhuǎn)化至JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進行目的基因PCR驗證，同時進行雙酶切鑒定，根據(jù)實驗結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽性質(zhì)粒進行目的基因測序；

(2)構(gòu)建豬γ干擾素表達(dá)工程菌

鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-32a進行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別進行培養(yǎng)，鑒定出表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌進行放大培養(yǎng)。并加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)劑低溫誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)用抗豬干擾素γ陽性血清做中和實驗，證明型別無誤，成功構(gòu)建重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌。并將重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌加入終濃度為10％的脫脂奶粉，分裝成2mL/支的溶液，真空冷凍干燥后制成重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種，其基因序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

實施例1

1.1原液制造與檢測

1.1.1一級生產(chǎn)種子繁殖

開啟表達(dá)重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種1支，加無菌生理鹽水2ml溶解成菌懸液，劃線接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24小時，挑取單個菌落，接種LB斜面，37℃培養(yǎng)24小時，用LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔，按30％加入無菌甘油，定量分裝成1ml/瓶。

1.1.2二級生產(chǎn)種子繁殖

取出一級BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生產(chǎn)種子1支，置室溫30min后，劃線接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24小時，用LB培養(yǎng)基洗下菌苔，按1∶10接種LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩(300r/min)培養(yǎng)至OD值0.8，即可供發(fā)酵罐接種用。

1.1.3發(fā)酵

配制LB液體培養(yǎng)基，高壓滅菌，此時罐體應(yīng)在位滅菌。按培養(yǎng)基量的10％接種二級種子菌液，37℃條件下發(fā)酵?？刂苝H值為7.0，通過攪拌速度及通氣量控制溶氧>30％。每小時取樣檢測菌體OD_600nm值。待菌液的OD_600nm值達(dá)到0.6時加入終濃度為1mmol/L IPTG，調(diào)整培養(yǎng)溫度至32℃，開始誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)5小時后4℃條件下以4000r/min離心15min，濕菌體稱重，-20℃凍存，并同時在容器上標(biāo)明批號、罐別、重量和日期。發(fā)酵液滅菌后棄去。取少量菌體作SDS-PAGE電泳，電泳膠掃描后用軟件分析目的蛋白的分子量與理論值一致(34kD)，目的蛋白的表達(dá)水平不低于40％(圖1)。

1.1.4破碎

用10％菌液體積的10mmol/L pH＝7.2的PBS重懸菌體，以壓力1000bar的高壓細(xì)胞破碎機破碎細(xì)菌，連續(xù)破碎兩次后，再將該懸液置4℃條件下，以12000r/min離心10min，取上清后，重復(fù)離心一次，收集上清液。

1.1.5純化

采用GE Healthcare公司Chelating Sepharose ^TM Fast Flow鎳離子螯合親和層析填料自行裝柱，用3個柱體積的純水清洗Ni²⁺螯合親和層析柱，再用Binding Buffer(10mmol/L PBS，25mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡2～3個柱體積，在線檢測電導(dǎo)率值及280nm波長吸收值，待兩者都穩(wěn)定后開始上樣，將粗制重組豬干擾素γ采用上樣泵上樣過層析柱(流速6ml/min)，再用Binding Buffer過層析柱，洗去未與層析柱結(jié)合的雜蛋白，直到A280穩(wěn)定。再用Elution Buffer(10mmol/L pH＝7.2的PBS，300mmol/L咪唑，pH 8.0)收集洗脫下來的蛋白吸收峰，將此步得到的重組豬干擾素γ過脫鹽柱，用緩沖液(25mMTris-HCl，pH＝8.0)置換，準(zhǔn)備下一步離子交換層析。使用Binding buffer(25mM Tris-HCl，pH＝8.0)平衡好柱子，上樣后用Elution buffer(25mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0)梯度洗脫，收集干擾素峰，即為純化后的重組豬干擾素γ原液(圖2)。

1.1.6原液檢測

效價測定：采用“微量細(xì)胞病變抑制法”，豬腎細(xì)胞(PK-15)/VSV檢測系統(tǒng)，采用PK-15/VSV病毒系統(tǒng)，效價為1.6×10⁶單位/ml。

蛋白質(zhì)含量檢測：Lowry法檢測蛋白含量為1.2mg/ml。

比活性檢測：比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，計算得比活性為1.3×10⁶單位/mg。

純度測定：純度采取SDS-PAGE和HPLC同步檢測，檢測結(jié)果均大于95％(圖3、圖4)。

分子量檢測：分離膠濃度為15％，加樣量不小于10μg，同時用已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品作對照，制品的分子量為34kD。

1.2半成品制備與檢測

1.2.1半成品制備

將上步所得的重組豬干擾素γ原液用3倍體積10mmol/L PBS稀釋后加入終濃度5％(體積濃度)甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖凍干保護劑混勻后，以7ml西林瓶分裝，分裝規(guī)格為2.2ml/瓶，半成品經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗、無菌試驗。

1.2.2半成品檢定

細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗：

參照《中華人民共和國獸藥典》2010版一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法”進行檢驗，重組豬干擾素γ中內(nèi)毒素含量為14EU/ml。

無菌試驗：

參照《中華人民共和國獸藥典》2010版附錄“無菌檢測或純粹檢測法”進行，無菌實驗符合規(guī)定。

1.3成品制備與檢測

1.3.1成品制備

將上述1.2.1制得的半成品分裝后在在-40～-30℃的條件下冷凍真空干燥：首先將擱架溫度降溫到-10℃，保持30min，繼續(xù)降溫至-20℃保持30min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并將擱板溫度加熱至-25℃進行一次干燥，保持3h得到白色干燥物，隔板逐漸升溫至25℃，維持4h，將安瓿瓶壓塞封口，鋁塑蓋壓蓋。包裝按照獸用生物制品的標(biāo)簽、說明書與包裝的規(guī)定。

1.3.2成品檢定

性狀：

成品為白色或淡黃色疏松體，加入注射用水后迅速復(fù)溶為澄明液體。

無菌檢驗：

無菌實驗參照《中華人民共和國獸藥典》2010版附錄“無菌檢測或純粹檢測法”進行，無菌生長。

鑒別檢驗:

與商品化重組豬干擾素γ單克隆抗體經(jīng)免疫印跡法測定，結(jié)果為陽性(圖5)。

安全檢驗:

重組豬干擾素γ溶于2ml生理鹽水中，用10日齡SPF豬10只，各肌肉注射重組豬干擾素γ2ml，觀察10日，全部健活，不出現(xiàn)異常反應(yīng)。

效價測定：

按照細(xì)胞病變抑制法進行，采用PK-15細(xì)胞/VSV病毒系統(tǒng)，效價檢測結(jié)果為1.6×10⁶單位/支(圖6)。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗：

內(nèi)毒素檢測參照《中華人民共和國獸藥典》2010版一部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法”進行檢驗，每瓶重組豬干擾素γ中內(nèi)毒素含量為8EU。

剩余水份測定：

水分測定參照《中華人民共和國獸藥典》2010版三部附錄“剩余水分測定法”，含水量為2.1％。

真空度測定：

真空度檢測參照《中華人民共和國獸藥典》2010版三部附錄“真空度測定法”，真空度符合獸藥典規(guī)定。

實施例2

2.1原液制造與檢測

2.1.1一級生產(chǎn)種子繁殖

開啟表達(dá)重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種1支，加無菌生理鹽水2ml溶解成菌懸液，劃線接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)28小時，挑取單個菌落，接種LB斜面，37℃培養(yǎng)28小時，用LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔，按32％加入無菌甘油，定量分裝成1ml/瓶。

2.1.2二級生產(chǎn)種子繁殖

取出一級BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生產(chǎn)種子1支，置室溫35min后，劃線接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)28小時，用LB培養(yǎng)基洗下菌苔，按1∶11接種LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩(280r/min)培養(yǎng)至OD值0.9，即可供發(fā)酵罐接種用。

2.1.3發(fā)酵

配制LB液體培養(yǎng)基，高壓滅菌，此時罐體應(yīng)在位滅菌。按培養(yǎng)基量的14％接種二級種子菌液，37℃條件下發(fā)酵，控制pH值為7.0～7.2，通過攪拌速度及通氣量控制溶氧>30％。每小時取樣檢測菌體OD_600nm值。待菌液的OD_600nm值達(dá)到0.8時加入終濃度為1mmol/L IPTG，調(diào)整培養(yǎng)溫度至32℃，開始誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)4小時后5℃條件下以6000r/min離心20min，濕菌體稱重，-20℃凍存，并同時在容器上標(biāo)明批號、罐別、重量和日期。發(fā)酵液滅菌后棄去。取少量菌體作SDS-PAGE電泳，電泳膠掃描后用軟件分析目的蛋白的分子量與理論值一致(34kD)，目的蛋白的表達(dá)水平不低于40％(圖1)。

2.1.4破碎

用12％菌液體積的10mmol/L PBS pH＝7.2的重懸菌體，以壓力900bar的高壓細(xì)胞破碎機破碎細(xì)菌，連續(xù)破碎兩次后，再將該懸液置2℃條件下，以8000r/min離心25min，取上清后，重復(fù)離心一次，收集上清液。

2.1.5純化與檢測

采用與實施例1中步驟1.1.5相同的方法純化，并對原液進行效價測定、蛋白質(zhì)含量檢測、比活性檢測、純度測定和分子量檢測。

2.2半成品制備與檢測

2.2.1半成品制備

將上步所得的重組豬干擾素γ原液2.5倍體積10mmol/L PBS稀釋后加入終濃度5％甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖凍干保護劑混勻后，以7ml西林瓶分裝，分裝規(guī)格為2.2ml/瓶，半成品經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗、無菌試驗。

2.3成品制備與檢測

將上述1.2.1制得的半成品分裝后在-40～-30℃的條件下冷凍真空干燥：首先將擱架溫度降溫到-12℃，保持45min，繼續(xù)降溫至-20℃保持45min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并將擱板溫度加熱至-25℃進行一次干燥，保持4h得到白色干燥物，隔板逐漸升溫至28℃，維持4h，將安瓿瓶壓塞封口，鋁塑蓋壓蓋。包裝按照獸用生物制品的標(biāo)簽、說明書與包裝的規(guī)定。制得的成品進行性狀、無菌檢驗、鑒別檢驗、安全檢驗、效價測定、細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗、剩余水份測定和真空度測定。

實施例3

3.1原液制造與檢測

3.1.1一級生產(chǎn)種子繁殖

開啟表達(dá)重組豬干擾素γ的BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌基礎(chǔ)種子批凍干菌種1支，加無菌生理鹽水2ml溶解成菌懸液，劃線接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)26小時，挑取單個菌落，接種LB斜面，37℃培養(yǎng)26小時，用LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔，按36％加入無菌甘油，定量分裝成1ml/瓶。

3.1.2二級生產(chǎn)種子繁殖

取出一級BL21/pET-32a-rPoIFNγ工程菌生產(chǎn)種子1支，置室溫35min后，劃線接種LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)26小時，用LB培養(yǎng)基洗下菌苔，按1∶12接種LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩(300r/min)培養(yǎng)至OD值1.0，即可供發(fā)酵罐接種用。

3.1.3發(fā)酵

配制LB液體培養(yǎng)基，高壓滅菌，此時罐體應(yīng)在位滅菌。按培養(yǎng)基量的20％接種二級種子菌液，37℃條件下發(fā)酵，控制pH值為7.2，通過攪拌速度及通氣量控制溶氧>30％。每小時取樣檢測菌體OD_600nm值。待菌液的OD_600nm值達(dá)到1.0時加入終濃度為1mmol/L IPTG，調(diào)整培養(yǎng)溫度至32℃，開始誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)5.5小時后2℃條件下以8000r/min離心25min，濕菌體稱重，-20℃凍存，并同時在容器上標(biāo)明批號、罐別、重量和日期。發(fā)酵液滅菌后棄去。取少量菌體作SDS-PAGE電泳，電泳膠掃描后用軟件分析目的蛋白的分子量與理論值一致(34kD)，目的蛋白的表達(dá)水平不低于40％(圖1)。

3.1.4破碎

用15％菌液體積的10mmol/L PBS重懸菌體，以壓力1000bar的高壓細(xì)胞破碎機破碎細(xì)菌，連續(xù)破碎兩次后，再將該懸液置3℃條件下，以10000r/min離心15min，取上清后，重復(fù)離心一次，收集上清液。

3.1.5純化與檢測

采用與實施例1中步驟1.1.5相同的方法純化，并對原液進行效價測定、蛋白質(zhì)含量檢測、比活性檢測、純度測定和分子量檢測。

3.2半成品制備與檢測

3.2.1半成品制備

將上步所得的重組豬干擾素γ原液用2.6倍體積10mmol/L PBS稀釋后加入終濃度5％甘油、0.12g/ml甘露醇和0.025g/ml蔗糖凍干保護劑混勻后，以7ml西林瓶分裝，分裝規(guī)格為2.2ml/瓶，半成品經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗、無菌試驗。

3.3成品制備與檢測

將上述1.2.1制得的半成品分裝后在-40～-30℃的條件下冷凍真空干燥：首先將擱架溫度降溫到-15℃，保持60min，繼續(xù)降溫至-20℃保持60min，之后在-35℃保持1.5h，抽真空并將擱板溫度加熱至-25℃進行一次干燥，保持3～5h得到白色干燥物，隔板逐漸升溫至30℃，維持4h，將安瓿瓶加塞封口。制得的成品進行性狀、無菌檢驗、鑒別檢驗、安全檢驗、效價測定、細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗、剩余水份測定和真空度測定。

實施例4

重組豬干擾素γ成品凍干制劑對豬藍(lán)耳病毒的治療作用

合肥市郊區(qū)某養(yǎng)豬場2015年暴發(fā)疑似豬藍(lán)耳病毒，主要臨床表現(xiàn)為呼吸道癥狀，呼吸困難，有時呈腹式呼吸，食欲減退或廢絕，體溫升高到40℃以上，腹瀉。被毛粗亂，共濟失調(diào)，漸進性消瘦，眼瞼水腫。少部分仔豬可見耳部、體表皮膚發(fā)紫。將10頭發(fā)病斷奶仔豬隨機分為兩組，A組為“重組豬干擾素γ成品凍干制劑”治療組，豬干擾素凍干劑型采用實施例2方法制備；B組為對照組，用生理鹽水治療，，A組以肌肉注射方式給予“重組豬干擾素γ成品凍干制劑”100萬單位/頭，每天1次，連用3天；B組給予生理鹽水2ml/頭，每天1次，連用3天，用藥后，A組豬1天后病情開始好轉(zhuǎn)，3天后未見豬只死亡。B組豬出現(xiàn)癥狀第2天后病情惡化，開始出現(xiàn)死亡，第3天達(dá)到死亡高峰，死亡率達(dá)到25％，說明以肌肉注射方式給予“重組豬干擾素γ成品凍干制劑”對豬新城疫有一定的治療作用。

實施例5

重組豬干擾素γ成品凍干制劑攻毒保護試驗

將10頭10日齡的SPF豬用人工感染豬流行性腹瀉病毒的方法使仔豬發(fā)病，同時設(shè)置模型對照組。經(jīng)口飼喂的方式攻毒SPF仔豬，在攻毒18h后，臨床癥狀為嘔吐和水樣腹瀉，病豬精神沉郁，食欲減退，此時給藥組仔豬給予肌肉注射重組豬干擾素γ1.0×10⁶單位/頭，每日一次，連續(xù)注射3天。模型對照組給予等量的生理鹽水。3天后治療組仔豬腹瀉嘔吐好轉(zhuǎn)，由水樣糞便變成半成型，食欲恢復(fù)，精神狀態(tài)恢復(fù)。模型組仔豬腹瀉脫水嚴(yán)重，其中3頭仔豬死亡，死亡率達(dá)到60％，解剖觀察仔豬胃內(nèi)有未消化的凝乳塊，，小腸擴張，內(nèi)充滿黃色液體，腸系膜充血，腸系膜淋巴結(jié)水腫，小腸絨毛縮短，為典型的流行性腹瀉病毒導(dǎo)致的仔豬腸道病變。

上述參照實施例對重組豬干擾素γ成品凍干制劑進行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。