一種檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)（Lateral Flow Assay)檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒所用的引物和探針組合及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引 起的牛傳染性鼻氣管炎，是牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床上呈多種表現(xiàn)類型，特 別是該病能引起免疫抑制，繼發(fā)性的細(xì)菌感染能導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道疾病。目前此病在世 界范圍內(nèi)廣泛流行，且該病嚴(yán)重影響著國(guó)際牛業(yè)生產(chǎn)貿(mào)易，已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE) 列為B類傳播性疾病。我國(guó)于20世紀(jì)70年代末從新西蘭進(jìn)口的奶牛中檢測(cè)到IBRV，由于 沒有很好的免疫防護(hù)措施，隨后我國(guó)多數(shù)省份的牛群中均有此病毒感染，對(duì)牛群的肥育、產(chǎn) 奶和繁殖影響極大，給牛場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)該病的診斷方法主要有病原分離、 PCR方法、ELISA試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)等，由于這些方法需要精密的儀器以及繁瑣的試驗(yàn)程 序，難以滿足非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。因而亟需建立一套快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的診斷 方法，為臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及疫情監(jiān)測(cè)等提供新一代的檢測(cè)技術(shù)與手段。
[0003] 重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplif ication，RPA)，是一種不同 于PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，主要有結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚 合酶三種酶參與。其原理是利用重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA 中尋找同源序列。在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配 對(duì)形成復(fù)制所需的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，形成新的DNA互補(bǔ) 鏈，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。引物序列的設(shè)計(jì)與選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。 在RPA擴(kuò)增體系中加入一個(gè)生物素標(biāo)記的反向引物和5'熒光標(biāo)記的探針，探針標(biāo)記的熒光 基團(tuán)30個(gè)堿基處有一個(gè)脫堿基位點(diǎn)（dSpacer)，該位點(diǎn)是DNA修復(fù)酶作用的底物，可被核酶 nfo識(shí)別切割，產(chǎn)生新的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，從而使雙標(biāo)信 號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的累積同步，檢測(cè)結(jié)果可在抗FAM金標(biāo)結(jié)合和抗生物素捕獲抗體的側(cè)流層析 試紙條上顯示。
[0004] 目前對(duì)于RPA技術(shù)的研宄尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)外還沒有將RPA技術(shù)應(yīng)用于IBRV 檢測(cè)的報(bào)道。本發(fā)明系首次采用RPA技術(shù)建立快速檢測(cè)IBRV的方法，并通過特異性和靈敏 度評(píng)價(jià)，可用于臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為IBRV的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供一種靈敏、可靠的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)RPA技術(shù)應(yīng)用于IBRV檢測(cè)領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便檢 測(cè)IBRV的RPA檢測(cè)方法。僅需通過對(duì)臨床樣品進(jìn)行病毒DNA粗提取并進(jìn)行RPA等溫?cái)U(kuò)增， 結(jié)果可在側(cè)流層析試紙條上清晰顯示，不需要熱循環(huán)反應(yīng)，不必在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，具有 靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)程序簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下臨床現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] -種用于通過RPA技術(shù)檢測(cè)IBRV的引物和探針組合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列如SEQ ID No. 3所示。
[0008] 正向引物：5' -TTCCGACCAGCGCCGAATCTTGGATGCAGTACT-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0009] 反向引物：5' -GGCCAAAACCGCTTTCAGAAGCAGAGCAAGGTGA-3'（5' -端用 Biotin 標(biāo) 記）；（SEQ ID No. 2)
[0010] 探針序列：5' -CCGCAAAGTGCCGAGGGATGTCCTTGTAGT【dSpacer】 CAGGTCCACCTTCCGCT-3'（探針5' -端用FAM標(biāo)記，距離5' -端30個(gè)堿基左右的位置處用 dSpacer替代一個(gè)堿基，3'端用C3_spacer阻斷）。
[0011] 需要說明的是：與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA反應(yīng)所需引物的長(zhǎng)度通常為30-35bp， 探針序列的長(zhǎng)度為46-52bp，引物設(shè)計(jì)時(shí)為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度 的增加也使引物設(shè)計(jì)及選擇難度的增加，因此，引物的設(shè)計(jì)和選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。 RPA技術(shù)正處于起步研宄階段，尚無專門的引物、探針設(shè)計(jì)軟件，也沒有大量的數(shù)據(jù)為其引 物設(shè)計(jì)原則提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)多對(duì)引 物進(jìn)行優(yōu)化、篩選才能得到。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)IBRV的試劑盒，該試劑盒中包含有用于通過RPA技術(shù)檢 測(cè)IBRV的引物和探針組合。
[0013] 進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括有：IBRV陽(yáng)性對(duì)照模板、RPA擴(kuò)增試劑、去離子水和 側(cè)流層析檢測(cè)試劑。IBRV陽(yáng)性對(duì)照模板、RPA擴(kuò)增試劑、去離子水與引物和探針組合一起構(gòu) 成擴(kuò)增體系。
[0014] 所述RPA擴(kuò)增試劑包括Rehydration緩沖液、大腸桿菌來源的recA重組酶、鏈置 換DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB)、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液。
[0015] 所述RPA側(cè)流層析檢測(cè)試劑包括側(cè)流層析試紙條，雜交檢測(cè)緩沖液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0016] 所述IBRV陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法為：分別在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物對(duì)的上游和下游設(shè)計(jì)引物：
[0017] 上游引物：5' -GCCAAGCGCAGCAGGCAGGTGAAT-3'（SEQ ID No. 4);
[0018] 下游引物：5' -CGACTGGGCGTACATCTCGGAGAA-3'（SEQ ID No. 5);
[0019] 以IBRV的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μ L:10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5yL、2. 5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5yL(5U/yL)、模板 2yL， 10 μ mol/L的上下游引物各2 μ L，滅菌超純水加至50 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min，然 后進(jìn)入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，最后停止于4°C。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至pEAST-T3載體，（為常規(guī)的載體， 商業(yè)化購(gòu)買到）藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，送華大基因進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，正確的 重組質(zhì)粒為IBRV陽(yáng)性對(duì)照模板。
[0020] 具體的，一種檢測(cè)IBRV的試劑盒，每50 μ L擴(kuò)增體系中含有正向引物、反向引物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探針 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，IBRV 陽(yáng)性對(duì)照模板 2 μ L，Rehydration 緩沖 液29. 5 μ L，去離子水11. 2 μ L和醋酸鎂溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0021] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用RPA技術(shù)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)檢測(cè)IBRV的方法，步驟如 下：
[0022] (1)應(yīng)用快速提取病毒基因組DNA試劑盒提取細(xì)胞培養(yǎng)病毒上清液的IBRV DNA ;
[0023] (2)根據(jù)IBRV保守區(qū)域設(shè)計(jì)RPA特異性引物和探針，向RPA擴(kuò)增試劑盒推 薦反應(yīng)的50 yL擴(kuò)增體系中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 μ mol/L)，探針 0· 6 yL(10 ymol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 緩沖液，11. 2 yL 去離子水和 2. 5 μ L醋酸鎂溶液（280mM)，于含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反應(yīng)管中，恒溫水浴 鍋內(nèi)38 °C反應(yīng)25分鐘；
[0024] (3)取I UL擴(kuò)增產(chǎn)物，應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)，若側(cè)流層析試紙條上顯現(xiàn) 出檢測(cè)帶和對(duì)照帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，若試紙條僅顯示對(duì)照帶，則結(jié)果為陰性。
[0025] 應(yīng)用上述方法可以篩選出一套可快速有效檢測(cè)出IBRV成分的引物及探針組合。
[0026] 以已知病毒滴度為8. OX IO7TCID5cZmL的IBRV用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋后， 提取DNA后進(jìn)行同步檢測(cè)，結(jié)果顯示可以檢測(cè)到0. STCID5tl的靶標(biāo)分子，證明該方法具有較 高的靈敏度。
[0027] 以8. OX Io3TCID5qIBRV樣品的DNA作為模板，利用上述優(yōu)化的引物