本發(fā)明屬于新能源與新材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及到一種水溶性碳點的制備方法及其在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

碳點是一維尺度小于10nm具有熒光性的碳納米顆粒。自2004年Scrivens等在純化碳納米管時發(fā)現(xiàn)碳點以來，因其生物相容性好、制備方法簡單易得、發(fā)光范圍可調(diào)、發(fā)光性質(zhì)穩(wěn)定等特點而受到廣泛的關(guān)注。碳點的性質(zhì)優(yōu)異，原料廉價和制備方法簡單，是一種新型的生態(tài)環(huán)境材料。在過去的幾年里，科研人員在碳點的合成、機理研究和應(yīng)用等方面做了大量而深入的研究。另外，碳點在生物給藥、生物成像、熒光探針等方面具有較高的應(yīng)用價值。

目前，碳點的合成方法一般可以分為自上而下法和自下而上法，這兩種方法詳見文獻：Ray SC,et al.Journal Of Physical Chemistry C,2009。自上而下法，包括電弧放電、激光分解、化學(xué)消融和燃燒/熱處理等。此類方法具有反應(yīng)條件苛刻、工藝復(fù)雜、熒光量子點產(chǎn)量低和成本高的缺點，難以實現(xiàn)批量生產(chǎn)。熱解或碳化小分子，然后逐步聚合形成納米級的碳點，包括模板法、水熱/溶劑熱法、微波法等。其中模板法需要高分子聚合物作為模板，反應(yīng)過程中需高溫加熱，結(jié)束需要堿洗，制備過程耗能且污染環(huán)境。微波法能夠大大縮短反應(yīng)時間、降低能耗，但熒光量子點產(chǎn)率通常不高。水熱和溶劑熱法是一種能量效率高、環(huán)境友好和無毒的合成碳點的方法，也是最可能實現(xiàn)批量生產(chǎn)的方法，但碳點的分離純化存在一定困難。

熒光碳點在細胞標記、生物傳感器和生物成像中應(yīng)用很多，但將碳點應(yīng)用于微生物發(fā)酵以實現(xiàn)目標產(chǎn)物產(chǎn)量的提高鮮有報道。本發(fā)明以自然界中廣泛存在且廉價的殼聚糖、甲殼素為起始原料，在溫和條件下，合成水溶性熒光量子碳點。之后將合成的水溶性碳點用于促進微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學(xué)品如1，3-丙二醇、2,3-丁二醇和細菌纖維素等，為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為環(huán)境協(xié)調(diào)性材料及其利用提供了一條綠色可行的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種水溶性碳點的制備，實現(xiàn)了水產(chǎn)品加工廢棄物的綜合利用。該方法以廢棄的河蟹蟹殼為原料，通過熱裂解的方法制備具有生物親和性的高熒光碳點，并將其添加在微生物(木醋桿菌或克雷伯氏桿菌)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基中，提高發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種水溶性碳點的制備方法，包括以下步驟：

第一步，將洗凈晾干的蟹殼粉碎、過篩，獲得初始原料并干燥。然后稱取蟹粉，在惰性氣體保護下熱裂解，取出裂解產(chǎn)物置于去離子水中，超聲清洗30min，過濾后的濾液經(jīng)冷凍干燥后，獲得熒光碳點晶體；

第二步，將熒光碳點晶體配制成純碳點溶液，然后添加到微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)后測定產(chǎn)物產(chǎn)量。

根據(jù)上述方法制備的水溶性碳點在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用，包括以下步驟：

步驟1，將廢棄的河蟹蟹殼洗凈除雜，粉碎后的蟹殼粉末尺寸小于0.22μm。將蟹殼粉末置于管式爐中，通入氮氣排除空氣15min后，以5～10℃/s升溫至350～550℃，熱裂解1～5h后，收集熱裂解產(chǎn)物。將熱裂解產(chǎn)物在超聲作用下洗滌30～120min，在9000～12000rpm離心30min后收集棕黃色溶液。溶液經(jīng)透析除去小分子雜質(zhì)，獲得水溶性熒光碳點，冷凍干燥獲得熒光碳點晶體。

步驟2，將步驟1熒光碳點晶體溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度0.3～0.6％的熒光碳點水溶液，然后將碳點水溶液滅菌后加入到微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述微生物為木醋桿菌或克雷伯氏桿菌，碳點水溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1:4～9。木醋桿菌靜置發(fā)酵時間為7～10天，克雷伯氏桿菌發(fā)酵時間為24～36h。

本發(fā)明制備水溶性熒光碳點的原料屬于廢棄生物質(zhì)，通過該工藝可變廢為寶。水溶性熒光碳點的制備工藝簡單、高效，碳點熒光量子產(chǎn)率可達35％。所制備水溶性熒光碳點具有生物親和性，對于肺炎克雷伯氏桿菌的發(fā)酵具有促進作用，可提高1,3-丙二醇產(chǎn)量達30％；此外，將水溶性熒光碳點應(yīng)用于木醋桿菌靜置發(fā)酵，細菌纖維素產(chǎn)量可提高75％。本發(fā)明首次將水溶性熒光碳點用于微生物發(fā)酵，并獲得明顯的促進效果，為微生物發(fā)酵提供了新的生長因子。

附圖說明

附圖1是碳點在不同激發(fā)波長下的熒光光譜。

具體實施方式

以下結(jié)合具體技術(shù)方案和附圖詳細敘述本發(fā)明的具體實施方式。

實施例1

將廢棄的河蟹蟹殼洗凈、除雜、烘干并粉碎，收集尺寸小于0.22μm蟹殼粉末。將蟹殼粉末置于管式爐中，通入氮氣排除空氣15min后，以5℃/s升溫至550℃，熱裂解1h后，收集熱裂解產(chǎn)物。將熱裂解產(chǎn)物在超聲作用下洗滌30min，在12000rpm離心30min后收集棕黃色溶液。溶液經(jīng)透析除去小分子雜質(zhì)，獲得水溶性熒光碳點，冷凍干燥獲得熒光碳點晶體，碳點熒光量子產(chǎn)率為35％。將熒光碳點晶體溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度0.3％的熒光碳點水溶液。

將碳點水溶液滅菌后加入到克雷伯氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳點水溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1:4。發(fā)酵培養(yǎng)36h，甘油轉(zhuǎn)化率98％，1,3-丙二醇濃度22.4g/L，與未添加碳點溶液的發(fā)酵實驗相比，1,3-丙二醇濃度提高28％。

實施例2

將蟹殼粉末置于管式爐中，通入氮氣排除空氣15min后，以10℃/s升溫至350℃，熱裂解5h后，收集熱裂解產(chǎn)物。將熱裂解產(chǎn)物在超聲作用下洗滌60min，在9000rpm離心30min后收集棕黃色溶液。溶液經(jīng)透析除去小分子雜質(zhì)，獲得水溶性熒光碳點，冷凍干燥獲得熒光碳點晶體，碳點熒光量子產(chǎn)率為29％。將熒光碳點晶體溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度0.6％的熒光碳點水溶液。

將碳點水溶液滅菌后加入到克雷伯氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳點水溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1:9。發(fā)酵培養(yǎng)24h，甘油轉(zhuǎn)化率95％，1,3-丙二醇濃度21.8g/L，與未添加碳點溶液的發(fā)酵實驗相比，1,3-丙二醇濃度提高15％。

實施例3

將蟹殼粉末置于管式爐中，通入氮氣排除空氣15min后，以7℃/s升溫至400℃，熱裂解2h后，收集熱裂解產(chǎn)物。將熱裂解產(chǎn)物在超聲作用下洗滌30min，在12000rpm離心30min后收集棕黃色溶液。溶液經(jīng)透析除去小分子雜質(zhì)，獲得水溶性熒光碳點，冷凍干燥獲得熒光碳點晶體，碳點熒光量子產(chǎn)率為32％。將熒光碳點晶體溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度0.3％的熒光碳點水溶液。

將碳點水溶液滅菌后加入到木醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳點水溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1:4。靜置發(fā)酵10天，細菌纖維素產(chǎn)量為5.5g/L，與未添加碳點溶液的發(fā)酵實驗相比，提高75％。

實施例4

將蟹殼粉末置于管式爐中，通入氮氣排除空氣15min后，以7℃/s升溫至400℃，熱裂解1h后，收集熱裂解產(chǎn)物。將熱裂解產(chǎn)物在超聲作用下洗滌30min，在12000rpm離心30min后收集棕黃色溶液。溶液經(jīng)透析除去小分子雜質(zhì)，獲得水溶性熒光碳點，冷凍干燥獲得熒光碳點晶體，碳點熒光量子產(chǎn)率為30％。將熒光碳點晶體溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度0.3％的熒光碳點水溶液。

將碳點水溶液滅菌后加入到木醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳點水溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1:9。靜置發(fā)酵7天，細菌纖維素產(chǎn)量為4.8g/L，與未添加碳點溶液的發(fā)酵實驗相比，提高50％。