一種擴增鴨坦布蘇病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種擴增鴨坦布蘇病毒的方法。利用本發(fā)明所述方法擴增鴨坦布蘇病毒，接毒92h時，細胞活率即降至30%以下，病毒滴度高于1011TCID50/ml。尤其是當接種的鴨坦布蘇病毒數(shù)與BHK-21活細胞數(shù)的比例為1:3-4時，反應(yīng)器內(nèi)增殖病毒滴度顯著高于接種比例為1：1-2時的反應(yīng)器中增殖的病毒滴度，取得了意料不到的技術(shù)效果。
【專利說明】一種擴增鴨坦布蘇病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種擴增鴨坦布蘇病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國江蘇、浙江、山東、福建、江西、河北等地飼養(yǎng)的開產(chǎn)種鴨和蛋鴨暴發(fā) 了一種以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量急劇下降為主要特征的疾病，對我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成的經(jīng)濟損失達30 億以上。流行病學(xué)調(diào)查表明，該病毒危害幾乎所有（除番鴨以外）的產(chǎn)蛋鴨，臨床特征主要 表現(xiàn)為高熱、食欲廢絕、產(chǎn)蛋下降甚至絕產(chǎn)，恢復(fù)后的種鴨所產(chǎn)種蛋受精率和孵化率明顯下 降，群內(nèi)發(fā)病率幾乎100%，產(chǎn)蛋量可下降30%~60%，病死率可達5%~10%。病例剖檢的特征性 變化主要見于卵巢，表現(xiàn)為卵泡發(fā)育不良，卵泡出血、變性和破裂，部分可見卵黃性腹膜炎。 從病死鴨體內(nèi)采集標本進行病原分離鑒定，從形態(tài)學(xué)觀察、理化特性測定、動物回歸實驗和 部分基因序列分析表明，該病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的一個新成員。
[0003] 由于黃病毒科黃病毒屬的成員，可在人和動物之間通過蚊蟲等叮咬吸血造成疾病 流行，從而引起人和動物嚴重的自然疫源性疾病，故應(yīng)加緊對該病毒進行防控，研發(fā)和生產(chǎn) 高效的鴨坦布蘇病毒疫苗尤為重要。目前該疫苗的生產(chǎn)在技術(shù)方面還存在不足，尚未找到 合適的提高病毒滴度和疫苗效價的方法，大大限制了該疾病防控工作的開展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種擴增鴨坦布蘇病毒的新方法。利用該方 法擴增鴨坦布蘇病毒，不僅病毒增殖速度快，而且病毒滴度高，效果顯著。
[0005] 本發(fā)明首先提供一種擴增鴨坦布蘇病毒的方法，包括如下步驟： 1) 將懸浮有BHK-21細胞的細胞培養(yǎng)液接種于生物反應(yīng)器中擴增培養(yǎng)； 2) 將鴨坦布蘇病毒接種到步驟1)擴增培養(yǎng)的BHK-21細胞上； 3) 將步驟2)接毒后的細胞進行再培養(yǎng)； 4) 收獲擴增的子代病毒。
[0006] 所述步驟2)是按照鴨坦布蘇病毒數(shù)：BHK-21活細胞數(shù)=1:1-7的比例將病毒接種 至步驟1)擴增培養(yǎng)的BHK-21細胞上。
[0007] 進一步的，所述步驟2)是按照鴨坦布蘇病毒數(shù)：BHK-21活細胞數(shù)=1:3-4的比例 將病毒接種至步驟1)擴增培養(yǎng)的BHK-21細胞上。
[0008] 利用本發(fā)明所述方法擴增鴨坦布蘇病毒，接毒92h時，細胞活率即降至30%以下， 病毒滴度高于l〇 nTCID5(l/ml。尤其是當接種的鴨坦布蘇病毒數(shù)與BHK-21活細胞數(shù)的比例 為1:3-4時，病毒增殖速度快且病毒滴度高，當接種的病毒數(shù)超過該比例時，病毒滴度反而 明顯下降，取得了意料不到的技術(shù)效果。

【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。
[0010] 實施例1利用懸浮培養(yǎng)的BHK-21細胞擴增鴨坦布蘇病毒 1、 將低血清培養(yǎng)的BHK-21懸浮細胞分別接種于1-7號生物反應(yīng)器中，首次接種體積為 2L (BHK低血清培養(yǎng)基購自北京賽百泰生物技術(shù)有限公司），活細胞密度為2. 7X105/ml，活 率為90%，37 °C培養(yǎng)； 2、 37°C培養(yǎng)24h后，進行活細胞計數(shù)，然后按照鴨坦布蘇病毒數(shù)：BHK-21活細胞數(shù) =1:1-7的比例分別向1-7號培養(yǎng)罐內(nèi)接種病毒，同時向生物反應(yīng)器內(nèi)補加新鮮培養(yǎng)基1L， 調(diào)換溫度至32°C，繼續(xù)培養(yǎng)； 3、 32°C培養(yǎng)24h后（即接毒后24h)，取樣，進行細胞計數(shù)，并計算細胞活率，32°C繼續(xù)培 養(yǎng)； 4、 32°C繼續(xù)培養(yǎng)24h后（即接毒后48h)，再次取樣，進行細胞計數(shù)，計算細胞活率，同時 向生物反應(yīng)器內(nèi)再次補加2L新鮮培養(yǎng)液，32°C繼續(xù)培養(yǎng)； 5、 32°C繼續(xù)培養(yǎng)24h后（即接毒后72h)，再次取樣，進行細胞計數(shù)，計算細胞活率，32°C 繼續(xù)培養(yǎng)； 6、 接毒72h取樣計數(shù)后，每隔4h取樣一次，計數(shù)，進行細胞活率監(jiān)測，待細胞活率降至 30%或以下時進行收毒，將7個反應(yīng)器內(nèi)病毒培養(yǎng)液取出，分別進行分裝，并取樣進行反復(fù) 凍融三次后，進行后續(xù)檢測實驗； 對接毒前后不同時間段的細胞進行取樣，經(jīng)臺盼藍染色后，計數(shù)，計算細胞活率，結(jié)果 表明，接種病毒48h內(nèi)細胞增長較快，活率較高，保持在90%以上；接毒48h后活細胞數(shù)開始 下降，活率明顯降低，在接毒72h時可見明顯細胞病變，接毒72-96h內(nèi)，7個反應(yīng)器內(nèi)細胞先 后在不同時間出現(xiàn)大量病變及細胞死亡破碎后的碎片。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，運用已建立的針對該病毒的特異性RT-PCR診斷方法對細胞培養(yǎng)物 進行鑒定，同時通過測定細胞培養(yǎng)物中病毒的TCID50計算病毒在細胞中的增殖滴度。
[0012] 實施例2鴨坦布蘇病毒病毒的RT-PCR鑒定 取1-7號生物反應(yīng)器內(nèi)收獲的病毒培養(yǎng)物，分別用鴨坦布蘇病毒特異的檢測引物進行 RT-PCR鑒定，檢測結(jié)果顯示，1-7號反應(yīng)器內(nèi)收獲樣品均可擴增到預(yù)期的目的基因片段，證 明收獲病毒液中確實有鴨坦布蘇病毒的存在。
[0013] 實施例3鴨坦布蘇病毒TCID5tl的測定 1、制備BHK-21細胞懸液，并進行細胞計數(shù)，備用。
[0014] 2、在離心管中將收獲的病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從KT1?1(Γ1(Ι。
[0015] 3、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每 孔接種ιοομ?。
[0016] 4、在每孔中加入細胞懸液10〇μ1，細胞濃度為2?3Χ IO5個/ml，設(shè)正常細胞對照， 正常細胞對照作兩縱排。（ιοομ?生長液+ιοομ?細胞懸液） 5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。統(tǒng)計出現(xiàn)細胞病變（CPE)的細胞孔。
[0017] 6、用 Karber 法計算 TCID5tl值。
[0018] 計算公式：lgTCID5(l=L-d (s-0. 5) 其中，L :最高稀釋度的對數(shù)；d :稀釋度對數(shù)之間的差；s :陽性孔比率總和。
[0019] 實施例4增殖鴨坦布蘇病毒檢測結(jié)果統(tǒng)計 對1-7號反應(yīng)器內(nèi)收毒檢測結(jié)果及病毒增殖過程中不同時間點的細胞活率進行了統(tǒng) 計比較，統(tǒng)計結(jié)果見下表： 1-7號生物反應(yīng)器不同時間點細胞活率及收獲病毒含量統(tǒng)計

【權(quán)利要求】
1. 一種擴增鴨坦布蘇病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟： 1) 將懸浮有BHK-21細胞的細胞培養(yǎng)液接種于生物反應(yīng)器中擴增培養(yǎng)； 2) 將鴨坦布蘇病毒接種到步驟1)擴增培養(yǎng)的BHK-21細胞上； 3) 將步驟2)接毒后的細胞進行再培養(yǎng)； 4) 收獲擴增的子代病毒。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟2)是按照鴨坦布蘇病毒數(shù)： BHK-21活細胞數(shù)=1:1-7的比例將病毒接種至步驟1)擴增培養(yǎng)的BHK-21細胞上。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟2)是按照鴨坦布蘇病毒數(shù)： BHK-21活細胞數(shù)=1:3-4的比例將病毒接種至步驟1)擴增培養(yǎng)的BHK-21細胞上。
【文檔編號】C12R1/93GK104480074SQ201410744319
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】徐麗麗, 凌紅麗, 魏波 申請人:青島蔚藍生物股份有限公司