一種利用攪拌式生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用攪拌式生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳染性法氏囊病(Infect1us Bursal Disease，IBD)是由雙RNA病毒科，禽雙RNA病毒屬的傳染性法氏囊病毒(Infect1us Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一種高度接觸性傳染病。本病主要侵害雞的體液免疫中樞器官法氏囊等淋巴組織，對養(yǎng)禽業(yè)的危害主要包括兩個(gè)方面。一方面是疾病本身可以造成3周齡或更大的雛雞臨床發(fā)病或死亡；另一方面可以對雞體產(chǎn)生長期的免疫抑制，引起繼發(fā)其它疾病(主要是雞馬立克、新城疫，大腸桿菌病、沙門氏菌病等)，致使死亡率明顯升高，可達(dá)80%以上，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]預(yù)防該病主要通過接種疫苗來實(shí)現(xiàn)，其中滅活疫苗占了很大的比例。目前我國體外培養(yǎng)傳染性法氏囊病毒的方法主要是利用雞胚增殖或細(xì)胞系于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)兩種方法。這種方法勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長，效率低，生產(chǎn)成本高；不同生產(chǎn)批次間或同一生產(chǎn)批次不同轉(zhuǎn)瓶間的差異大，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難以擴(kuò)大生產(chǎn)；容易被環(huán)境污染，常出現(xiàn)細(xì)菌或其它病毒的污染從而導(dǎo)致疫苗質(zhì)量存在隱患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。采用規(guī)模化的生物反應(yīng)器有望改善上述缺陷，然而由于不同細(xì)胞株、毒株具有完全不同的生物學(xué)特性，因此在利用生物反應(yīng)器執(zhí)行傳染性法氏囊病毒制備的過程中缺乏一種普遍性的操作方法，也就是說，針對不同細(xì)胞株、毒株需要設(shè)計(jì)特定的培養(yǎng)條件。此外，相對于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)而言，生物反應(yīng)器培養(yǎng)傳染性法氏囊病毒的規(guī)模較大，可控參數(shù)較多，因此如何在此規(guī)?；A(chǔ)上保證細(xì)胞的增殖速率、病毒的效價(jià)，現(xiàn)有技術(shù)中尚未形成有效方法。
[0004]目前動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的種類較多，對于DF1細(xì)胞的培養(yǎng)，目前國內(nèi)已有單位采用激流式生物反應(yīng)器完成了大規(guī)模生產(chǎn)。但由于激流式生物反應(yīng)器的特殊結(jié)構(gòu)，它只能利用紙片載體進(jìn)行培養(yǎng)，采用的是一次性生物耗材，易造成浪費(fèi)，更重要的是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，不能隨時(shí)觀察細(xì)胞的狀態(tài)，難以靈活掌控最佳接毒時(shí)間。與激流式生物反應(yīng)器相比，攪拌式生物反應(yīng)器靠攪拌槳提供液相攪拌的動(dòng)力，有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性，易于清洗和消毒，可以重復(fù)和長期使用。它采用應(yīng)用最廣泛的微載體作為培養(yǎng)載體，可以隨時(shí)取樣，觀察細(xì)胞狀態(tài)，繪制生長曲線，準(zhǔn)確掌握最佳接毒及收毒時(shí)間，得到最高滴度的病毒液。因此，在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中占有重要位置，目前國內(nèi)外有很多的相關(guān)研究和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種利用攪拌式生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中相關(guān)方法自動(dòng)化程度低、質(zhì)量不穩(wěn)定的技術(shù)問題。
[0006]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)方法所生產(chǎn)的傳染性法氏囊病毒效價(jià)較低。
[0007]本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)方法安全性較低。
[0008]本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒時(shí)如何保證質(zhì)量穩(wěn)定。
[0009]本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒時(shí)如何提升疫苗效價(jià)。
[0010]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0011]—種利用攪拌式生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒的方法，包括以下步驟:
[0012]1)在攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)，將滅菌后的微載體以3?6g/L的用量與無菌細(xì)胞生長液混合，得到混合培養(yǎng)基，向其中接種DF1細(xì)胞的密度為0.6?1.2 X 106個(gè)/ml,使DF1細(xì)胞在微載體上吸附培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度36?37°C、pH7.2?7.3、溶氧40?60%、攪拌速度30?80rpm ；
[0013]2)接種DF1細(xì)胞48?72h后，棄去混合培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長液，加入細(xì)胞維持液，接入0.3?1.2M0I的傳染性法氏囊病毒，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0014]3)接種病毒24?48h后，收獲病毒液。
[0015]作為優(yōu)選，步驟1)中混合培養(yǎng)基總體積是攪拌式生物反應(yīng)器總?cè)莘e的40?60%。
[0016]作為優(yōu)選，步驟1)中接種細(xì)胞前反應(yīng)器先攪拌20?60min。
[0017]作為優(yōu)選，步驟1)種所述微載體是通過以下方法滅菌的:
[0018]A)以PBS緩沖液對微載體浸泡4h以上；
[0019]B)將步驟A)浸泡后的微載體用PBS緩沖液清洗；
[0020]C)將步驟B)清洗后的微載體在PBS緩沖液浸泡條件下115?125°C滅菌25?35min。
[0021]作為優(yōu)選，步驟1)中用于接種的DF1細(xì)胞先經(jīng)EDTA-胰酶消化液消化，而后再接種；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述Η)ΤΑ-胰酶消化液是含有0.03?0.05% (w/v)的胰酶和 0.02% (w/v)EDTA 的 PBS 緩沖液。
[0022]作為優(yōu)選，步驟1)細(xì)胞生長液中含有90% (v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基和10% (v/V)的新生牛血清；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，在向所述細(xì)胞生長液接種DF1細(xì)胞前，先向細(xì)胞生長液中加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素，至青霉素鈉終含量100IU/mL、硫酸鏈霉素終含量100IU/mLo
[0023]作為優(yōu)選，步驟2)中棄去混合培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長液時(shí)DF1細(xì)胞對微載體表面的占據(jù)率高于85%，微載體的空球率低于5%。
[0024]作為優(yōu)選，步驟3)中收獲病毒液時(shí)病毒效價(jià)達(dá)到最高。
[0025]作為優(yōu)選，所述微載體是Cytodex系列微載體。
[0026]在以上技術(shù)方案中，用于接種的病毒毒種可以是通過以下方法制備的:用病毒培養(yǎng)液將傳染性法氏囊病毒種毒按Μ0Ι量為0.3-1.2接種到單層傳代細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，至接毒后24-48h，當(dāng)毒價(jià)最高時(shí)，收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID5。和無菌檢測，傳至病毒TCID 5。穩(wěn)定且達(dá)到10&5TCID5Q/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)用種毒。其中，所述病毒培養(yǎng)液的優(yōu)選配方為:98% DMEM/F12、2%新生牛血清、終濃度為100U/ml青霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH值為7.2-7.3ο
[0027]在以上技術(shù)方案中，所述空球率是指微載體上未被細(xì)胞附著的表面積占微載體總表面積的比例，該指標(biāo)用于評價(jià)細(xì)胞在微載體上的貼附生長狀況。所述DF1細(xì)胞是一種可傳代的雞胚成纖維細(xì)胞系，可自市面購得。所述Cytodex系列微載體，僅限定于由GE公司出品的、型號為Cytodex的一系列微載體產(chǎn)品。
[0028]本發(fā)明利用了攪拌式生物反應(yīng)器操作范圍較大、混合性良好以及濃度均勻等優(yōu)點(diǎn)，通過攪拌作用提升培養(yǎng)液質(zhì)傳效果，確保培養(yǎng)液的養(yǎng)分和溶氧濃度的均勻分布，達(dá)到大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的目的。和其他生物反應(yīng)器相比，其結(jié)構(gòu)簡單、成本較低。
[0029]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0030](1)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)傳染性法氏囊病毒疫苗，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價(jià)低的問題，通過生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改變，提高病毒單位培養(yǎng)效價(jià)10-100倍，大大降低生產(chǎn)成本，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安全性。
[0031](2)與激流式生物反應(yīng)器相比，攪拌式生物反應(yīng)器混合均勻、結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、有良好的傳遞效果和操作彈性，能實(shí)時(shí)掌握細(xì)胞生長狀態(tài)，更易掌握病毒液最佳收獲時(shí)間，提高疫苗效價(jià)。
[0032](3)低污染:本發(fā)明用細(xì)胞系代替原代細(xì)胞或者雞胚組織培養(yǎng)傳染性法氏囊病毒，可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹。
[0033](4)生產(chǎn)工藝可控:高精密培養(yǎng)、實(shí)時(shí)監(jiān)測溶氧、產(chǎn)氣、殘?zhí)恰H、細(xì)胞狀態(tài)等，綜合參數(shù)設(shè)定培養(yǎng)曲線，直接保證載體細(xì)胞的狀態(tài)；生產(chǎn)批量大、批間差異??；節(jié)省空間、人力和物力。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下將對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0035]以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10%)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
[0036]除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
[0037]以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0038]實(shí)施例1
[0039](1)選擇生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)的手段:10L德國sartorius stedim生物反應(yīng)器。
[0040]⑵選擇微載體作為細(xì)胞貼附生長的載體:微載體Cytodex 1。
[0041](3)微載體的清洗、滅菌方法:1)稱量Cytodexl微載體3g/L，用1L PBS常溫過夜浸泡微載體；2)用1L PBS清洗3遍；3)用1L PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30min。
[0042](4)選擇DF1細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞。
[0043](5)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):上述細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶(含0.03%胰酶、0.02%EDTA的PBS)消化傳代，用含90% DMEM/F12培養(yǎng)液、10%新生牛血清、100IU/mL的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，pH值調(diào)整為7.2的細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時(shí)，接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。
[0044](6)細(xì)胞毒種的繁殖:用病毒培養(yǎng)液(含新生牛血清2%的DMEM/F12培養(yǎng)液、終濃度為100IU/mL的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，將傳染性法氏囊病毒HQ株的種毒按Μ0Ι量為0.6接種生長良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。至接毒后40h即毒價(jià)最高時(shí)收獲病毒液；測定病毒的TCID5。，待病毒效價(jià)穩(wěn)定且達(dá)到10&5TCIDM/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，將該病毒作為生產(chǎn)用種毒。
[0045](7) DF1細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取轉(zhuǎn)瓶上生長良好的DF1細(xì)胞，用pH值為7.2的PBS清洗兩遍，加入前述的EDTA-胰酶消化液消化，待細(xì)胞層開始出現(xiàn)整片脫落，加入所述的細(xì)胞生長液，吹懸制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度按0.8X 106個(gè)/mL接種反應(yīng)器中。生物反應(yīng)器設(shè)定如下參數(shù):溫度37°C、pH值7.2、攪拌速度40rpm、溶氧含量40 %進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制