本發(fā)明涉及葛根黃酮，尤其涉及一種通過酶對(duì)葛根黃酮進(jìn)行改性的方法。

背景技術(shù)：

黃酮類化合物是植物多酚的一個(gè)亞群，是植物重要的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉等許多食源性植物中。由于其結(jié)構(gòu)千差萬別，生理活性也多種多樣，可以用作醫(yī)療藥物、抗菌劑、抗氧化劑，能夠治療多種疾病和抑制醫(yī)學(xué)上的機(jī)能紊亂。但天然黃酮類化合物多以糖苷類形式存在，即通過O-糖苷鍵或C-糖苷鍵與糖基相連，由于糖的種類、數(shù)量、連接位置及連接方式的不同，可以組成各種各樣的黃酮苷，黃酮苷類脂溶性較差，限制了其生物活性的發(fā)揮，而且部分黃酮苷類沒有其苷元的特性。因此，可通過定向修飾黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)以發(fā)揮其特定功能。化學(xué)法選擇性差，反應(yīng)不易控制，加之需要高溫高壓，反應(yīng)產(chǎn)物為多種物質(zhì)的混合物，給后續(xù)分離帶來極大的困難，同時(shí)排出大量的廢液，給環(huán)境造成極大的污染，并且其使用的試劑不適合添加到食品中，其溶劑殘留問題將阻礙改性產(chǎn)物在食品等行業(yè)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種葛根黃酮改性的方法，采用柚皮苷酶對(duì)葛根黃酮進(jìn)行水解處理，將葛根黃酮苷水解為具有更高抗氧化活性以及更好脂溶性的苷元，以拓展葛根黃酮在食品等行業(yè)的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的葛根黃酮改性的方法，包括：將葛根黃酮分散于緩沖液中，加入柚皮苷酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45-65℃；反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，再對(duì)萃取液進(jìn)行減壓蒸餾和干燥，得葛根黃酮粉改性產(chǎn)物。

所述緩沖液的pH為3.5-5.5，優(yōu)選的，pH為4.0-5.0，更優(yōu)選的，pH為4.5。所述的緩沖液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。本領(lǐng)域人員知曉，所述的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液通常根據(jù)pH要求由0.2M磷酸氫二鈉與0.1M檸檬酸按照不同比例混合而得。

將葛根黃酮分散于緩沖液中，料液比為1:5-1:25，優(yōu)選的，料液比為1:15-1:25，更優(yōu)選的，料液比為1:20。

所述柚皮苷酶的添加量為：每克葛根黃酮中添加40-200IU柚皮苷酶，優(yōu)選的，每克葛根黃酮中添加80-160IU柚皮苷酶，更優(yōu)選的，每克葛根黃酮中添加120IU柚皮苷酶。

為使反應(yīng)進(jìn)行完全，所述反應(yīng)的時(shí)間為0.5-2.5h，優(yōu)選的，反應(yīng)時(shí)間為1-1.5h，反應(yīng)溫度為45-65℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

葛根黃酮中蘆丁含量較高，而蘆丁的糖苷部位由一分子葡萄糖和一分子鼠李糖相連。柚皮苷酶由β-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶組成，可降解黃酮苷上的葡萄糖和鼠李糖形成相應(yīng)的苷元，提高抗氧化活性和脂溶性。

與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，采用柚皮苷酶對(duì)葛根黃酮粉進(jìn)行處理，反應(yīng)條件溫和，無污染，除了使用食品級(jí)乙酸乙酯外，無任何有機(jī)溶劑的加入，無有毒溶劑殘留。

采用柚皮苷酶對(duì)葛根黃酮粉進(jìn)行處理，有效提高了其抗氧化活性和脂溶性，拓展了其在食品等行業(yè)的應(yīng)用。與未經(jīng)處理相比，DPPH自由基清除率由25.89％提高到84.72％，總還原力由0.139提高到0.421，羥基自由基清除率由3.19％提高到45.65％，三種抗氧化性能分別達(dá)到同濃度維生素C的89.77％、62.46％以及80.19％。衡量脂溶性的透光率從0.108提高到1.000。

附圖說明

圖1為pH對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖2為料液比對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖3為酶添加量對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖4為溫度對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖5為水解時(shí)間對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的柚皮苷酶的酶活為20000IU/g，購自上海伊卡生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)NO102-25MG。

本發(fā)明實(shí)施例中的參數(shù)測定方法如下：

1、羥基自由基清除率測定：

將樣品用乙醇配成5g/L溶液。取1.0mL，分別加入9.0mmol/L FeSO₄、9.0mmol/L水楊酸-乙醇各1.0mL，對(duì)照組以蒸餾水1.0mL代替樣品溶液。最后加8.8mmol/L H₂O₂啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)0.5h后，以蒸餾水調(diào)零，在波長510nm下測定吸光度。以Vc作陽性對(duì)照品，臨用前用蒸餾水配制成與樣品溶液相同的質(zhì)量濃度。同法操作，進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

清除率(％)＝([A₀-Ax-Ax₀)/A₀]×100計(jì)算清除率。

式中：A₀用蒸餾水代替水楊酸時(shí)測得的不同提取物濃度本底吸光度；

Ax為樣品吸光度值；

Ax₀為用水代替樣品測定的吸光度值。

2、DPPH自由基清除率測定：

將待測樣品用無水乙醇配成5g/L。用乙醇做溶劑將DPPH配制成濃度為1.183g/L乙醇溶液作為儲(chǔ)備液，臨用前用無水乙醇溶液稀釋成0.1183g/L。

測定：樣品溶液+溶液各2ml為Ai(為樣品抑制吸收值)；樣品溶液+無水乙醇2ml為Ac(為樣品對(duì)照)；DPPH溶液+無水乙醇各2ml為Aj(為無抑制吸收值)；4ml無水乙醇為無抑制吸收值對(duì)照。分別充分振蕩混勻，室溫靜止30min后在517nm處測定吸收值(每個(gè)值同時(shí)測定兩管)。

抑制率＝(Aj-Ai)*100％/Aj，結(jié)果以Vc作陽性對(duì)照。

3、總還原力測定：

將樣品用無水乙醇配成5g/L。取2.5mL樣品液，加入2.5mL 2.5mol/LpH6.6磷酸鹽緩沖液，再加入2.5mL 1％六氰合鐵酸鉀和0.2mL 1％蔗糖酯溶液；充分振蕩混勻；蓋上塞子將該試管置于50℃水浴鍋中保溫20min；取出試管進(jìn)行快速冷卻,然后加入2.5mL 10％TCA，充分振蕩混勻后4 000r/min離心10min；取離心后的上清液2.5mL，加入2.5mL濃度25％甲醇和0.5mL 0.1％三氯化鐵,充分振蕩混勻，靜置10min后測定其在700nm處的吸光度值，用去離子水代替樣品的混合液進(jìn)行還原力參比測定試驗(yàn)。混合液的吸光度越強(qiáng)，表明還原力越強(qiáng)。

4、脂溶性測定：

稱取10mg干燥后的產(chǎn)品，溶于10mL氯仿中，超聲10min使其溶解，配成濃度為1g/L的溶液或懸液，在測之前再在震蕩器上震蕩混勻后用紫外分光光度計(jì)測定溶液或懸液在800nm下的透光率。

實(shí)施例1

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.02g柚皮苷酶，在60℃下水解1h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級(jí)乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為23.23％，DPPH自由基清除率為49.17％，總還原力0.215。

實(shí)施例2

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.02g柚皮苷酶，在60℃下水解1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級(jí)乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為27.16％，DPPH自由基清除率為64.45％，總還原力0.287。

實(shí)施例3

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.04g柚皮苷酶，在55℃下水解1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級(jí)乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為36.57％，DPPH自由基清除率為77.23％，總還原力0.379。

實(shí)施例4

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.03g柚皮苷酶，在55℃下水解1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級(jí)乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為45.65％，DPPH自由基清除率為84.72％，總還原力0.421。

空白組：指未經(jīng)酶處理的原料樣品。

對(duì)照組1：指除不加酶外，其他操作參照實(shí)施例4。

對(duì)照組2：指以維生素C為對(duì)照品，用水配成5g/L濃度，按法測定DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及總還原力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1

實(shí)施例5

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入不同pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.02g柚皮苷酶，在60℃下水解1h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級(jí)乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥，得改性產(chǎn)物。

pH分別設(shè)置為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，考察不同pH對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，結(jié)果見圖1，pH為4.5時(shí)產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實(shí)施例6

緩沖液的pH為5.0，料液比分別設(shè)置為1:5,1:10,1:15,1:20,1:25，考察不同料液比對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例5。

結(jié)果見圖2，料液比為1:20時(shí)產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實(shí)施例7

緩沖液的pH為4.5，在55℃下水解1.5h，調(diào)整柚皮苷酶的添加量，每克葛根黃酮中分別添加40、80、120、160、200IU柚皮苷酶，考察不同酶量對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例5。

結(jié)果見圖3，柚皮苷酶的添加量為120IU/g時(shí)產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實(shí)施例8

緩沖液的pH為4.5，柚皮苷酶的添加量為0.02g，水解1.5h，調(diào)整反應(yīng)溫度分別設(shè)置為45、50、55、60以及65℃，考察不同反應(yīng)溫度對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例5。

結(jié)果見圖4，溫度為55℃時(shí)產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實(shí)施例9

緩沖液的pH為4.5，柚皮苷酶的添加量為0.02g，在60℃分別反應(yīng)0.5、1、1.5、2、2.5h，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例5。

結(jié)果見圖5，反應(yīng)1.5h時(shí)產(chǎn)物抗氧化性能最佳。