本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種脹果甘草低聚糖及其制備方法。

背景技術(shù)：

甘草(Glycyrrhiza spp.)是傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、健脾補(bǔ)氣、潤肺止咳之功效，甘草多糖(Glycyrrhiza polysacchiade，GP)是其中除甘草酸、甘草黃酮之外的又一重要活性物質(zhì)，甘草的許多生理活性，尤其是免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤活性都與其含有的多糖類成分密切相關(guān)。

脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)是新疆具有區(qū)域特色的中藥資源，產(chǎn)量居全國之首，是新疆商品甘草的主要來源，與烏拉爾甘草(G.uralensis Fisch.)、光果甘草(G.glabra L.)一同被各版中國藥典收載，作為傳統(tǒng)中藥甘草的基源植物。本發(fā)明人前期已對脹果甘草多糖進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究，分離純化得到的組分中含量較高的為鼠李半乳糖醛酸聚糖GiP，具有RG-Ⅰ型果膠多糖的典型結(jié)構(gòu)特征，平均分子量2.0×10⁶Da，而且有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)活性，是脹果甘草中一類重要的免疫活性組分。

果膠多糖在食品工業(yè)中被廣泛用作增稠劑、膠凝劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，近年來研究發(fā)現(xiàn)，果膠多糖也具有抗腹瀉、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降低血糖和膽固醇、治療糖尿病和心血管硬化及延長抗菌素的作用，在醫(yī)藥工業(yè)上也有廣泛的用途，通常被用來制造輕瀉劑、止血劑、血漿代用品、金屬解毒劑等。由果膠多糖降解產(chǎn)生的低聚糖，特別是半乳糖醛酸低聚糖，也是重要的生物信息分子，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)雙歧桿菌生長，激活植物的自我防衛(wèi)系統(tǒng)，抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)鈣質(zhì)吸收等多種生物活性。

天然來源的低聚糖數(shù)量極其有限，因此需要借助降解多糖或者以合成的手段獲得。糖分子的多羥基特性使得低聚糖分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加上合成中的區(qū)域選擇性、立體選擇性以及合成產(chǎn)率等問題，造成低聚糖合成的難度很大。因此，采用適宜的方法將多糖降解，成為獲得低聚糖的重要途徑。根據(jù)果膠多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，目前普遍采用化學(xué)方法(酸解法、氧化法等)或酶降解，得到不同分子質(zhì)量或不同酯化度的低聚糖。酸法降解速度快(特別是在加熱的條件下)，降解比較完全，缺點(diǎn)是降解條件劇烈，產(chǎn)物分子量分布寬、均一性較差；氧化降解法工藝條件復(fù)雜，反應(yīng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。酶解法具有條件溫和、特異性強(qiáng)，副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多糖的定向和可控性降解，是目前最常采用、也最為理想的降解方法。

脹果甘草多糖分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用存在著體內(nèi)難以跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，生物利用度低的缺點(diǎn)；有關(guān)利用脹果甘草多糖來制備低聚糖，在國內(nèi)外均未見有報道，也未檢索到有相關(guān)的文獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種脹果甘草低聚糖及其制備方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決有關(guān)利用脹果甘草多糖來制備低聚糖，在國內(nèi)外均未見有報道的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：一種脹果甘草低聚糖，按下述方法得到：

第一步，果膠酸的制備，取脹果甘草多糖適量，溶于25倍至50倍脹果甘草多糖體積的1.0mol/L NaOH無水乙醇溶液，冰浴中反應(yīng)4.5h至5h，反應(yīng)后在溫度為4℃下靜置過夜，靜置過夜后減壓過濾，過濾后沉淀溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀再溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀用體積百分比為50％的乙醇水溶液洗滌2次至3次，洗滌后的沉淀冷凍干燥后，得到果膠酸；

第二步，果膠酸的酶法降解，取果膠酸適量，加入0.1mol/L pH為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液充分溶解后得到混合液，然后果膠酸和果膠酶按質(zhì)量比為200:1，在混合液中加入果膠酶并混合均勻，在溫度為35℃至40℃的水浴中反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后在溫度為90℃至100℃的水浴中加熱5min至10min使酶失活，然后冷卻至室溫，離心分離后得到上清液，上清液濃縮至上清液體積的1/2至1/4后，得到濃縮液，濃縮液經(jīng)陽離子交換樹脂脫鹽，脫鹽后用蒸餾水洗脫，洗脫至蒸餾水洗脫液無糖組分流出，收集蒸餾水洗脫液，然后將蒸餾水洗脫液濃縮至干，得到脹果甘草低聚糖。

下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)：

上述冰浴溫度為0℃至4℃；或/和，靜置過夜的時間為12h至24h。

上述調(diào)節(jié)pH的酸為鹽酸；或/和，冷凍干燥的溫度為-60℃至-40℃，冷凍干燥的時間為12h至24h。

上述醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的加入量為果膠酸質(zhì)量的1％至1.5％；或/和，果膠酶的活力單位1000U至3000U。

上述離心分離的轉(zhuǎn)速為4500r/min至5000r/min，離心時間為10min至15min；或/和，蒸餾水洗脫液的流速為4倍至5倍柱體積/h。

本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：一種脹果甘草低聚糖的制備方法，按下述步驟進(jìn)行：

第一步，果膠酸的制備，取脹果甘草多糖適量，溶于25倍至50倍脹果甘草多糖體積的1.0mol/L NaOH無水乙醇溶液，冰浴中反應(yīng)4.5h至5h，反應(yīng)后在溫度為4℃下靜置過夜，靜置過夜后減壓過濾，過濾后沉淀溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀再溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀用體積百分比為50％的乙醇水溶液洗滌2次至3次，洗滌后的沉淀冷凍干燥后，得到果膠酸；

第二步，果膠酸的酶法降解，取果膠酸適量，加入0.1mol/L pH為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液充分溶解后得到混合液，然后果膠酸和果膠酶按質(zhì)量比為200:1，在混合液中加入果膠酶并混合均勻，在溫度為35℃至40℃的水浴中反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后在溫度為90℃至100℃的水浴中加熱5min至10min使酶失活，然后冷卻至室溫，離心分離后得到上清液，上清液濃縮至上清液體積的1/2至1/4后，得到濃縮液，濃縮液經(jīng)陽離子交換樹脂脫鹽，脫鹽后用蒸餾水洗脫，洗脫至蒸餾水洗脫液無糖組分流出，收集蒸餾水洗脫液，然后將蒸餾水洗脫液濃縮至干，得到脹果甘草低聚糖。

下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)：

上述冰浴溫度為0℃至4℃；或/和，靜置過夜的時間為12h至24h。

上述調(diào)節(jié)pH的酸為鹽酸；或/和，冷凍干燥的溫度為-60℃至-40℃，冷凍干燥的時間為12h至24h。

上述醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的加入量為果膠酸質(zhì)量的1％至1.5％；或/和，果膠酶的活力單位1000U至3000U。

上述離心分離的轉(zhuǎn)速為4500r/min至5000r/min，離心時間為10min至15min；或/和，蒸餾水洗脫液的流速為4倍至5倍柱體積/h。

本發(fā)明首次公開了以脹果甘草多糖(GiP)經(jīng)脫酯化得到果膠酸，以果膠酸為底物進(jìn)行酶解后，得到本發(fā)明脹果甘草低聚糖，本發(fā)明脹果甘草低聚糖包含聚合度為1～5的聚半乳糖醛酸低聚糖，本發(fā)明脹果甘草低聚糖較原脹果甘草多糖(GiP)具有更強(qiáng)的促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用，顯示出較好的免疫促進(jìn)活性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

附圖說明

附圖1為對照品和實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖的TLC分析圖。

附圖2為正離子模式下實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖部分的ESI-MS譜圖。

附圖3為為負(fù)離子模式下實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖部分的ESI-MS譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。

實(shí)施例1，該脹果甘草低聚糖，按下述制備方法得到：

第一步，果膠酸的制備，取脹果甘草多糖適量，溶于25倍至50倍脹果甘草多糖體積的1.0mol/L NaOH無水乙醇溶液，冰浴中反應(yīng)4.5h至5h，反應(yīng)后在溫度為4℃下靜置過夜，靜置過夜后減壓過濾，過濾后沉淀溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀再溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀用體積百分比為50％的乙醇水溶液洗滌2次至3次，洗滌后的沉淀冷凍干燥后，得到果膠酸；

第二步，果膠酸的酶法降解，取果膠酸適量，加入0.1mol/L pH為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液充分溶解后得到混合液，然后果膠酸和果膠酶按質(zhì)量比為200:1，在混合液中加入果膠酶并混合均勻，在溫度為35℃至40℃的水浴中反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后在溫度為90℃至100℃的水浴中加熱5min至10min使酶失活，然后冷卻至室溫，離心分離后得到上清液，上清液濃縮至上清液體積的1/2至1/4后，得到濃縮液，濃縮液經(jīng)陽離子交換樹脂脫鹽，脫鹽后用蒸餾水洗脫，洗脫至蒸餾水洗脫液無糖組分流出，收集蒸餾水洗脫液，然后將蒸餾水洗脫液濃縮至干，得到脹果甘草低聚糖。

實(shí)施例2，該脹果甘草低聚糖，按下述制備方法得到：

第一步，果膠酸的制備，取脹果甘草多糖適量，溶于25倍至50倍脹果甘草多糖體積的1.0mol/L NaOH無水乙醇溶液，冰浴中反應(yīng)4.5h至5h，反應(yīng)后在溫度為4℃下靜置過夜，靜置過夜后減壓過濾，過濾后沉淀溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀再溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用酸調(diào)節(jié)pH為1.5至2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h至1h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀用體積百分比為50％的乙醇水溶液洗滌2次至3次，洗滌后的沉淀冷凍干燥后，得到果膠酸；

第二步，果膠酸的酶法降解，取果膠酸適量，加入0.1mol/L pH為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液充分溶解后得到混合液，然后果膠酸和果膠酶按質(zhì)量比為200:1，在混合液中加入果膠酶并混合均勻，在溫度為35℃或40℃的水浴中反應(yīng)0.5h或1h，反應(yīng)后在溫度為90℃或100℃的水浴中加熱5min或10min使酶失活，然后冷卻至室溫，離心分離后得到上清液，上清液濃縮至上清液體積的1/2或1/4后，得到濃縮液，濃縮液經(jīng)陽離子交換樹脂脫鹽，脫鹽后用蒸餾水洗脫，洗脫至蒸餾水洗脫液無糖組分流出，收集蒸餾水洗脫液，然后將蒸餾水洗脫液濃縮至干，得到脹果甘草低聚糖。

實(shí)施例3，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，冰浴溫度為0℃至4℃；或/和，靜置過夜的時間為12h至24h。

實(shí)施例4，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，調(diào)節(jié)pH的酸為鹽酸；或/和，冷凍干燥的溫度為-60℃至-40℃，冷凍干燥的時間為12h至24h。

實(shí)施例5，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的加入量為果膠酸質(zhì)量的1％至1.5％；或/和，果膠酶的活力單位1000U至3000U。

實(shí)施例6，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，離心分離的轉(zhuǎn)速為4500r/min至5000r/min，離心時間為10min至15min；或/和，蒸餾水洗脫液的流速為4倍至5倍柱體積/h。

實(shí)施例7，該脹果甘草低聚糖，按下述制備方法得到：

第一步，果膠酸的制備，稱取脹果甘草多糖(GiP)2.0g，溶于500mL1.0mol/LNaOH的無水乙醇溶液，在溫度為0℃至4℃的冰浴中反應(yīng)5h，反應(yīng)后在溫度為4℃下靜置過夜，靜置過夜后減壓過濾，過濾后沉淀溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀再溶于體積百分比為50％的乙醇水溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0后繼續(xù)反應(yīng)0.5h，反應(yīng)后減壓過濾，過濾后沉淀用體積百分比為50％的乙醇水溶液洗滌3次，洗滌后的沉淀在溫度為-60℃至-40℃下冷凍干燥12h，冷凍干燥后得到果膠酸；

第二步，果膠酸的酶法降解，稱取上述制得的果膠酸500mg，加入0.1mol/L pH為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液充分溶解后得到混合液，然后果膠酸和果膠酶按質(zhì)量比為200:1，在混合液中加入果膠酶并混合均勻，在溫度為40℃的水浴中反應(yīng)1h，反應(yīng)后在溫度為100℃的水浴中加熱5min使酶失活，然后冷卻至室溫，在轉(zhuǎn)速為5000r/min下離心分離15min，離心分離后得到上清液，上清液濃縮至上清液體積的1/2后，得到濃縮液，濃縮液經(jīng)陽離子交換樹脂脫鹽，脫鹽后用蒸餾水洗脫，洗脫至蒸餾水洗脫液無糖組分流出，收集蒸餾水洗脫液，蒸餾水洗脫液的流速為5倍柱體積/h，然后將蒸餾水洗脫液濃縮至干，得到脹果甘草低聚糖。實(shí)施例7中，得到的果膠酸重為1.186g，得率為59.3％；得到的脹果甘草低聚糖重為374mg，得率為74.8％。

本發(fā)明上述實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖的研究如下：

一.脹果甘草低聚糖的分析

1.將上述實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖取少量復(fù)溶于水，進(jìn)行TLC分析。水溶后的脹果甘草低聚糖用甲醇稀釋，13000r/min離心5min，取上清進(jìn)行ESI-MS檢測分析。

TLC條件：普通硅膠G薄層板，正丁醇:甲酸:水＝4:7:1為展開系統(tǒng)，顯色劑為苯胺-二苯胺-磷酸(99.5％苯胺4ml，99.0％二苯胺4g和85.0％磷酸20ml溶于200ml丙酮中)，110℃加熱顯色；另取市售低聚糖為對照品，同上述方法進(jìn)行TLC分析。

ESI-MS檢測條件：Waters TQ Detector電噴霧質(zhì)譜。

樣品通過2μL定量環(huán)進(jìn)樣。

在負(fù)離子檢測方式下進(jìn)行掃描；毛細(xì)管電壓4.00kV，錐孔電壓50V，離子源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度250℃，脫溶劑氣流速：500L/h，錐孔氣流量50L/h，掃描范圍：50至2000。

在正離子檢測方式下進(jìn)行掃描，毛細(xì)管電壓4.90kV，錐孔電壓50V，離子源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度250℃，脫溶劑氣流速：500L/h，錐孔氣流量50L/h，掃描范圍：50至2000。

2.脹果甘草低聚糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

無菌條件下取Balb/c小鼠脾臟，研磨后過200目篩，細(xì)胞懸液離心，用雙蒸水溶解紅細(xì)胞，然后用PBS清洗三次，懸于完全培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度4×10⁶個/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入100μL上述細(xì)胞懸液及3個濃度(25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)脹果甘草多糖及實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖樣品，使之總體積為200μL，于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中72h，在培養(yǎng)結(jié)束前8h摻³H-TdR，0.2μCi/孔，繼續(xù)培養(yǎng)8h，細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于纖維濾膜上，用β-counter計數(shù)器測定放射活性。各濃度實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以mean±s.d.表示，與不加藥的空白對照組進(jìn)行T檢驗(yàn)。

二.結(jié)果

對照品和實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖的TLC分析圖，見圖1所示，圖1中1表示對照品，2表示實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖；從圖1可以看出，實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖的TLC的圖上出現(xiàn)了4個斑點(diǎn)，表明原料脹果甘草多糖(GiP)經(jīng)脫酯化得到果膠酸，以果膠酸為底物進(jìn)行酶解，得到的脹果甘草低聚糖中至少包含四種低聚糖。

水溶后的實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖用甲醇稀釋，13000r/min離心5min，取上清進(jìn)行ESI-MS檢測分析，圖2為正離子模式下實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖部分的ESI-MS譜圖，圖3為負(fù)離子模式下實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖部分的ESI-MS譜圖；從圖2可以看出，主要存在[M+Na]⁺離子峰，其中m/z為216.94、398.69、566.27(569)、744.89、927.57(921)分別是半乳糖醛酸和聚合度為2～5的低聚半乳糖醛酸的[M+Na]⁺離子峰；從圖3可以看出，主要存在[M－H]^－離子峰，其中m/z為192.94、368.94、544.92、720.94、897.37分別是半乳糖醛酸和聚合度為2～5的低聚半乳糖醛酸的[M－H]^－離子峰。

綜合以上TLC及ESI-MS分析結(jié)果可知，以脹果甘草多糖(GiP)為原料，經(jīng)脫酯化得到果膠酸，以果膠酸為底物進(jìn)行酶解后可獲得包括聚合度為1～5的聚半乳糖醛酸等低聚糖。

脹果甘草低聚糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

脹果甘草多糖(GiP)和實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)見表1所示；從表1可以看出，與空白組比較，不同濃度脹果甘草多糖(GiP)和實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖均可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖；各濃度實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用極其顯著(P<0.01)，并顯示出劑量效應(yīng)關(guān)系，而且實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖促脾淋巴細(xì)胞增殖作用均超過了相應(yīng)濃度組的脹果甘草多糖(GiP)；說明由脹果甘草多糖(GiP)得到的本發(fā)明脹果甘草低聚糖具有比原多糖更強(qiáng)的促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用，具有較好的免疫促進(jìn)活性。

本發(fā)明以分離純化得到的脹果甘草多糖(GiP)為原料，經(jīng)脫酯化得到果膠酸，以果膠酸為底物進(jìn)行酶解，結(jié)合TLC、ESI-MS等檢測方法對降解產(chǎn)生的脹果甘草低聚糖進(jìn)行分析，采用氚-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)摻入法外檢測脹果甘草多糖(GiP)及其降解所得脹果甘草低聚糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，獲得利用脹果甘草多糖(GiP)制備脹果甘草低聚糖的方法。

綜上所述，本發(fā)明首次公開了以脹果甘草多糖(GiP)經(jīng)脫酯化得到果膠酸，以果膠酸為底物進(jìn)行酶解后，得到本發(fā)明脹果甘草低聚糖，本發(fā)明脹果甘草低聚糖包含聚合度為1～5的聚半乳糖醛酸低聚糖，本發(fā)明脹果甘草低聚糖較原脹果甘草多糖(GiP)具有更強(qiáng)的促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用，顯示出較好的免疫促進(jìn)活性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。

表1脹果甘草多糖(GiP)和實(shí)施例7得到的脹果甘草低聚糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)(n＝4)

注：*：與空白對照組比較，P<0.05；**：與空白對照組比較，P<0.01。