改良型聚乙二醇化重組人干擾素α2b的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及新型改良型長效干擾素的獲得。包括非天然氨基 酸介導(dǎo)的不同單PEG修飾產(chǎn)物，特定位點不同分子量的PEG修飾，以及多位點定點PEG的修 飾產(chǎn)物。
【背景技術(shù)】
[0002] (1)干擾素
[0003] 干擾素是細(xì)胞在誘生劑作用的條件下產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，具有抑制病毒復(fù)制，抑 制細(xì)胞分裂，及免疫調(diào)節(jié)等功能。人干擾素a 2b分子量約為19kD，由165個氨基酸組成， 其序列如SEQ ID N0:1所示：
[0004] CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIP VLHEMIQQIFNLFS TKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKE DSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVR AEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (SEQ ID N0:1)
[0005] 根據(jù)文獻報道，對個別密碼子進行優(yōu)化，以提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量，所用編 碼人干擾素a 2b的編碼序列如SEQ ID N0 :2所示：
[0006] TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCCGCCGCACCTTGATGCTCCTG GCACAGATGCGCCG CATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACCGCCATGACTTTGGATT TCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAA AAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATG AGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTG CTGCTTGGGAT GAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGC CTGTG TGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTC TGGCTGTGAGGAAATACTTCCA AAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGC CCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGA TCTTTTTCTTTGTCAACAAA CTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA (SEQ ID NO ：2)
[0007] 干擾素是商品化較早的生物制品，自從1986年美國FDA批準(zhǔn)Roch公司的干擾素 a 2a及Schering公司的干擾素a 2b上市，目前干擾素已經(jīng)成為世界上基因工程藥物的重 要成員。干擾素在我國也是第一個投放市場的基因藥物，已經(jīng)獲得了廣泛的使用。其在我 國慢性乙型肝炎等治療方面取得的重要效益和經(jīng)濟利益，將使干擾素成為未來抗病毒，抗 癌癥最廣泛應(yīng)用的藥物之一。
[0008] 作為基因藥物，干擾素半衰期短而治療周期長，需要患者頻繁的注射給藥，大大降 低了患者的依從性以及干擾素的應(yīng)用價值。因此，改善干擾素藥代動力學(xué)的研究正在世界 范圍內(nèi)廣泛進行。
[0009] (2)聚乙二醇修飾
[0010] 共價交聯(lián)聚乙二醇是增加生物分子水溶性，調(diào)節(jié)免疫原性，延長其半衰期的常用 方法。利用聚乙二醇修飾干擾素，延長其半衰期，改善其生物學(xué)特性，已經(jīng)是得到應(yīng)用的成 功技術(shù)。此前已經(jīng)有美國先靈葆雅公司生產(chǎn)的佩樂能，及羅氏公司生產(chǎn)的派羅欣作為PEG 化干擾素通過FDA認(rèn)證進入了醫(yī)藥市場。
[0011] 上市的PEG化干擾素雖然一定程度上解決了半衰期短的問題，但是非定點修飾的 方法也帶來了保留活性低和質(zhì)量控制困難的新問題。簡單來說，非定點修飾的方法可以和 干擾素上多個位點發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生多聚體和同分異構(gòu)體。而多PEG化及單PEG同分異構(gòu)體 的產(chǎn)生，又對工業(yè)生產(chǎn)的后期處理帶來高成本的影響，其結(jié)果是不僅嚴(yán)重降低了干擾素的 保留活性，也不利于大規(guī)模生產(chǎn)制備，質(zhì)量控制困難。市場上需要有高保留活性的、長效的， 容易對其質(zhì)量進行控制的PEG化干擾素產(chǎn)品。
[0012] (3)遺傳密碼擴展技術(shù)
[0013] 近年來遺傳密碼擴展技術(shù)發(fā)展迅速，利用琥珀終止密碼子（TAG)為有義編碼子，通 過引入相應(yīng)的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最終可以將設(shè)計好的非天然氨基酸引入蛋白 質(zhì)中。到目前為止，這一技術(shù)已經(jīng)將幾十種非天然氨基酸成功地定點表達(dá)在活細(xì)胞的蛋白 質(zhì)當(dāng)中，涉及的非天然氨基酸含有炔基，疊氮等，利用這些生物體中本來不存在的特殊基 團，就可以特異性的對蛋白質(zhì)進行定點修飾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 發(fā)明人經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的思考，將非天然氨基酸技術(shù)應(yīng)用到干擾素藥物的修飾 上，通過在不同位點引入含有疊氮基團修飾把手的非天然氨基酸，進而對干擾素實現(xiàn)了任 意位點的定點修飾。通過活性篩選及性質(zhì)測定，得到了若干性質(zhì)優(yōu)良的PEG化干擾素產(chǎn)品。 隨后發(fā)明人進一步應(yīng)用非天然氨基酸的修飾方法，對干擾素進行了多點的定點修飾，得到 了不錯性質(zhì)的雙點修飾PEG的干擾素產(chǎn)品。
[0015] 相比于上市的PEG化干擾素產(chǎn)品，本發(fā)明得到的改良型PEG化干擾素產(chǎn)品的主要 優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾點：
[0016] 1.修飾均勻，質(zhì)量均一化，質(zhì)量容易控制的PEG化干擾素
[0017] 2.保留活性更高，藥代動力學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的干擾素產(chǎn)品
[0018] 具體的，在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，提供了不同位點引入含有疊氮 基團非天然氨基酸的人干擾素，主要通過三個步驟：（1)選擇可能合適的干擾素突 變位點，（2)構(gòu)建含有在選定的具有TAG突變的編碼人干擾素基因的載體，（3)獲得
【主權(quán)項】
1. 特定位點定點突變的人干擾素，其至少1個位點上的氨基酸被突變?yōu)榉翘烊话被?酸，所述非天然氨基酸為：
〒不的Lys-azido。
2. 如權(quán)利要求1所述的定點突變?nèi)烁蓴_素，其與突變前的干擾素的氨基酸序列的區(qū)別 在于：氨基酸序列的第N位的氨基酸被突變?yōu)長ys-azido,突變氨基酸在干擾素中的連接方 式，如下式所示：
其中，由R1到R2的方向為氨基酸序列的N末端到C末端方向，R1為干擾素的第1至 第N-1位氨基酸殘基； R2為干擾素的N+ 1位至C末端的氨基酸殘基； R4 ^
3. 如權(quán)利要求1或2所述的特定位點突變的人干擾素，其中未經(jīng)突變的人干擾素序列 如SEQIDNO:1 所示。
4. 如權(quán)利要求3所述的特定位點突變的人干擾素，突變位點可為SEQIDNO: 1中任意 位點上一個或多個的氨基酸。
5. 如權(quán)利要求3所述的特定位點突變的人干擾素，所述突變位點選自：示于SEQ ID NO :1的序列的第P4位，H7位，S8位，K31位，R33位，H34位，E41位，E51位，A74位，E78 位，G102 位，T106 位，E107 位，L110 位，Mill 位，E113 位，L128 位，K133 位，P137 位，E159 位H34和E107位，或其他對活性影響較小的位點，以及多位點的組合。
6. 如權(quán)利要求5所述的特定位點突變的人干擾素，所述突變位點選自：示于SEQID NO:1的序列的A74,H34,E107或其組合。
7. 如權(quán)利要求5所述的特定位點突變的人干擾素，序列如SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、 SEQIDN0:5 或SEQIDN0:6 所示。
8. 編碼權(quán)利要求1-7中任一項的突變的干擾素的核酸分子。
9. 如權(quán)利要求8所述的核酸分子，其中突變位點的氨基酸密碼子被取代為琥珀密碼子 TAG。
10. 核酸載體，其可操作地連接有權(quán)利要求8或9的核酸分子。
11. 宿主細(xì)胞，其中含有權(quán)利要求10的核酸載體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中還含有能夠表達(dá)tRNAPyl/PylRS的質(zhì)粒。
13. 經(jīng)PEG修飾的如權(quán)利要求1-7中任一項所述的特定位點突變的人干擾素，
其中，R1為突變前的干擾素的第1至第N-1位氨基酸殘基， R2為突變的干擾素的第N+ 1位至C末端的氨基酸殘基， R3為偶聯(lián)的PEG分子。
14. 如權(quán)利要求13所述的經(jīng)PEG修飾的人干擾素，其特征在于當(dāng)取代的氨基酸位點多 于一個時，不同的取代位點偶聯(lián)的PEG分子量可以是相同的，也可以是不同的。
15. 如權(quán)利要求14所述的經(jīng)PEG修飾的人干擾素，其中不同的取代位點偶聯(lián)的PEG分 子量是相同的。
16. 經(jīng)PEG修飾的如權(quán)利要求1-7中任一項所述的特定位點突變的人干擾素，其在非天 然氨基酸位置定點引入PEG修飾，PEG的分子量范圍為2kD-100kD。
17. 如權(quán)利要求16所述的經(jīng)PEG修飾的特定位點突變的人干擾素，所述PEG的分子量 是 5kD、10kD、20kD或者 40kD。
18. 如權(quán)利要求17所述的經(jīng)PEG修飾的特定位點突變的人干擾素，具體是 H34-5K-IFN、H34-10K-IFN、H34-20K-IFN、H34-40K-IFN、H34&E107-5K或H34&E107-20K、 A74-10K-IFN、E41-10K-IFN、E51-10K-IFN、E107-5K-IFN、E107-10K-IFN、E107-20K-IFN。
19. 如權(quán)利要求17或18所述的經(jīng)PEG修飾的人干擾素，其特征在于當(dāng)取代的氨基酸位 點多于一個時，不同的取代位點偶聯(lián)的PEG分子量可以是相同的，也可以是不同的。
20. 如權(quán)利要求19所述的經(jīng)PEG修飾的人干擾素，其中不同的取代位點偶聯(lián)的PEG分 子量是相同的。
21. 藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求1-7中任一項的干擾素或者權(quán)利要求 13-20中任一項所述的經(jīng)PEG修飾的干擾素，以及藥學(xué)上可以接受的載體。
22. 權(quán)利要求1-7中任一項的干擾素或者權(quán)利要求13-20中任一項所述的經(jīng)PEG修飾 的干擾素的制備方法，所述方法包括使用基因密碼子擴展技術(shù)將非天然氨基酸定點引入干 擾素蛋白中，借助非天然氨基酸上的特定基團和任選的修飾劑如聚乙二醇與干擾素定點連 接；優(yōu)選地，在干擾素中引入疊氮基團，再與含有環(huán)辛炔的PEG修飾劑進行無銅點擊化學(xué)定 點偶聯(lián)PEG，用以制備PEG化干擾素。
23. 權(quán)利要求1-7中任一項的干擾素或者權(quán)利要求13-20中任一項所述的經(jīng)PEG修飾 的干擾素在制備用于抗病毒，治療多種惡性腫瘤，免疫調(diào)節(jié)的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及非天然氨基酸標(biāo)記的目的蛋白或肽，例如，經(jīng)過定點突變的人干擾素α2b，定點修飾的人干擾素α2b，干擾素可以是不同種屬及不同類型的。本發(fā)明還涉及定點突變和定點修飾干擾素的制備方法，所述方法包括使用基因密碼子擴展技術(shù)將非天然氨基酸定點引入干擾素基因中，借助非天然氨基酸和修飾劑如聚乙二醇與干擾素定點連接。本發(fā)明進一步涉及定點突變或修飾的干擾素的應(yīng)用，如作為穩(wěn)定、長效干擾素等的用途。CGMCC No：743220130408
【IPC分類】C12N15-63, A61P37-02, A61P31-12, A61P35-00, C12N15-20, C07K14-555, A61K38-21
【公開號】CN104693300
【申請?zhí)枴緾N201310654386
【發(fā)明人】周德敏, 吳凌, 張博, 陳景賢, 俞飛, 張傳領(lǐng), 司龍龍
【申請人】北京大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年12月5日
【公告號】WO2015081858A1