一種漢坦病毒擴增方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)技術領域，進一步涉及疫苗抗原制備技術領域，具體涉及一種漢坦病毒擴增方法。
【背景技術】
[0002]漢坦病毒歸屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節(jié)段的負鏈RNA病毒，基因組包括L、M、S 3個片段，分別編碼L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。漢坦病毒具有極強的傳染性，人感染后可能導致死亡。對于漢坦病毒感染病例，臨床上主要是對癥治療配合高免血清和單克隆抗體治療，從療效、成本等方面考慮都不盡理想，綜合來看通過疫苗免疫是應對該病毒的根本措施。這就涉及到漢坦病毒抗原的擴增技術。
[0003]現(xiàn)有技術中漢坦病毒抗原生產(chǎn)主要采用細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)抗原病毒含量較低，僅為104.5?6'°TCID5(]/ml，不能提供穩(wěn)定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量應彡107-°TCID50/ml)，需要進行高倍濃縮，且轉(zhuǎn)瓶工藝勞動強度大，生產(chǎn)一批需要100?200個轉(zhuǎn)瓶，需多人同時進行長時間的消化傳代操作，增加污染風險；生產(chǎn)周期長，需要20天；效率較低，每次培養(yǎng)只能收獲一次；生產(chǎn)成本較高，人工、場地及原料費用大；對環(huán)境要求較高，需要較大的場地和GMP廠房；不同生產(chǎn)批次及同一生產(chǎn)批次的轉(zhuǎn)瓶之間存在較大差異，容易造成批內(nèi)及批間的抗原質(zhì)量差異，進而影響病毒抗原質(zhì)量的穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)瓶清洗需要大量水，并且產(chǎn)生的含毒廢水需要專門處理，容易對環(huán)境造成污染，如處理不當會造成生物安全和公共衛(wèi)生問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種漢坦病毒擴增方法，以解決現(xiàn)有技術中存在的培養(yǎng)效率較低的技術問題。
[0005]本發(fā)明解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術的漢坦病毒擴增方法質(zhì)量不穩(wěn)定。
[0006]本發(fā)明解決的再一技術問題是現(xiàn)有技術的漢坦病毒擴增方法產(chǎn)量較低。
[0007]為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0008]—種漢坦病毒擴增方法，該方法以C0S-1細胞作為宿主細胞擴增漢坦病毒，同時以激流式生物反應器作為細胞培養(yǎng)裝置。
[0009]優(yōu)選地，該方法是先以激流式生物反應器培養(yǎng)C0S-1細胞，而后再向細胞培養(yǎng)液中接種漢坦病毒，擴增漢坦病毒。
[0010]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)C0S-1細胞，是在激流式生物反應器中采用微載體懸浮培養(yǎng)的方式培養(yǎng)cos-ι細胞。
[0011 ] 優(yōu)選地，該方法包括以下步驟:
[0012]1)向激流式生物反應器中加入細胞培養(yǎng)液，以(0.1?1) X 106個細胞/mL培養(yǎng)液的比例接種C0S-1細胞培養(yǎng)，所述反應器中具有微載體；
[0013]2)當細胞密度達到(1?10) X 106個細胞/mL培養(yǎng)液時以0.01?0.03M0I的接種量向培養(yǎng)液中接入漢坦病毒，繼續(xù)培養(yǎng)細胞；
[0014]3)取培養(yǎng)液固液分離，收集上清即得到漢坦病毒液。
[0015]優(yōu)選地，步驟1)中細胞培養(yǎng)液的加入量為激流式生物反應器最大裝液量的1/2?3/4。
[0016]優(yōu)選地，步驟1)中用于接種的C0S-1細胞，是經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化得到C0S-1細胞懸液。
[0017]優(yōu)選地，步驟2)中當細胞密度達到(1?10) X 106個細胞/mL培養(yǎng)液時，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4?6h，而后以0.01?0.03M0I的接種量向培養(yǎng)液中接入漢坦病毒，再繼續(xù)培養(yǎng)細胞。
[0018]優(yōu)選地，步驟3)中當微載體上細胞全部脫落后，取培養(yǎng)液固液分離，收集上清即得到漢坦病毒液。
[0019]優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)液包括以下成分:85?90 % (w/w)的DMEM液，青霉素鈉80?120單位/ml，鏈霉素80?120單位/ml，余量為牛血清；所述培養(yǎng)基pH為7?7.8。
[0020]優(yōu)選地，步驟1)中對細胞的培養(yǎng)或步驟2)中接種漢坦病毒后對細胞的培養(yǎng)，滿足以下培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度35?39°C，培養(yǎng)液pH7?7.8，培養(yǎng)液溶氧45?55 %，攪拌速度50 ?70rpm。
[0021]在以上技術方案中，生產(chǎn)用C0S-1細胞以及生產(chǎn)用漢坦病毒種毒是由一級種子經(jīng)活化、傳代所得到的；用于培養(yǎng)和接種病毒的細胞需要利用m)TA-胰酶細胞分散液消化，所述Η)ΤΑ-胰酶細胞分散液的配方可以是:含質(zhì)量體積分數(shù)0.25%的規(guī)格1: 250胰酶、0.02% EDTA的PBS液；其中規(guī)格1: 250胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶；所述微載體可以選自商品型號為Cytodex的系列微載體，例如可以是型號為Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3的微載體，微載體在使用前，需清洗、滅菌，具體步驟為:1)稱量Cytodex微載體500g、使用20L PBS液浸泡過夜；2)用10L PBS液清洗3遍；3)加入10L PBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘；微載體加入反應器中，用DMEM清洗微載體。
[0022]本發(fā)明方法創(chuàng)新性的利用C0S-1細胞作為漢坦病毒的宿主細胞，尤其有利于病毒的擴增；采用激流式生物反應器較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶方式工藝更易于控制，產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定；采用微載體的培養(yǎng)方式可以充分利用培養(yǎng)液，保持了貼壁細胞的生長特性，同時實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)的作用。與此同時，本發(fā)明針對C0S-1細胞、漢坦病毒自身特性以及生物反應器的培養(yǎng)環(huán)境匹配了特定的培養(yǎng)條件，從培養(yǎng)液成分、接種量、條件參數(shù)等方面進行了優(yōu)化設計，使得漢坦病毒擴增效率得到顯著提升。本發(fā)明以巧妙的技術構(gòu)思實現(xiàn)了突出的技術效果，且成本較低、易于實現(xiàn)，具備突出的推廣前景。
【具體實施方式】
[0023]以下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。
[0024]實施例1
[0025]1、生產(chǎn)用細胞的傳代與培養(yǎng)
[0026]取生長良好的C0S-1細胞，經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液(EDTA-胰酶細胞分散液為含質(zhì)量體積分數(shù)0.25%的規(guī)格1: 250胰酶、0.02%EDTA的PBS液；其中規(guī)格1: 250胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶)消化傳代，以含質(zhì)量分數(shù)90% DMEM液、10%牛血清、青霉素鈉和鏈霉素各100單位/ml，pH調(diào)整為7.4的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層C0S-1細胞，用于繼續(xù)傳代或傳代后接種于生物反應器中進行微載體懸浮培養(yǎng)。
[0027]2、生產(chǎn)用種毒的繁殖
[0028]在C0S-1細胞培養(yǎng)2天形成單層后，倒掉細胞生長液，經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化，用步驟1中生長液將分散液混勻，以1: 2比例分裝后培養(yǎng)4?6小時，接種漢坦病毒，漢坦病毒的接種量與細胞生長液的體積比為1: 50，將細胞液與病毒液混勾充分浸沒細胞，置于37°C、體積百分含量為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，當80%?85%細胞出現(xiàn)病變時，收獲病毒置于_20°C冰箱中，反復凍融細胞三次，使病毒從細胞中充分釋放出來，然后分裝液體，置_70°C或液氮保存?zhèn)溆?，此病毒液作為生產(chǎn)用種毒；
[0029]3、C0S-1細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養(yǎng)
[0030]向無菌檢驗合格的、含有微載體的生物反應器中加入總培養(yǎng)體積的2/3體積的細胞生長液，取步驟1中已形成良好單層C0S-1細胞，經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后按5 X 105個細胞/ml?5 X 10 6個細胞/ml的細胞密度接種于生物反應器中，生物反應器設定培養(yǎng)溫度37°C、PH7.4、溶氧量50 %、攪拌速度60rpm，進行反應器自動控制培養(yǎng)，其中生物反應器容積為75L ;微載體為Cytodex系列微載體，Cytodex系列微載體包括Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3。微載體在使用前，需清洗、滅菌，具體步驟為:1)稱量Cytodex微載體500g、使用20L PBS液浸泡過夜；2)用10L PBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘；微載體加入反應器中，用DMEM清洗微載體。
[0031]4、抗原病毒液的繁殖
[0032]培養(yǎng)后第三日觀察微載體上細胞基本長滿，經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化，用步驟1中生長液將分散液混勻，且細胞計數(shù)結(jié)果達到5X 106個細胞/ml?5X 10 7個細胞/ml時繼續(xù)培養(yǎng)4?6小時，待細胞已經(jīng)吸附到微載體上進行接毒操作，所接入種毒為步驟2中的生產(chǎn)用種毒，病毒培養(yǎng)液配方為:重量分數(shù)為90% DMEM液、10%牛血清，青霉素鈉鏈霉素各100單位/ml，pH為7.4 ;接種量為0.02M0I ;生物反應器設定參數(shù)為培養(yǎng)溫度37°C、pH7.4、溶氧50%、攪拌速度60rpm，進行反應器自動控制培養(yǎng)，接毒后每隔一定時間取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況。
[0033]5、病毒液的收獲
[0034]待微載體上細胞基本全部脫落，且D0值呈明顯上升趨勢，將反應器內(nèi)液體連同微載