本發(fā)明屬于動(dòng)物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

羊傳染性膿皰病(Orf)由羊口瘡病毒(Orf Virus，ORFV)引起，是世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的人畜共患疾病之一。ORFV不僅能引起小型反芻動(dòng)物和部分野生動(dòng)物感染，還可能污染環(huán)境，造成與受污染環(huán)境密切接觸的人員感染發(fā)病。ORFV的基因組大小為134kb～139kb，為線性雙股DNA，G+C含量豐富占整個(gè)基因組的63％～65％，有132個(gè)基因。病毒基因組的中心區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)長(zhǎng)的中心編碼區(qū)(ORF001～ORF134)，編碼區(qū)兩端是相同的反向末端重復(fù)序列。其中，B2L(ORF011)基因位于中心保守區(qū)，且G+C含量約占B2L總序列的63.3％，使得B2L基因具有很高的穩(wěn)定性。國(guó)內(nèi)外常利用B2L基因的穩(wěn)定性開(kāi)展同源性分析比較和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，鑒定病毒，從分子水平了解毒株間親緣關(guān)系以及變異情況。

病毒的糖蛋白是研究病毒與宿主相互作用的一個(gè)重要靶蛋白。目前對(duì)B2L蛋白如何參與病毒與宿主的相互作用還不清楚。2013年張克山等基于蛋白B2L的氨基酸序列，通過(guò)比較和進(jìn)化樹(shù)分析了34株國(guó)內(nèi)外已測(cè)序公布B2L基因序列的羊口瘡病毒，有14個(gè)株是于2009年至2011年間在國(guó)內(nèi)發(fā)生的。將毒株分為3個(gè)基因型，其中基因型Ⅰ的羊口瘡廣泛分布于中部以及南部省份，與德國(guó)已發(fā)現(xiàn)的D1701株具有同源性，占國(guó)內(nèi)總數(shù)的11/14，基因型Ⅱ的羊口瘡分布于寧夏以及吉林，與印度發(fā)現(xiàn)的分離株具有同源性，占國(guó)內(nèi)總數(shù)的2/14，基因型Ⅲ的羊口瘡分布于東部的山東，與美國(guó)、新西蘭以及韓國(guó)發(fā)現(xiàn)的羊口瘡具有同源性，占國(guó)內(nèi)總數(shù)的1/14。隨后對(duì)發(fā)現(xiàn)的弱毒株與強(qiáng)毒株蛋白B2L的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)氨基酸的突變位點(diǎn)可能是導(dǎo)致ORFV毒力變?nèi)醯脑颉?/p>

利用黑龍江大慶地區(qū)發(fā)現(xiàn)Orf疑似病例，通過(guò)病原分離、病毒形態(tài)學(xué)觀察、間接免疫熒光檢測(cè)(IFA)、DNA序列和氨基酸序列比對(duì)、家兔和小鼠的感染試驗(yàn)以及回歸動(dòng)物試驗(yàn)等，最終確定獲得一株ORFV，命名為OV/HLJ/04。流行株之間遺傳關(guān)系分析基于B2L基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)表明OV/HLJ/04應(yīng)當(dāng)歸類(lèi)于基因Ⅲ型ORFV。

選擇ORFV的B2L基因?yàn)榘谢颍瑯?gòu)建原核表達(dá)載體，將表達(dá)產(chǎn)物純化后用于免疫4～6周齡的雌性BALB/c小鼠，制備單克隆抗體。通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得了3株能夠穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中2E4具備中和ORFV毒力的能力。抗體的間接ELISA試驗(yàn)和Western Blot證明，2E4能夠特異性識(shí)別B2L蛋白，顯示出良好的抗體—抗原特異性。B2L蛋白單抗的制備、生物學(xué)特性分析和單抗腹水制備，為ORFV的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了更為便捷的方法。

ORFV B2L蛋白單克隆抗體，與常規(guī)免疫血清相比具有高度的同質(zhì)性和特異性的優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、治療方面和遺傳學(xué)研究等應(yīng)用性潛力巨大。盡管如此，國(guó)內(nèi)外研究ORFV單抗及其應(yīng)用的工作并不多見(jiàn)，進(jìn)展不大。因此，對(duì)于ORFV單抗2E4的詳細(xì)研究顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，對(duì)ORFV單抗2E4做一步的詳細(xì)研究。

本發(fā)明的第二目的是提供上述羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4的編碼基因。

本發(fā)明的第三目的是提供上述羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4的編碼基因的特異性PCR引物。

本發(fā)明的第四目的是提供上述羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4的用途。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一、一種羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

二、上述的羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4的編碼基因，其輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

三、上述的羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4的編碼基因的特異性PCR引物，序列如下：

輕鏈可變區(qū)：

上游引物2E4LF：CAGCTG ACCCAGTCTCCAGC；(SEQ ID No.5)

下上游引物2E4LR:CCGTTTTATTTCCAGCTTGG TCCC；(SEQ ID No.6)

重鏈可變區(qū)：

上游引物：2E4HF:GTCCAACTACAG CAGCCTGGG；(SEQ ID No.7)

下游引物2E4HR:TGAGGAGA CTGTGAGAGTGGTG。(SEQ ID No.8)

四、上述的羊傳染性膿皰病毒流行株OV/HLJ/04單克隆抗體2E4在制備治療羊口瘡藥物中的應(yīng)用。

具體如下：將單克隆抗體2E4的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，抽提總RNA并合成cDNA，以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的鼠源抗體可變區(qū)基因特異性引物，分別擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因，并將PCR產(chǎn)物分別克隆于pMD18T載體，送上海生工公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，從而獲得單抗2E4輕重鏈可變區(qū)序列基因中CDRs和FRs結(jié)構(gòu)域一級(jí)結(jié)構(gòu)。繼而，采用SWISS-MODEL網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)和Discovery Studio(DS)Modeling 1.1軟件成功模擬了抗體單鏈鏈可變區(qū)(single-chain variable fragment,scFv)氨基酸的3D空間構(gòu)型，在分子層面上闡述和分析了2E4抗體可變區(qū)特征。

采用上述技術(shù)方案的積極效果：本發(fā)明對(duì)ORFV單抗2E4的序列進(jìn)行了精確鑒定，并對(duì)該抗體的氨基酸的3D空間構(gòu)型進(jìn)行了模擬，在分子層面上闡述和分析了2E4抗體可變區(qū)特征，不僅可以提供單克隆抗體在氨基酸水平上與其表位相互作用的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，并有助于今后研制羊口瘡診斷制劑和開(kāi)發(fā)基因工程抗體制劑。

附圖說(shuō)明

圖1是2E4單抗雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，A:雜交瘤細(xì)胞(10×)；B:雜交瘤細(xì)胞(20×)；

圖2是2E4抗體輕鏈和重鏈PCR擴(kuò)增和酶切鑒定結(jié)果；

圖3是2E4輕鏈可變區(qū)序列及其功能區(qū)，CDR1-3:互補(bǔ)決定區(qū)；FR1-3:骨架區(qū)；

圖4是2E4重鏈可變區(qū)序列及其功能區(qū)，CDR1-3:互補(bǔ)決定區(qū)；FR1-3:骨架區(qū)；

圖5是2E4輕鏈可變區(qū)進(jìn)行IgBLAST分析結(jié)果；

圖6是2E4重鏈可變區(qū)進(jìn)行IgBLAST分析結(jié)果；

圖7是2E4輕鏈可變區(qū)(V_L)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)機(jī)構(gòu)；

圖8是2E4重鏈可變區(qū)(V_H)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)機(jī)構(gòu)；

圖9是2E4重鏈可變區(qū)/輕鏈可變區(qū)(V_H-V_L)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)機(jī)構(gòu)；

圖10是2E4重鏈可變區(qū)/輕鏈可變區(qū)(V_H-V_L)三級(jí)機(jī)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域，圖中，虛線 的橢圓形區(qū)域代表抗體特異性結(jié)構(gòu)域(其中兩個(gè)CDR3起關(guān)鍵作用，而兩個(gè)CDR1和兩個(gè)CDR2只負(fù)責(zé)輔助CDR3共同形成該結(jié)構(gòu)域)；綠色箭頭表示幾個(gè)CDR對(duì)抗體結(jié)構(gòu)域的形成具有輔助作用；白色箭頭表示該結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)抗原表位錨定于此空間構(gòu)象之中。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中生物材料的來(lái)源：

1、單克隆抗體2E4的雜交瘤細(xì)胞：羊口瘡病毒的分離鑒定及B2L囊膜蛋白單克隆抗體的制備，譚強(qiáng)，碩士論文，授予單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，導(dǎo)師：崔玉東，發(fā)表時(shí)間：2014年，并由申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；

2、所有引物為自行設(shè)計(jì)并委托金唯智北京公司合成。

下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制：

實(shí)施例1

本實(shí)施例說(shuō)明雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)和抗體檢測(cè)。

(1)雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)將凍存的2E4單抗雜交瘤細(xì)胞從液氮罐中取出后，快速放入37℃水浴鍋中，10～30秒搖動(dòng)一次，直到融化。從水浴鍋中取出并移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液槍轉(zhuǎn)入到15mL離心管內(nèi)，并加入37℃預(yù)熱的無(wú)血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，2000rpm離心3min，棄上清。用10mL經(jīng)過(guò)預(yù)熱的RPMI-1640完全培養(yǎng)液(10％FBS，1％青鏈霉素)重懸管內(nèi)細(xì)胞，至細(xì)胞完全混勻，然后將細(xì)胞懸液全部移入10cm培養(yǎng)皿內(nèi)，最后將培養(yǎng)皿移入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞傳代按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)如圖1所示。

(2)抗體ELISA檢測(cè)用提純的病毒抗原包被于微孔板中，4℃過(guò)夜。5％脫脂乳封閉，37℃1h，PBS洗板。加入100μL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫育1h后洗滌，加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，洗滌后加入底物TMB，避光顯色10min，用2M H2SO4終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)450nm測(cè)定吸光值。結(jié)果如表1所示，抗體滴度達(dá)到1:1280。

表1 2E4雜交瘤細(xì)胞上清抗體滴度檢測(cè)效價(jià)結(jié)果

實(shí)施例2

本實(shí)施例說(shuō)明雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取。

將2E4雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)至最佳狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量約為1×10⁷/ml，3000rpm離心3min洗滌細(xì)胞；加入1ml Trizol溶液使細(xì)胞沉淀輕微震蕩溶解，充分混勻后室溫靜置5min；加入200μL氯仿，充分震蕩混勻，4℃12000rpm離心15min；取上層水相500μL并加入500μL異丙醇，充分混勻后于-20℃靜止沉淀1h；4℃12000rpm離心10min，棄去上清液；用提前預(yù)冷的1ml 75％乙醇洗滌沉淀，4℃12000rpm離心5min，棄去上清液；干燥RNA，溶于20μL經(jīng)DEPC處理的水中，可55-60℃水浴助溶，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ煤怂岱治鰞x測(cè)定提取RNA的濃度及質(zhì)量。

實(shí)施例3

本實(shí)施例說(shuō)明RT-PCR擴(kuò)增VL、VH基因。

為了去除殘存的基因組DNA對(duì)RNA產(chǎn)生的影響，反應(yīng)體系如下：提取的RNA樣品1μL，5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，滅菌水6μL，總體積為10μL。該反應(yīng)于42℃水浴2min或室溫靜止5min，4℃保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：上述反應(yīng)液10μL，Buffer 2(for Real Time)4μL，RT Enzyme MixI 1μL，RT Primer Mix 1μL，滅菌水4μL，總體積為20μL。該反應(yīng)于37℃水浴15min，85℃5s，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用核酸分析儀測(cè)定其濃度，4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)GenBank中鼠源單克隆抗體的參考序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，序列如下：

輕鏈可變區(qū)：

上游引物2E4LF：CAGCTG ACCCAGTCTCCAGC(SEQ ID No.5)；

下上游引物2E4LR:CCGTTTTATTTCCAGCTTGG TCCC(SEQ ID No.6)；

重鏈可變區(qū)：

上游引物：2E4HF:GTCCAACTACAG CAGCCTGGG(SEQ ID No.7)；

下游引物2E4HR:TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG(SEQ ID No.8)。

反應(yīng)體系如下：cDNA 1μL，dNTPs 2μL，輕/重鏈上、下游引物各0.5μL，10×Trans HiFi Buffer I 2.5μL，TransHiFi DNA Polymerase 0.25μL，滅菌水18.25μL， 總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL于含有1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果：V_L基因片段大小為330bp，V_H基因片段大小為360bp，與預(yù)期的V_L和V_H基因片段大小相符(圖2-A)；PCR產(chǎn)物連接T載體后，酶切鑒定結(jié)果如圖2-B所示。

實(shí)施例4

本實(shí)施例說(shuō)明PCR產(chǎn)物克隆質(zhì)粒的鑒定及測(cè)序。

參照OMEGA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收輕、重鏈PCR產(chǎn)物。連接體系分別共10μL：回收的PCR產(chǎn)物4.5μL，PMD18-T Vector 0.5μL，Solution I 5μL，16℃連接過(guò)夜。取10μL連接產(chǎn)物于100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液中，冰浴30min，42℃熱擊90s，冰浴5min后加入LB液體培養(yǎng)基700μL，37℃振蕩培養(yǎng)1h；5000r/min離心10min，棄上清液留約100μL，重懸沉淀，涂布于含Amp的LB平板上，37℃培養(yǎng)14h，挑取單菌落小量培養(yǎng)，參照OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取重組質(zhì)粒。

分別以輕、重鏈重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并用BamH I和Hind III酶切(37℃酶切1h)鑒定，于2％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。取鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

實(shí)施例5

本實(shí)施例說(shuō)明可變區(qū)測(cè)序結(jié)果BLAST和功能區(qū)分析。

由于單抗2E4的VH和VL測(cè)序結(jié)果，上傳GenBank進(jìn)行BLIAST搜索，從而獲得輕重鏈可變區(qū)CDR和FR框架結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖3、圖4所示。然后按Kabat等(72)的方法對(duì)VH和VL基因片段進(jìn)行序列分析。發(fā)現(xiàn)所展示的可變區(qū)信息與IgG的抗體信息同源性較高，如圖5、圖6所示。表位與國(guó)外報(bào)道的位置相似，因此將4B2與國(guó)外先前發(fā)表的相關(guān)單抗進(jìn)行抗體重鏈可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)序列氨基酸同源性比對(duì)，確定單抗之間的異同點(diǎn)，進(jìn)而分析確定表位間的遠(yuǎn)近關(guān)系。利用SWISS-MODEL和Discovery Studio(DS)Modeling 1.1生物信息軟件對(duì)于所建的分子模型優(yōu)化處理。在模型中找到相關(guān)表位或位點(diǎn)位置，在空間結(jié)構(gòu)下分析表位特征。結(jié)果如圖7-10所示。

本發(fā)明對(duì)ORFV單抗2E4的序列進(jìn)行了精確鑒定，并對(duì)該抗體的氨基酸的3D空間構(gòu)型進(jìn)行了模擬，在分子層面上闡述和分析了2E4抗體可變區(qū)特征，不僅可以提供 單克隆抗體在氨基酸水平上與其表位相互作用的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，并有助于今后研制羊口瘡診斷制劑和開(kāi)發(fā)基因工程抗體制劑。