本申請要求2005年11月28日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/740,205的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。

政府支持

依據(jù)35U.S.C.ξ202(c)，承認(rèn)美國政府可以享有在此描述的本發(fā)明的某些權(quán)利，本發(fā)明一部分是使用來自國家衛(wèi)生研究所授權(quán)號GM 62134的基金做出的。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體內(nèi)補(bǔ)體級聯(lián)的激活。尤其是，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合C3蛋白并抑制補(bǔ)體激活的肽和模擬肽。

發(fā)明背景

說明書自始至終引用各種出版物，包括專利、公開的申請、技術(shù)文獻(xiàn)和學(xué)術(shù)文章。這些引用的每篇出版物在此全部引入作為參考。說明書中未完全引用的出版物的完全引證列在說明書的結(jié)尾。

補(bǔ)體系統(tǒng)是對抗外來病原體的第一道免疫防線。其通過經(jīng)典的、旁路的或凝集素途徑的激活引起過敏毒性(anaphylatoxic)肽C3a和C5a產(chǎn)生和C5b-9膜攻擊復(fù)合體形成。補(bǔ)體成分C3在所有三個(gè)途徑的激活中起著重要作用。補(bǔ)體途徑C3轉(zhuǎn)變酶引起的C3激活及其隨后附著于靶表面引起膜攻擊復(fù)合體裝配，并最終引起靶細(xì)胞損害或裂解。C3是獨(dú)特的，因?yàn)樗哂刑峁┒嘀夭煌潴w結(jié)合位點(diǎn)的豐富的構(gòu)造，所述位點(diǎn)在免疫監(jiān)視和免疫反應(yīng)途徑中很重要。

不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活可以引起宿主細(xì)胞損害。補(bǔ)體牽連幾種病態(tài)，包括各種自身免疫疾病，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)另外的臨床病癥，例如成人呼吸綜合征、心臟病發(fā)作、異種移植后排斥和燒傷損害。還已發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷是由生物不相容情況，例如經(jīng)受透析或心肺分流術(shù)的患者遭遇的情況引起的。

補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷通過膜攻擊復(fù)合體直接介導(dǎo)，和通過產(chǎn)生C3a和C5a間接介導(dǎo)。這些肽通過它們對各種細(xì)胞，包括嗜中性白細(xì)胞和肥大細(xì)胞的影響而引起損害。在體內(nèi)，對C3和C5激活步驟的補(bǔ)體調(diào)節(jié)通過血漿和膜蛋白來提供。血漿蛋白抑制劑是因子H和C4結(jié)合蛋白，而位于細(xì)胞表面的調(diào)節(jié)膜蛋白是補(bǔ)體受體1(CR1)，衰變加速因子(DAF)和膜輔因子蛋白(MCP)。這些蛋白通過促進(jìn)多亞基復(fù)合物解離和/或通過蛋白酶解(由因子I催化)使復(fù)合物失活來抑制C3和C5轉(zhuǎn)變酶(多亞基蛋白酶)。通過體外測定已經(jīng)鑒定出調(diào)節(jié)或調(diào)整補(bǔ)體活性的幾種藥劑，但是大多數(shù)在體內(nèi)顯示出活性低或有毒性。

迄今為止，沒有補(bǔ)體激活抑制劑被批準(zhǔn)用于臨床，盡管存在某些供臨床使用的候選物，具體地說，被稱為可溶補(bǔ)體受體1(sCRl)的重組形式的補(bǔ)體受體1和人源化抗C5單克隆抗體(5Gl.l-scFv)。這兩種物質(zhì)在體內(nèi)動物模型中已經(jīng)顯示出抑制補(bǔ)體激活(Kalli KR等,1994；和Wang等,1996)。然而，每種物質(zhì)都具有作為大分子量蛋白(分別是240kDa和26kDa)的缺點(diǎn)，難以制備和必須通過輸液給藥。因此，最近的研究著重于較小活性劑的開發(fā)，其易于遞送、更穩(wěn)定和制造成本更低。

Lambris等的美國專利號6,319,897描述了噬菌體展示組合隨機(jī)肽文庫用于鑒定與C3結(jié)合并抑制補(bǔ)體激活的27個(gè)殘基的肽的用途。這個(gè)肽被截短為保留了全部活性的13個(gè)殘基的環(huán)狀片段，其在本領(lǐng)域中被稱為坎普他汀(compstatin)?？财账∫种艭3被C3轉(zhuǎn)變酶切割為C3a和C3b。已在一系列體外、體內(nèi)、離體和體內(nèi)/離體交界實(shí)驗(yàn)中測試了坎普他汀，并已證明：(1)在人血清中抑制補(bǔ)體激活(SahuA等,1996)；(2)在靈長類動物中抑制肝素/魚精蛋白引起的補(bǔ)體激活，而無顯著的副作用(Soulika AM等,2000)；(3)延長輸注人血的豬至人異種移植物的壽命(Fiane AE等,1999a；Fiane AE等,1999b；和Fiane AE等,2000)；(4)在心肺分流術(shù)、血漿去除術(shù)和透析體外循環(huán)模型中抑制補(bǔ)體激活(Nilsson B等,1998)；和(5)具有低毒性(Furlong ST等,2000)。

坎普他汀是包含序列ICVVQDWGHHRCT-NH₂(SEQ ID NO:1)的肽，其中Cys2和Cysl2形成二硫鍵。使用同核2D NMR核磁共振與兩個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)上受約束的計(jì)算方法相結(jié)合來確定它的三維結(jié)構(gòu)。第一種方法涉及距離幾何學(xué)、分子動力學(xué)和模擬退火(Morikis D等,1998；WO99/13899)而第二種方法涉及總體優(yōu)化(Klepeis等,J.Computational Chem.,20:1344-1370,1999)。坎普他汀的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)由極性斑和非極性斑組成的分子表面。極性部分包括I型β轉(zhuǎn)角且非極性斑包括二硫鍵。此外，合成了具有丙氨酸置換(丙氨酸分區(qū))的一系列類似物并測試了活性，揭示β轉(zhuǎn)角的四個(gè)殘基和帶環(huán)繞的疏水簇的二硫鍵在坎普他汀的抑制活性中起著重要作用(Morikis等,1998；WO99/13899)。

使用包括測定旁路途徑介導(dǎo)的紅細(xì)胞裂解的補(bǔ)體活性試驗(yàn)，已經(jīng)測定了坎普他汀的IC₅₀為12μM。已經(jīng)證明某些以前測試的類似物具有相當(dāng)于或大于坎普他汀的活性。公開的國際申請?zhí)朩O2004/026328公開了具有N-和C-末端和在第4和9位變異的坎普他汀類似物和模擬物，其在上述試驗(yàn)中顯示活性提高。已報(bào)道某些類似物活性的提高超過坎普他汀達(dá)99倍{也參見,Mallik等,2005)。具有甚至更高活性的坎普他汀類似物或模擬物的開發(fā)將構(gòu)成本領(lǐng)域的顯著進(jìn)步。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了補(bǔ)體抑制肽坎普他汀(HOOC-ICVVQDWGHHRCT-NH₂；SEQ ID NO:1)的類似物和模擬物，其與坎普他汀相比具有提高的補(bǔ)體抑制活性。

在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是抑制補(bǔ)體激活的化合物，其包含具有下述序列的肽：

Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5(SEQ ID NO:26)；其中：

Xaa1是Ile、Val、Leu、Ac-Ile、Ac-Val、Ac-Leu或包含Gly-Ile的二肽；

Xaa2是Trp或Trp的類似物，其中Trp的類似物與Trp相比疏水特性增加，條件是，如果Xaa3是Trp，那么Xaa2是Trp的類似物；

Xaa3是Trp或在其吲哚環(huán)上包含化學(xué)修飾的Trp的類似物，其中化學(xué)修飾增加吲哚環(huán)的氫鍵能；

Xaa4是His、Ala、Phe或Trp；

Xaa5是L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly、包含Thr-Asn的二肽、或包含Thr-Ala的二肽、或包含Thr-Ala-Asn的三肽，其中L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly或Asn中任何一個(gè)的羧基末端-OH任選被-NH₂替代；并且

兩個(gè)Cys殘基通過二硫鍵相連。

在某些實(shí)施方案中，Xaa2參與與C3的非極性相互作用。在其他實(shí)施方案中，Xaa3參與與C3氫鍵鍵合。在其他實(shí)施方案中，Xaa2參與與C3的非極性相互作用，和Xaa3參與與C3氫鍵鍵合。

在各種實(shí)施方案中，Xaa2的Trp的類似物是鹵代色氨酸，例如5-氟代-L-色氨酸或6-氟代-L-色氨酸。在其他實(shí)施方案中，Xaa2的Trp類似物在第5位包含低級烷氧基或低級烷基取代基，例如5-甲氧基色氨酸或5-甲基色氨酸。在其他實(shí)施方案中，Xaa2的Trp類似物在第1位包含低級烷基或低級烷?；〈?，示例實(shí)施方案包含1-甲基色氨酸或1-甲?；彼帷Ｔ谄渌麑?shí)施方案中，Xaa3的Trp的類似物是鹵代色氨酸，例如5-氟代-L-色氨酸或6-氟代-L-色氨酸。

在某些實(shí)施方案中，Xaa2在色氨酸第1位包含低級烷?；虻图壨榛〈?，Xaa3任選包含鹵代色氨酸和Xaa4包含丙氨酸。在特定實(shí)施方案中，Xaa2是1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸和Xaa3任選包含5-氟代-L-色氨酸。本發(fā)明的一些示例化合物包含SEQ ID NOS：15-25中的任何一個(gè)。

在一些實(shí)施方案中，該化合物包含由編碼肽的多核苷酸表達(dá)而生產(chǎn)的肽。在其他實(shí)施方案中，化合物至少部分通過肽合成來生產(chǎn)。還可以使用合成法的組合。

在某些實(shí)施方案中，坎普他汀類似物是其中化合物是聚乙二醇化的，如包含SEQ ID NO:36的化合物示例。

在其他實(shí)施方案中，坎普他汀類似物進(jìn)一步包含延長化合物體內(nèi)保留的另外的肽成分。例如，另外的肽成分可以是白蛋白結(jié)合肽。一個(gè)示例的坎普他汀-白蛋白結(jié)合肽綴合物包含SEQ ID NO:39。

本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是抑制補(bǔ)體激活的化合物，包含SEQ ID NO:26或在上文描述的類似物和綴合物的任何其他序列的非肽或部分肽模擬物。這些非肽或部分肽模擬物被設(shè)計(jì)用來結(jié)合C3并抑制補(bǔ)體激活，在同等試驗(yàn)條件下，其活性比包含SEQ ID NO:1的肽大至少100倍。

本發(fā)明的坎普他汀類似物、綴合物和模擬物具有實(shí)用性，用于應(yīng)用坎普他汀本身的任何目的，如本領(lǐng)域已知和本文更詳細(xì)描述的。某些這些用途包括化合物配制入給予患者的藥物組合物。這種制劑可以包含該化合物的藥物可接受鹽，以及一種或多種藥物可接受稀釋劑、載體、賦形劑等等，如在本領(lǐng)域技術(shù)人員權(quán)限內(nèi)的。

通過參考下述詳細(xì)描述、附圖和實(shí)施例會理解本發(fā)明的各種特征和優(yōu)點(diǎn)。

附圖簡述

圖1.表達(dá)的坎普他汀及其類似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)(正方形)和表達(dá)的具有色氨酸的坎普他汀(SEQ ID NO:15)(圓形)、5-氟代-色氨酸(SEQ ID NO:16)(三角形)、6-氟代色氨酸(SEQ ID NO:17(星形)、5-羥基-色氨酸(SEQ ID NO:27)(六角形)、7-氮雜-色氨酸(SEQ ID NO:28)(菱形)的肽濃度的圖。

圖2.合成的坎普他汀類似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)(正方形)和在第4位(SEQ ID NO:18)(圓形)、第7位(SEQ ID NO:19)(三角形)、第4和7位(SEQ ID NO:20)(菱形)具有5-氟代-L-色氨酸的坎普他汀類似物的肽濃度的圖。

圖3.另外的合成的坎普他汀類似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對以下肽濃度的圖：(A)Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)(三角形)與Ac-V4(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:18)(倒置三角形)、Ac-V4(5-甲基-W)/H9A (SEQ ID NO:22)(圓形)、Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)(菱形)、Ac-V4(2-Nal)/H9A(SEQ ID NO:7)(正方形)相比；(B)Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)(三角形)與Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:19)(六邊形)相比；和(C)野生型坎普他汀(SEQ ID NO:1)(三角形)與Ac-V4(1-甲基-W)/W7(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:24)(尖端向左的三角形)相比。

圖4.另外的坎普他汀類似物與C3相互作用的熱力學(xué)表征。表明(A)Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)；(B)Ac-V4(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:18)；(C)Ac-V4(5-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:22)；(D)Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)；(E)Ac-V4(2-Nal)/H9A(SEQ ID NO:7)和(F)Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:19)與C3結(jié)合的ITC數(shù)據(jù)。該圖是通過使校正的原始數(shù)據(jù)符合Origin 7.0中“one set of sites”模式而獲得的。

圖5.顯示了以log P表示的類似物的疏水性與抑制常數(shù)(A)、以-TΔS表示的熵(B)和結(jié)合常數(shù)(C)之間關(guān)系的圖。

圖6.另外的合成的坎普他汀類似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)(圓形)和Ac-V4(1-甲?；?W)/H9A(SEQ ID NO:25)(正方形)的肽濃度的圖。

圖7.聚乙二醇化坎普他汀類似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)(圓形)和Ac-V4(1-甲基-W)/H9A-K-PEG 5000(SEQ ID NO:36)(正方形)的肽濃度的圖。

圖8.白蛋白結(jié)合蛋白-綴合的坎普他汀類似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)(圓形)和融合肽(Ac-ICV(1MeW)QDWGAHRCTRLIEDICLPRWGCLWEDD-NH₂)(SEQ ID NO:39) (正方形)的肽濃度的圖。

示例實(shí)施方案的詳細(xì)描述

與本發(fā)明的方法及其他方面有關(guān)的各種術(shù)語貫穿說明書和權(quán)利要求書使用。這種術(shù)語賦予它們在本領(lǐng)域通常的意思，除非另有陳述。其他具體限定的術(shù)語以與本文提供的定義一致的方式進(jìn)行解釋。

定義：

說明書和實(shí)施例中可以使用下列縮寫：Ac，乙?；?；NH₂，氨基；MALDI，基質(zhì)輔助激光解吸離子化；TOF，飛行時(shí)間；ITC，等溫滴定量熱法；HPLC，高效液相色譜法；NA，非活性的；dT，D-蘇氨酸；2-Nal，2-萘基丙氨酸；1-Nal，1-萘基丙氨酸；2-Igl，2-茚滿基甘氨酸；Dht，二氫色氨酸；Bpa，4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸；5f-l-W，5-氟代-L-色氨酸；6f-l-W，6-氟代-L-色氨酸；5-OH-W，5-羥色氨酸；5-甲氧基-W，5-甲氧基色氨酸；5-甲基-W，5-甲基色氨酸；1-甲基-W，1-甲基色氨酸；氨基酸縮寫使用標(biāo)準(zhǔn)的三或單字母命名法，例如對于色氨酸，用Trp或W。

本文使用的術(shù)語“大約”當(dāng)涉及可測值，如量、持續(xù)時(shí)間等時(shí)，意思是包括從給定值±20％或±10％，在一些實(shí)施方案中±5％，在一些實(shí)施方案中±1％，和在一些實(shí)施方案中±0.1％的變化，因?yàn)檫@種變化適于作出并用于公開的化合物和組合物。

術(shù)語“藥物活性的”和“生物活性的”是指本發(fā)明化合物結(jié)合C3或其片段并抑制補(bǔ)體激活的能力。這種生物活性可以通過幾種本領(lǐng)域認(rèn)可的試驗(yàn)中的一種或多種進(jìn)行測定，如本文更詳細(xì)描述的。

本文使用的“烷基”是指具有大約1至大約10個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀烴，大約1至大約7個(gè)碳原子是優(yōu)選的。烷基包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、環(huán)戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、環(huán)己基、環(huán)辛基、金剛烷基、3-甲戊基、2,2-二甲丁基和2,3-二甲丁基。術(shù)語“低級烷基”是指具有大約1至大約5個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀烴。低級烷基包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、環(huán)戊基、異戊基和新戊基。

本文使用的“鹵代”是指F、Cl、Br或I。

本文使用的“烷?；笨梢耘c“?；被Q使用，是指具有大約1至大約10個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的一個(gè)直鏈或支鏈或脂肪族非環(huán)狀殘基。烷酰基包括但不限于甲?；?、乙?；?、丙?；⒍□；惗□；?、戊酰基、異戊?；?、2-甲基-丁?；?、2,2-二甲基丙酰基、己?；?、庚?；?、辛?；?。術(shù)語“低級烷酰基”是指具有大約1至大約5個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的直鏈或支鏈脂肪族非環(huán)狀殘基。低級烷?；ǖ幌抻诩柞；?、乙?；?、正丙?；?、異丙?；?、丁酰基、異丁酰基、戊酰基、異戊?；?。

本文使用的“芳基”是指具有大約5至大約14個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的單環(huán)或二環(huán)芳環(huán)系統(tǒng)，大約6至大約10個(gè)碳原子是優(yōu)選的。非限制實(shí)例包括例如苯基和萘基。

本文使用的“芳烷基”是指具有大約6至大約20個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的含芳基取代基的烷基，大約6至大約12個(gè)碳原子是優(yōu)選的。芳烷基可以任意取代。非限制實(shí)例包括例如苯甲基、萘甲基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基和二苯乙基。

本文使用的術(shù)語“烷氧基”是指任選取代的烷基-O-基，其中烷基如前定義。示例的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基和庚氧基等等。

本文使用的“羧基”是指-C(＝O)OH基。

本文使用的“烷氧羰基”是指-C(＝O)O-烷基，其中烷基如前定義。

本文使用的“芳?；笔侵?C(＝O)芳基，其中芳基如前定義。示例的芳酰基包括苯甲?；洼刘；?。

典型地，取代的化學(xué)部分包括取代分子上選定位置的氫的一個(gè)或多個(gè)取代基。示例的取代基包括例如鹵代、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、巰基、羥基(-OH)、烷氧基、氰基(-CN)、羧基(-COOH)、?；?烷?；?-C(＝O)R)；-C(＝O)O-烷基、甲酰胺基(-C(O)NH₂)、-N-取代的甲酰胺基(-C(＝0)NHR”)、CF₃、CF₂CF₃等。至于上述取代基，每部分R”可以單獨(dú)例如是H、烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基中的任何。

本文使用的“L-氨基酸”是指蛋白質(zhì)中正常存在的任何天然存在的左旋α-氨基酸或那些α-氨基酸的烷基酯。術(shù)語“D-氨基酸”是指右旋α-氨基酸。除非另外規(guī)定，本文提及的全部氨基酸是L-氨基酸。

“疏水”和“非極性”在本文同義使用，是指不以偶極為特征的分子間或分子內(nèi)任何相互作用。

本文使用的“pi符號”是指坎普他汀參與pi與C3鍵合的能力。Pi鍵由兩個(gè)平行的p軌域側(cè)向重疊產(chǎn)生。

本文使用的“氫鍵能”是指坎普他汀參與與C3靜電吸引的能力，涉及坎普他汀上修飾的色氨酸殘基或色氨酸類似物上帶負(fù)電的部分和C3上的氫原子。這種帶負(fù)電部分的非限制實(shí)例是氟原子。

“聚乙二醇化”是指其中至少一個(gè)聚乙二醇(PEG)部分，無論其大小，與蛋白質(zhì)或肽化學(xué)連接形成PEG-肽綴合物的反應(yīng)。聚乙二醇化意思是至少一個(gè)PEG部分，不管其大小，化學(xué)連接于肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語PEG通常帶有數(shù)字后綴，其指明PEG聚合物的近似平均分子量；例如PEG-8,000是指平均分子量為大約8,000的聚乙二醇。

本文使用的“藥物可接受鹽”是指所公開化合物的衍生物，其中母體化合物通過制備其酸或堿鹽而被修飾。藥物可接受鹽的實(shí)例包括但不限于堿性殘基例如胺類的無機(jī)或有機(jī)酸鹽；酸性殘基例如羧酸類的堿性或有機(jī)鹽等等。因此術(shù)語“酸加成鹽”是指通過添加酸而制備的母體化合物的相應(yīng)鹽衍生物。藥物可接受鹽包括由無機(jī)或有機(jī)酸形成的母體化合物的常規(guī)鹽或季銨鹽。例如，這種常規(guī)鹽包括但不限于源自無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的鹽；和由無機(jī)酸如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、磺胺酸、2-乙酸基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸等制備的鹽。本發(fā)明的某些酸性或堿性化合物可以以兩性離子形式存在。所有形式的化合物，包括游離酸、游離堿和兩性離子都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。

說明書：

根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)使用關(guān)于坎普他汀的生物和物理化學(xué)特性的信息設(shè)計(jì)了與親本坎普他汀肽相比活性顯著提高的坎普他汀類似物。在一些實(shí)施方案中，該類似物具有坎普他汀的至少50倍或更大的活性。在其他實(shí)施方案中，該類似物具有坎普他汀的60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130倍或更大的活性。還在其他的實(shí)施方案中，使用實(shí)施例中描述的試驗(yàn)來比較，該類似物具有坎普他汀的135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265倍或更大的活性。

已經(jīng)表明根據(jù)其他方法合成的坎普他汀類似物具有與親本肽相比稍微提高的活性，即達(dá)到大約99倍(Mallik,B.等,2005,見上；WO2004/026328)。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的類似物甚至具有比迄今為止生產(chǎn)的親本肽或其類似物更大的活性，如本文附圖和實(shí)施例中所示的體外試驗(yàn)所證明。

表1B顯示了坎普他汀和活性顯著提高的所選類似物的氨基酸序列和補(bǔ)體抑制活性。選擇的類似物涉及與親本肽坎普他汀(SEQ ID NO:1)和與SEQ NOS:2-14的肽相比指定位置(1-13)的特異性修飾，如表1A所示，其在WO2004/026328中描述。SEQ ID NOS:15-24的肽代表根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的修飾，產(chǎn)生了明顯更有效的坎普他汀類似物。如下面更詳細(xì)描述的，很清楚如SEQ ID NOS:2-13所列出的對第4位上的色氨酸進(jìn)行的某些修飾可以與第7位上的色氨酸類似物置換結(jié)合，形成另外的強(qiáng)效坎普他汀類似物。

表1

這個(gè)表中使用的縮寫如下：

dT＝D-蘇氨酸

2-Nal＝2-萘基丙氨酸

1-Nal＝1-萘基丙氨酸

2-Igl＝2-茚滿基甘氨酸

Dht＝二氫色氨酸

Bpa＝4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸

5f-l-W＝5-氟代-L-色氨酸

6f-l-W＝6-氟代-L-色氨酸

5-OH-W＝5-羥色氨酸

5-甲氧基-W＝5-甲氧基色氨酸

5-甲基-W＝5-甲基色氨酸

1-甲基-W＝1-甲基色氨酸

1-甲?；?W＝1-甲酰基色氨酸

N-末端的修飾。N-末端的乙?；湫偷卦黾涌财账〖捌漕愃莆锏难a(bǔ)體抑制活性，如通過SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2比較具體可見。因此，肽的氨基末端添加?；?，包括但不限于N-乙酰化，是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)合成制備肽時(shí)特別實(shí)用。然而，通過在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼肽的核酸分子，或通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯而制備肽時(shí)，有時(shí)也有利。對于這些實(shí)施方案，可以使用天然存在的N-末端。適于體外或體內(nèi)表達(dá)坎普他汀類似物的一個(gè)實(shí)例以SEQ ID NOS:15-17為代表，其中在N-末端乙?；晃葱揎椀母拾彼崽娲?。如下所討論的在肽內(nèi)和在C-末端另外包含修飾的SEQ ID NOS:15-17在本文描述的補(bǔ)體抑制試驗(yàn)中比坎普他汀活性高大約45至大約125倍。

肽內(nèi)修飾。使用為低能量序列分級的計(jì)算方法，以前測定了Tyr和Val是第4位上支持肽穩(wěn)定性和活性最可能的候選者(Klepeis JL等,2003)。WO2004/026328中公開了Trp在第4位，尤其是聯(lián)合Ala在第9位，產(chǎn)生比親本肽活性高很多倍的肽(例如，SEQ ID NOS:4、5和6與SEQ ID NOS:2和3的活性比較)。WO2004/026326還公開了發(fā)現(xiàn)在第4位包含色氨酸類似物2-萘基丙氨酸(SEQ ID NOS:7、8)、1-萘基丙氨酸(SEQ ID NO:9)、2-茚滿基甘氨酸(SEQ ID NOS:10、11)或二氫色氨酸(SEQ ID NO:12)的肽的補(bǔ)體抑制活性全部增加，范圍從大于坎普他汀5倍至99倍。此外，在第4位包含苯丙氨酸類似物、4-苯甲?；?L-丙氨酸的肽(SEQ ID NO:13)活性比坎普他汀大49倍。

根據(jù)本發(fā)明，在第4位包含5-氟代-L-色氨酸(SEQ ID NO:19)或5-甲氧基、5-甲基或1-甲基色氨酸或者1-甲?；彼岬碾?分別是SEQ ID NOS:21、22、23和25)比坎普他汀活性大31-264倍。1-甲基或1-甲?；彼岬膿饺肱c其他類似物相比增加了活性和結(jié)合親合力最大。人們相信在第4位吲哚‘N’介導(dǎo)的氫鍵對于坎普他汀的結(jié)合和活性不是必要的。通過在第4位用低級烷基、烷?；蜻胚岬〈鷼湟鹑狈@個(gè)氫鍵或極性降低使坎普他汀結(jié)合和活性增加。不意欲限于任何特定的理論或作用機(jī)制，人們相信在第4位的疏水作用或效應(yīng)加強(qiáng)坎普他汀與C3的相互作用。因此，保持或增強(qiáng)上述疏水作用的在第4位Trp的修飾(例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu))或Trp類似物的置換包括在本發(fā)明中以生產(chǎn)甚至更大活性的坎普他汀類似物。這種類似物是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于本文例證的類似物，以及其未取代或者取代的衍生物。適當(dāng)?shù)念愃莆飳?shí)例可以參考下列出版物和很多其他的出版物而找到：Beene,等(2002)Biochemistry41:10262-10269(尤其描述了單和多鹵代Trp類似物)；Babitzky&Yanofsky(1995)J.Biol.Chem.270:12452-12456(尤其描述了甲基化和鹵代Trp及其他Trp和吲哚類似物)和美國專利6,214,790、6,169,057、5,776,970、4,870,097、4,576,750和4,299,838。Trp類似物通過體外或體內(nèi)表達(dá)，或通過肽合成被引入坎普他汀肽，如本領(lǐng)域已知的和實(shí)施例中更詳細(xì)描述的。

在某些實(shí)施方案中，坎普他汀的第4位Trp被類似物替代，該類似物包含1-烷基取代基，更具體地包含如上定義的低級烷基(例如C₁-C₅)取代基。這些包括但不限于N(α)甲基色氨酸和5-甲基色氨酸。在其他的實(shí)施方案中，坎普他汀第4位的Trp被類似物替代，該類似物包含1-烷?；〈?，更具體地包含如上定義的低級烷酰基(例如C₁-C₅)取代基。除了例證的類似物之外，這些包括但不限于1-乙?；?L-色氨酸和L-β-同型色氨酸。

熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明相對于野生型坎普他汀，在第7位摻入5-氟代-L-色氨酸增加了坎普他汀與C3之間相互作用的焓，而在坎普他汀第4 位摻入5-氟代-色氨酸降低了這種相互作用的焓。不意欲受任何特定機(jī)制的束縛，前面的結(jié)果表明在坎普他汀第7位Trp殘基上用氟原子替代吲哚氫可以加強(qiáng)吲哚環(huán)的氫鍵能，引入新的氫鍵能，或通過結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用。(Katragadda M等,2004)。因此，保持或增強(qiáng)上述氫鍵能，或通過結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用，在第7位Trp的修飾(例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu))或Trp類似物的置換包括在本發(fā)明中以生產(chǎn)具有甚至更大活性的類似物。在某些實(shí)施方案中，其吲哚環(huán)具有修飾的Trp類似物可以通過體外或體內(nèi)表達(dá)，或通過肽合成而引入坎普他汀肽的第7位，所述修飾引起氫鍵能增加或通過結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用。發(fā)現(xiàn)在第7位包含色氨酸類似物5-氟代-色氨酸的肽(SEQ ID NO:19)與坎普他汀相比，活性增加121倍。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，Trp類似物摻入坎普他汀分子的第4和7位，和任選坎普他汀第9位的His被Ala替代。熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明相對于野生型坎普他汀，在第4和7位摻入5-氟代-色氨酸增加坎普他汀和C3之間相互作用的焓。因此，經(jīng)由第4位保持或增加上述與C3的疏水性相互作用和經(jīng)由第7位保持或增加上述與C3的氫鍵能，或經(jīng)由第7位通過結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用，在第4和7位Trp的修飾(例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu))或Trp類似物的置換包括在本發(fā)明中以生產(chǎn)甚至更大活性的坎普他汀類似物。這種修飾的Trp或Trp類似物可以通過體外或體內(nèi)表達(dá)，或通過肽合成被引入坎普他汀肽的第4和7位。發(fā)現(xiàn)在第4和7位包含色氨酸類似物5-氟代-色氨酸的肽(SEQ ID NO:16)和包含色氨酸類似物6-氟代色氨酸(SEQ ID NO:17)具有比坎普他汀顯著增加的活性，活性增加范圍從112倍至264倍。此外，發(fā)現(xiàn)在第4位包含色氨酸類似物1-甲基-色氨酸和第7位包含5-氟代-色氨酸的肽(SEQ ID NO:24)相對于坎普他汀活性增加264倍。

羧基末端的修飾。通過合成法生產(chǎn)的肽通常羧基末端被修飾包含氨基而不是酸；這種常見修飾可以參見表1的坎普他汀(SEQ ID NO:1)和幾個(gè)類似物。的確，在有些情況下，已經(jīng)測定到含有末端氨基的肽具有比末端含酸的肽更大的活性(例如SEQ ID NOS:5和7分別與SEQ ID NOS:4和8相比)。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案使用了C末端氨基修飾。然而，一些情況下在C末端使用酸有利。這種情況包括但不限于肽的溶解度考慮和肽從編碼肽的核酸分子體外或體內(nèi)的表達(dá)。

坎普他汀的羧基末端殘基是蘇氨酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，C末端蘇氨酸被一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸或類似物取代。例如，具有SEQ ID NO:6的肽包含D-蘇氨酸而不是L-蘇氨酸，和在C末端進(jìn)一步具有COOH。這個(gè)肽顯示出活性等于C末端包含L-蘇氨酸和CONH₂的肽SEQ ID NO:5。此外，His替代了第13位的Thr，獲得了活性比坎普他汀大21倍的肽。此外SEQ ID NOS:14-17的肽，其C末端包含Asn的肽延伸，或Ala-Asn二肽延伸，以及C末端COOH和非乙酰化N-末端，證明活性比坎普他汀大38至126倍。它們還適于經(jīng)由原核或真核生物表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)，如下面更詳細(xì)描述的。

本發(fā)明的坎普他汀類似物可以通過各種肽合成法，根據(jù)常規(guī)肽合成方法經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的縮合來制備。例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相法合成肽，例如可以根據(jù)廠商說明書，在Applied Biosystems Model431A肽合成儀(Applied Biosystems,Foster City,加利福尼亞州)上進(jìn)行。通過固相法或液相法合成肽或模擬肽的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在肽合成過程中，支鏈氨基和羧基可以根據(jù)需要被保護(hù)/去保護(hù)，使用通常已知的保護(hù)基。實(shí)施例3中列出了適當(dāng)?shù)碾暮铣煞ǖ膶?shí)例。利用選擇性肽和肽衍生物的保護(hù)基進(jìn)行修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。

作為選擇，本發(fā)明的某些肽可以通過在適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧讼到y(tǒng)表達(dá)來生產(chǎn)。例如，DNA構(gòu)建體可以插入適宜于在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)或酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母)中表達(dá)的質(zhì)粒載體，或插入用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體或用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的病毒載體。這種載體包含DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的調(diào)控元件，其以使得允許DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方式安置。表達(dá)所需的這種調(diào)控元件包括啟動子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列和任選增強(qiáng)子序列。

SEQ ID NOS:14-17和設(shè)計(jì)相似的其他肽適于通過體外或體內(nèi)表達(dá)核酸分子來生產(chǎn)。編碼肽多連體的DNA構(gòu)建體可以被引入體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)，多連體的上限取決于所用的表達(dá)系統(tǒng)。多連體產(chǎn)生后，通過多肽暴露于肼來實(shí)現(xiàn)C末端Asn和下列N末端G之間的切割。

在重組原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)基因而生產(chǎn)的肽可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法來純化。實(shí)施例1和2列出了適于在本發(fā)明中使用的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用市場上可買到的表達(dá)/分泌系統(tǒng)，由此重組肽被表達(dá)并此后從宿主細(xì)胞分泌出來，易于從周圍培養(yǎng)基中純化。

也可以使用基因表達(dá)和合成法組合生產(chǎn)坎普他汀類似物。例如，類似物可以通過基因表達(dá)來生產(chǎn)和此后經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)翻譯后合成過程，例如修飾N-或C-末端或使分子環(huán)化。

坎普他汀的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，上述類似物的結(jié)構(gòu)通過類似方法來測定。一旦已經(jīng)確定了特別期望的短肽構(gòu)象，設(shè)計(jì)肽或肽模擬物以適合那個(gè)構(gòu)象的方法就是本領(lǐng)域熟知的。參見例如G.R.Marshall(1993),Tetrahedron,49:3547-3558；Hruby and Nikiforovich(1991),in Molecular Conformation and Biological Interactions,P.Balaram&S.Ramasehan,eds.,Indian Acad,of Sci.,Bangalore,PP.429-455)。與本發(fā)明特別相關(guān)的是，通過考慮氨基酸殘基的各種側(cè)鏈所起的作用可以進(jìn)一步改善肽類似物的設(shè)計(jì)，如上討論(即對于官能團(tuán)或?qū)τ诳臻g因素的影響)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到為了提供與C3結(jié)合和抑制補(bǔ)體激活所需的特殊主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈官能度，肽模擬物同樣可以很好地充當(dāng)肽。因此，通過使用天然存在的氨基酸、氨基酸衍生物、類似物或非氨基酸分子生產(chǎn)與C3結(jié)合、抑制補(bǔ)體的化合物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。非肽類似物或包含肽和非肽成分的類似物有時(shí)本文稱為“肽模擬物”或“等構(gòu)模擬物”以指明本發(fā)明肽的置換或衍生，其具有相同主鏈構(gòu)象特征和/或其他官能度，以致它們與示例肽足夠相似以抑制補(bǔ)體激活。

模擬肽用于開發(fā)高親合力肽類似物的用途是本領(lǐng)域熟知的(參見例如Zhao B等,1995；Beeley,N.1994；和Hruby,VJ 1993)。假定旋轉(zhuǎn)限制類似于肽內(nèi)的氨基酸殘基，可以分析包含非氨基酸部分的類似物，和通過拉馬錢德蘭圖(Hruby&Nikiforovich 1991)，連同其他已知技術(shù)來證實(shí)它們的構(gòu)象基序。

本發(fā)明的坎普他汀類似物可以通過將聚乙二醇(PEG)成分添加至肽來修飾。如本領(lǐng)域熟知的，聚乙二醇化可以增加治療肽和蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG平均分子量大約1,000至大約50,000。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG平均分子量大約1,000至大約20,000。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG平均分子量大約1,000至大約10,000。在示例的實(shí)施方案中，PEG平均分子量大約5,000。聚乙二醇可以是支鏈或直鏈，和優(yōu)選直鏈。

本發(fā)明的坎普他汀類似物可以經(jīng)連接基與PEG共價(jià)結(jié)合。這種方法是本領(lǐng)域熟知的。(在Kozlowski A.等2001中綜述；也參見Harris JM and Zalipsky S,eds.Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications,ACS Symposium Series 680(1997))。可接受的連接基的非限制性實(shí)例包括酯基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羥基、碳水化合物、琥珀酰亞胺基(包括不限于琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽(SS)、琥珀酰亞胺基丙酸鹽(SPA)、琥珀酰亞胺基羧甲酸鹽(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酸胺(SSA)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))、環(huán)氧基、氧羰基咪唑基(包括不限于羰基咪唑基(CDI))、硝苯基(包括不限于硝苯基碳酸鹽(NPC)或三氯苯基碳酸鹽(TPC))、trysylate基、醛基、異氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、組氨酸基、或伯胺。在某些實(shí)施方案中，連接基是琥珀酰亞胺基。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接基是NHS。

本發(fā)明的坎普他汀類似物可以選擇通過氨基、巰基、羥基或羧基直接與PEG偶聯(lián)(即無連接基)。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG與賴氨酸殘基連在一起被添加至坎普他汀C末端。

聚乙二醇化是一種增加治療肽和蛋白質(zhì)在體內(nèi)保留時(shí)間的方法。通過將肽與某些其他肽連接還可以降低肽的體內(nèi)清除率。例如，當(dāng)某些白蛋白結(jié)合肽通過靜脈內(nèi)推注給兔子時(shí)，顯示出罕見的2.3h的長半衰期(Dennis等,2002)。這個(gè)類型的肽與抗組織因子-D3H44的Fab融合使Fab能夠與白蛋白結(jié)合，同時(shí)保留Fab結(jié)合組織因子的能力(Nguyen等,2006)。這種相互作用白蛋白導(dǎo)致與野生型D3H44Fab相比時(shí)，在小鼠和兔子體內(nèi)清除率顯著降低和半衰期延長，可與對于聚乙二醇化的Fab分子、免疫粘附素和白蛋白融合蛋白中所見的相匹敵。如本文實(shí)施例11所述，發(fā)明人合成了與白蛋白結(jié)合肽融合的坎普他汀類似物并證明了該融合蛋白有抑制補(bǔ)體激活的活性。

坎普他汀類似物、模擬肽和綴合物的補(bǔ)體激活抑制活性可以通過本領(lǐng)域已知的各種試驗(yàn)測試。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用實(shí)施例4中描述的試驗(yàn)。美國專利6,319,897中列出了其他試驗(yàn)的非詳盡清單，包括但不限于(1)肽與C3和C3片段結(jié)合試驗(yàn)；(2)各種溶血試驗(yàn)；(3)C3轉(zhuǎn)變酶介導(dǎo)的C3切割的測定；和(4)因子D切割因子B的測定。

本文描述的肽和模擬肽具有實(shí)用性，用于應(yīng)用坎普他汀本身的任何目的，如本領(lǐng)域已知的。這種應(yīng)用包括但不限于：(1)在患者(人或動物)血清、組織或器官中抑制補(bǔ)體激活，其可以促進(jìn)某些疾病或病情的治療，包括但不限于年齡相關(guān)的黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏?。?2)抑制使用人造器官或植入物期間發(fā)生的補(bǔ)體激活(例如用本發(fā)明的肽涂布或否則處理人造器官)；(3)抑制生理性流體(血、尿)的體外分流期間發(fā)生的補(bǔ)體激活(例如將本發(fā)明的肽涂布分流流體的管道)；和(4)篩選小分子文庫以鑒定其他的坎普他汀激活抑制劑(例如用來測定測試化合物與坎普他汀類似物競爭結(jié)合C3或C3片段的能力的液相或固相高通量試驗(yàn))。

提供下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。它們的意圖是說明，而不是限制本發(fā)明。使用實(shí)施例1-5中列出的材料和方法產(chǎn)生實(shí)施例6-11中描述的結(jié)果。

實(shí)施例1

坎普他汀的細(xì)菌表達(dá)

具有下列序列NH₂-GICVWQDWGAHRCTN-OH(“G(-1)/V4W/H9A/N14”)(SEQ ID NO:15)的坎普他汀類似物以與殼多糖結(jié)合域和DnaB內(nèi)含肽(New England Biolabs,Beverly,MA)融合的形式表達(dá)。在肽序列和大腸桿菌的密碼子使用的指導(dǎo)下，使用下列遺傳密碼產(chǎn)生具有下列序列的這個(gè)肽的合成基因：

^5’ATTTGCGTTTGGCAGGATTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAA^3’(SEQ ID NO:29)

為將合成基因克隆入pGEM-T載體，設(shè)計(jì)含有SapI位點(diǎn)的5'側(cè)翼區(qū)和含有PstI位點(diǎn)的3'側(cè)翼區(qū)。為構(gòu)建合成基因，使用DnaWorks軟件設(shè)計(jì)如下顯示的四個(gè)重疊的寡核苷酸并在Invitrogen Inc.(Carlsbad,CA)合成：

⁵'GGTGGTGCTCTTCCAACGGTATTTGCGTTTGGCAGGA³'(SEQ ID NO:30)

⁵'TTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAACTGCAGG³'(SEQ ID NO:31)

³'CAACGTGGTTAATTGACGTCCGC⁵'(SEQ ID NO:32)

³'CATAAACGCAAACCGTCCTAACCCCACGCGTGG⁵'(SEQ ID NO:33)

重疊DNA片段如Stemmer等,1995所述通過PCR組合。使用下列引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的基因：

⁵'CGCCTGCAGTTAATTGGT³'(SEQ IDNO:34)

⁵'GGTGGTGCTCTTCCAACG³'(SEQ IDNO:35)

然后將坎普他汀的PCR擴(kuò)增片段克隆入pGEM-T載體，并用PstI和SapI消化所得克隆。將編碼坎普他汀類似物的PstI-SapI片段進(jìn)一步亞克隆入表達(dá)載體pTWIN1，該載體已經(jīng)預(yù)先用PstI和SapI消化；通過DNA測序來證實(shí)該克隆的序列。

為表達(dá)坎普他汀類似物，用坎普他汀克隆轉(zhuǎn)化的ER2566大腸桿菌細(xì)胞在SOB培養(yǎng)基(20g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母膏、0.5g/L NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂)中37℃生長。當(dāng)OD600達(dá)到0.7時(shí)，添加IPTG至終濃度0.3mM誘導(dǎo)表達(dá)，隨后在37℃另外孵育4小時(shí)。離心收集細(xì)胞和在補(bǔ)充0.2％Tween-20的緩沖液B1(20mM磷酸鹽緩沖液，pH 8.5，500mM NaCl和1mM EDTA)中超聲裂解。細(xì)胞提取物離心，可溶組分填入緩沖液B1預(yù)平衡過的殼多糖結(jié)合柱(New England Biolabs,Beverly,MA)。用100ml緩沖液B1洗滌柱，隨后用3柱體積的緩沖液B2(50mM乙酸銨，pH 7.0)迅速洗滌。柱在室溫下孵育20小時(shí)，用緩沖液B2洗脫肽，凍干并在C18HPLC柱上進(jìn)一步純化。使用MALDI-TOF質(zhì)譜法鑒定純化肽。

實(shí)施例2

坎普他汀的色氨酸類似物在大腸桿菌中的表達(dá)

為表達(dá)含有色氨酸衍生物的坎普他汀類似物，pTWTNl-坎普他汀克隆轉(zhuǎn)化Trp 82營養(yǎng)缺陷型ER2566。在補(bǔ)充1mM如上所述的L-色氨酸的M9基本培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)。細(xì)胞生長至OD6O0為0.8-1.0，然后離心收集并重懸于含有2mM期望的色氨酸類似物的新鮮基本培養(yǎng)基中，色氨酸類似物為：5-氟代-色氨酸，6-氟代-色氨酸、7-氮雜-色氨酸或5-羥色氨酸。表達(dá)的坎普他汀類似物進(jìn)一步如實(shí)施例1所述純化。

實(shí)施例3

肽合成

肽合成和純化如Sahu等,1996；Sahu等,2000；和Mallik等,2005所述進(jìn)行。簡言之，使用Fmoc氨基樹脂和標(biāo)準(zhǔn)的側(cè)鏈保護(hù)基在Applied Biosystem肽合成儀(型號431A)中合成肽。肽在22℃與含有5％苯酚、5％苯硫基甲烷、5％水、2.5％乙二硫醇和82.5％三氟乙酸(TFA)的溶劑混合物孵育3小時(shí)，將其從樹脂切下來。反應(yīng)混合物通過玻璃燒結(jié)的漏斗過濾，用冷乙醚沉淀，溶于含0.1％TFA的50％乙腈，凍干。

將切割后獲得的粗肽溶于含0.1％TFA的10％乙腈并使用反相C-18柱純化(Waters,Milford,MA)。使用試劑三氟醋酸鉈(III)通過樹脂上環(huán)化法實(shí)現(xiàn)二硫化物氧化。這個(gè)方法刪除了稀釋溶液氧化的步驟和隨后的反相HPLC前通過凍干而濃縮的耗時(shí)步驟。使用這個(gè)方法，不存在多聚體的形成并獲得了高水平(～90％)的愚笨去保護(hù)、氧化或環(huán)化物質(zhì)。激光解吸質(zhì)譜法和HPLC證實(shí)了所有肽的同一性和純度。

對于5-氟代-色氨酸、1-甲基-色氨酸和5-甲基-色氨酸類似物的合成，使用Fmoc-dl-衍生物。肽對映體的分離如Meyers等1978所述進(jìn)行。每個(gè)肽的dl混合物在C18反相HPLC柱上使用含10％乙腈的0.01M乙酸銨,pH 4.1分離為d和l同質(zhì)異構(gòu)肽。用V8蛋白酶處理肽，隨后使用MALDI-TOF質(zhì)譜法(MicroMass TOFspec2E)分析，測定洗脫肽的同分異構(gòu)的同一性。

實(shí)施例4

補(bǔ)體抑制試驗(yàn)

坎普他汀及其類似物對補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制活性通過測定它們經(jīng)免疫復(fù)合物對補(bǔ)體系統(tǒng)的激活作用來測定。補(bǔ)體激活抑制通過測定抑制正常人血漿中C3固定于卵白蛋白-抗卵白蛋白復(fù)合物來估計(jì)。Microliter孔用50μl卵白蛋白(10mg/ml)在25℃包被2小時(shí)(4℃包被過夜)。用10mg/ml BSA 200μl在25℃浸透該孔1小時(shí)，然后添加兔抗卵白蛋白抗體以形成可被補(bǔ)體激活的免疫復(fù)合物。各種濃度的三十微升肽直接添加至每孔，隨后添加1:80稀釋度的人血漿30μl。30分鐘孵育后，使用山羊抗人C3HRP-偶聯(lián)抗體檢測結(jié)合的C3b/iC3b。添加ABTS過氧化物酶底物顯色并在405nm測量光密度。

基于相當(dāng)于100％補(bǔ)體激活的吸光度，將在405nm獲得的吸光度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為抑制％。抑制％對肽濃度作圖，和使用Origin 7.0軟件使所得數(shù)據(jù)集符合對數(shù)劑量反應(yīng)函數(shù)。引起C3b/iC3b沉淀50％抑制的肽濃度作為IC₅₀并用于比較各種肽的活性。從達(dá)到最低卡方值的符合參數(shù)中獲得IC₅₀值。

實(shí)施例5

C3與坎普他汀及其類似物相互作用的等溫滴定量熱法分析

使用Microcal VP-ITC量熱儀(Micrical Inc,Northampton,MA)實(shí)施等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)。3.5-5μM的蛋白濃度和80-200μM的肽濃度用來做這個(gè)實(shí)驗(yàn)。全部滴定在PBS(含150mM NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)中進(jìn)行。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，靶蛋白、C3輸入細(xì)胞，和肽輸入注射器。全部實(shí)驗(yàn)在25℃進(jìn)行，對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，2μl肽注射劑進(jìn)入含蛋白的細(xì)胞。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，原始等溫線通過減去稀釋熱減去代表進(jìn)入緩沖液的肽注射劑的等溫線進(jìn)行校正。使所得等溫線適于Origin 7.0軟件內(nèi)的各種模式，和卡方值達(dá)到最低的模式被認(rèn)為適于各自的數(shù)據(jù)集。結(jié)合親合力和熵值針對log P值作圖。

實(shí)施例6

通過細(xì)菌表達(dá)的坎普他汀類似物估計(jì)的色氨酸在C3-坎普他汀相互作用中的作用

使用內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)將吲哚環(huán)化學(xué)性質(zhì)不同的四種不同的色氨酸類似物引入坎普他汀。表達(dá)后，一步純化肽，最終得率2mg/L培養(yǎng)物。還使用MALDI譜指出的ER2566/Trp 82營養(yǎng)缺陷型表達(dá)色氨酸類似物5-氟代-色氨酸、6-氟代-色氨酸、7-氮雜-色氨酸和5-羥色氨酸，純化所得肽至均一。天然坎普他汀和類似物通過二硫鍵在體內(nèi)被環(huán)化，通過它們不能與PHMB起反應(yīng)而表明。在反相C18HPLC柱上進(jìn)一步地純化所有的肽。

所表達(dá)坎普他汀類似物G(-1)/V4W/H9A/N14(SEQ ID NO:15)的活性顯示出1.2μM的IC₅₀，這類似于對Ac-V4W/H9A類似物SEQ ID NO:5)觀察到的活性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明位于所表達(dá)肽N-末端的甘氨酸起著類似于位于Ac-V4W/H9A類似物N-末端的乙?；淖饔?。

發(fā)現(xiàn)除7-氮雜-色氨酸類似物之外的所有表達(dá)的坎普他汀類似物在所測試的濃度下都具有活性。然而，肽顯示出相對于類似物Ac-V4W/H9A不同水平的活性(圖1；表2)。在第9位含6-氟代-色氨酸和5-氟代-色氨酸以及丙氨酸的坎普他汀分別顯示出比Ac-V4W/H9A類似物高2.8和2.5倍的活性。

表⒉所表達(dá)肽的抑制活性

^*相對于肽H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH₂(坎普他汀,SEQ ID NO:1)的活性^c代表羥基

^b代表合成肽

不受任何特定機(jī)制的限制，人們相信添加氟原子通過增加吲哚環(huán)的疏水性而增加肽的活性。也研究了摻入疏水性較低的色氨酸類似物5-羥色氨酸和7-氮雜-色氨酸。與5-氟代和6-氟代類似物的結(jié)果相比，含5-羥色氨酸的坎普他汀類似物與Ac-V4W/H9A類似物(SEQ ID NO:5)相比顯示出活性降低27.5倍，和含7-氮雜-色氨酸的肽在所測試濃度下根本未顯示出活性。7-氮雜-色氨酸在分子結(jié)構(gòu)上類似于色氨酸，除了它在吲哚環(huán)的第7位具有一個(gè)氮原子，而不是碳原子。7-氮雜-色氨酸置換時(shí)觀察到的活性降低顯示出這個(gè)碳原子的相對重要性。

實(shí)施例7

各個(gè)色氨酸在C3-坎普他汀相互作用中的作用

使用固相肽合成產(chǎn)生在第4位、第7位或第4和第7兩個(gè)位置選擇性摻入含5-氟代-色氨酸，在第9位摻入丙氨酸的坎普他汀類似物。使用Fmoc-5-氟代-dL-色氨酸進(jìn)行合成。這個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生含有5-氟代-d-色氨酸和5-氟代-L-色氨酸的肽的對映異構(gòu)混合物。合成三種不同的肽：兩種肽在第4或第7位獨(dú)立地具有單個(gè)置換，和一個(gè)肽在第4和第7位含有置換。在單個(gè)置換的情況下可以產(chǎn)生5-氟代-L-色氨酸和5-氟代-d-色氨酸類似物的混合物，而在雙置換的情況下就可能產(chǎn)生四個(gè)對映異構(gòu)體組合的混合物。每種肽混合物進(jìn)一步經(jīng)受反相HPLC以分離肽對映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體的鑒定通過用V8蛋白酶消化肽，隨后使用MALDI分析消化的產(chǎn)品來進(jìn)行。只有當(dāng)其后是一個(gè)l-氨基酸時(shí)，V8蛋白酶才在Asp殘基的C末端側(cè)切開。質(zhì)譜法鑒定切割產(chǎn)物表明首先洗脫的l-對映異構(gòu)肽后面跟隨d-形式，這種情況下沒有檢測到切割片段。

測試含5-氟代-L-色氨酸或5-氟代-d-色氨酸或兩者的所有肽的補(bǔ)體抑制活性。在兩個(gè)位置都被5-氟代-L-色氨酸置換的合成肽顯示出比Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)高2.5倍的活性(表3)。

表⒊合成的含5-氟代-L-色氨酸的坎普他汀類似物的補(bǔ)體抑制活性

^*相對于肽H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH₂(坎普他汀,SEQ ID NO:1)的活性

補(bǔ)體抑制試驗(yàn)(圖2；表3)表明單獨(dú)第4位的5-氟代-L-色氨酸的置換致使肽活性比Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)至少降低1.5倍。單獨(dú)第7位的5-氟代-L-色氨酸的置換與Ac-V4W/H9A相比活性增加2.7倍。在第4和第7位5-氟代-L-色氨酸的同時(shí)置換也導(dǎo)致活性相對于Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)增加2.5倍。在第4或7位，或在兩個(gè)位置5-氟代-d-色氨酸的置換致使肽無活性。

實(shí)施例8

色氨酸介導(dǎo)的C3識別坎普他汀的熱力學(xué)基礎(chǔ)

使用等溫滴定量熱法研究肽與C3的結(jié)合和研究它們的活性的熱力學(xué)基礎(chǔ)。使對于所有肽與C3的相互作用獲得的量熱數(shù)據(jù)適于化學(xué)計(jì)算接近于1的一組位點(diǎn)模式。據(jù)信這些肽與C3的結(jié)合以1:1的比例發(fā)生。由這些擬合產(chǎn)生的熱動力參數(shù)在表4中示出。如Kd值顯然可知，在第7位含5-氟代-L-色氨酸單個(gè)置換和在第4和7位含雙置換顯示出比Ac-V4W/H9A(SEQ ID NO:5)和Ac-V4(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:18)類似物更強(qiáng)的結(jié)合。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與補(bǔ)體抑制試驗(yàn)(表3)中觀察到的相對活性一致，表明存在結(jié)合－活性相關(guān)性。

與C3結(jié)合的所有的肽具有負(fù)焓和正熵。這種結(jié)合是坎普他汀與C3相互作用的特征。在研究的所有肽之中，第7位置換的Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A類似物(SEQ ID NO:19)顯示出比野生型副本更高的結(jié)合焓(ΔH＝-21.83，ΔΔH＝-3.69)。與C3結(jié)合的第4位置換的Ac-V4(5f-l-W)/H9A類似物(SEQ ID NO:18)的焓是-16.69kcal/mole，顯示比其野生型副本低1.45kcal/mole。

第4位摻入5-氟代-色氨酸引起焓相對于這個(gè)位置是色氨酸的肽減少1.45kcal/mole(表4)。由于色氨酸和5-氟代-色氨酸之間唯一的差異是吲哚C5的氟原子，因此這種焓減少可以歸于氫被氟取代。

表4.合成的含5-氟代-L-色氨酸的坎普他汀類似物和C3相互作用的熱動力參數(shù)

第7位摻入5-氟代-色氨酸，焓相對于野生型增加3.69kcal/mole(表4)。不受任何特定機(jī)制的限制，據(jù)信第7位色氨酸參與利于焓的相互作用，例如氫鍵。用氟原子取代一個(gè)吲哚氫可以加強(qiáng)吲哚NH的氫鍵特性，這是由于pKa下降。或者，氟形成氫鍵是它的給電子性質(zhì)的結(jié)果，如十四碳(3-氟代酪氨酰)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)所證明。

所觀察到焓增加的另一種解釋是水分子橋接氟原子和C3上氫受體之間的相互作用，這種情況下需要形成兩個(gè)氫鍵(相當(dāng)于大約4kcal/mole能量)。這個(gè)學(xué)說的支持來自所觀察到的第7位置換的Ac-V4W/W7(5fW)/H9A類似物(SEQ ID NO:19)相對于野生型類似物的相互作用(表4)的熵減少，這種減少可以通過交界面上另外的水分子的結(jié)合而產(chǎn)生。在其他系統(tǒng)種已經(jīng)觀察到水介導(dǎo)的氟原子及其他氫鍵受體之間的相互作用。

雙置換的類似物與C3的結(jié)合導(dǎo)致-19.85kcal/mole的焓變，-9.35kcal/mole的熵變和-10.5kcal/mole的自由能變化。相信在兩個(gè)位置同時(shí)摻入5-氟代-色氨酸取消了單個(gè)置換的影響。

實(shí)施例9

另外的坎普他汀類似物

在第4位摻入色氨酸類似物。實(shí)施例5和6表明在坎普他汀的第4位用色氨酸置換纈氨酸使其活性增加45倍。為進(jìn)一步研究坎普他汀與C3結(jié)合過程中第4位殘基介導(dǎo)的相互作用的性質(zhì)，用色氨酸類似物和2-萘基丙氨酸置換第4位的色氨酸。

使用基于ELISA的試驗(yàn)測試了第4位和第9位丙氨酸上含色氨酸類似物的所有肽類似物的活性。雖然用1-甲基-色氨酸(Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)和2-萘基丙氨酸(Ac-V4(2-Nal)/H9A)(SEQ ID NO:7)置換，活性比坎普他汀分別增加264和99倍，但是5-氟代-色氨酸(Ac-V4(5f-l-W)/W7/H9A)(SEQ ID NO:18和5-甲基色氨酸(Ac-V4(5-甲基-W)/H9A)(SEQ ID NO:22)的置換導(dǎo)致較低的活性；比野生型肽顯示的活性高31和67倍(表5)。圖3顯示了描繪活性的抑制曲線和表5顯示了由曲線計(jì)算的IC₅₀值和肽與原坎普他汀的活性相比的相對活性。圖5顯示了針對色氨酸類似物和2-萘基丙氨酸的log P值描繪的抑制常數(shù)(IC₅₀)。

表5.坎普他汀類似物的補(bǔ)體抑制活性

*相對于OfH-I(CVVQDWGHHRC)T-NH₂(坎普他汀,SEQ ID NO:1)的活性。

也使用等溫滴定量熱法研究了坎普他汀肽的結(jié)合。使對于所有肽與C3的相互作用獲得的量熱數(shù)據(jù)適于化學(xué)計(jì)算接近于1的一組位點(diǎn)模式(圖4)。這個(gè)結(jié)果提示這些肽與C3的結(jié)合以1:1的比例發(fā)生。由這些擬合產(chǎn)生的熱動力參數(shù)在表6中示出。從Kd值顯然可知，Ac-V4(1-甲基-W)/H9A與第4位具有單個(gè)置換的所有其他肽相比顯示出更高的結(jié)合親和力(Kd＝0.015μM)。針對類似物的log P描繪這些值表明色氨酸類似物和2-萘基丙氨酸的結(jié)合親合力和疏水性之間存在相關(guān)性。對于每個(gè)相關(guān)性，結(jié)合親合力隨著第4位摻入的類似物疏水性的增加而增加。這個(gè)觀察結(jié)果與log P和抑制常數(shù)之間顯示的相關(guān)性一致。

表6.合成的含5-氟代-L-色氨酸的坎普他汀類似物和C3相互作用的熱動力參數(shù)

與C3結(jié)合的所有肽具有負(fù)焓和正熵，提示這種結(jié)合是焓驅(qū)動的。這種結(jié)合是坎普他汀與C3相互作用的特征。然而，這些肽結(jié)合的特征是焓變低于野生型，和熵變朝著有利端變動。圖5B顯示了log P對-TΔS的圖，其表明隨著第4位摻入的類似物的疏水性增加，熵更有利由此使得對自由能變化產(chǎn)生積極影響。

在第7位摻入色氨酸類似物。實(shí)施例7提出第7位色氨酸與C3上殘基形成氫鍵。為進(jìn)一步研究這個(gè)可能性，用類似于第4位取代的色氨酸類似物取代第7位色氨酸，以闡明在這個(gè)位置由色氨酸引起的相互作用的性質(zhì)。具有5-氟代-色氨酸的置換(Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A)(Seq ID NO:19)產(chǎn)生高活性121倍的肽。(圖3，表5)。第7位用類似物5-甲基-色氨酸或1-甲基-色氨酸置換致使坎普他汀無活性(未顯示數(shù)據(jù))。因此，觀察到色氨酸類似物的活性和疏水性之間無相關(guān)性。

通過量熱法同時(shí)研究了不同的色氨酸7-類似物的熱力學(xué)特性。(表6)。由于沒有檢測到在第7位含5-甲基-色氨酸或者1-甲基色氨酸的肽的結(jié)合，因此不存在結(jié)合參數(shù)。僅肽Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:19)與C3結(jié)合。結(jié)合親合力是0.035uM，這高于對于在第4位含有色氨酸類似物的肽所觀察到的，除了肽Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)。與第4位具有色氨酸類似物的肽相比，與C3結(jié)合的Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A(SEQ ID NO:19)具有很有利的結(jié)合焓變(ΔH＝-21.83，ΔΔH＝-3.69)和不利的熵變(-TΔS＝11.56，-TΔΔS＝2.77)，提示進(jìn)一步有利的極性的非共價(jià)相互作用。

該結(jié)果表明第7位摻入5-氟代-色氨酸導(dǎo)致坎普他汀活性增加，而類似物5-甲基-色氨酸和1-甲基-色氨酸的摻入致使坎普他汀無活性。1-甲基-色氨酸摻入時(shí)坎普他汀活性喪失支持色氨酸7的N-H介導(dǎo)的氫鍵對于坎普他汀與C3相互作用很重要的推論。此外，5-甲基-色氨酸摻入時(shí)坎普他汀活性完全喪失提示第7位不甚允許疏水性氨基酸。

在第4和第7兩個(gè)位置摻入色氨酸類似物。由于用1-甲基-色氨酸置換第4位色氨酸和用5-氟代-色氨酸置換第7位色氨酸產(chǎn)生活性急劇增加的坎普他汀類似物，因此產(chǎn)生在第4和7位含置換的坎普他汀類似物。所得肽(Ac-V4(1-甲基-W)/W7(5f-l-W)/H9A)(SEQ ID NO:24)產(chǎn)生類似于用1-甲基-色氨酸(Ac-V4(1-甲基-W)/H9A)(SEQ ID NO:23)單個(gè)置換的抑制曲線(圖3，表5)。量熱器中觀察到這個(gè)肽的結(jié)合親合力(K_d＝0.017)也類似于Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)。這些觀察結(jié)果提示在這些實(shí)驗(yàn)條件下，在第4位1-甲基-色氨酸存在下第7位5-氟代-色氨酸沒有作用。

在第4位摻入另一個(gè)色氨酸類似物。為進(jìn)一步研究坎普他汀與C3結(jié)合過程中，第4位殘基介導(dǎo)的相互作用的性質(zhì)，用色氨酸類似物1-甲?；?色氨酸取代第4位的色氨酸。

圖6顯示了補(bǔ)體抑制百分比vs.Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)(圓形)和Ac-V4(1-甲?；?W)/H9A(SEQ ID NO:25)的肽濃度的比較。如所見，1-甲?；?W類似物與1-甲基-W類似物的補(bǔ)體抑制活性基本上相同。

實(shí)施例10

坎普他汀類似物的聚乙二醇化

坎普他汀半衰期延長對于它在慢性治療中的使用是有利的。通過聚乙二醇化，在幾種情況下已經(jīng)實(shí)現(xiàn)測試的治療性肽半衰期延長(參見Veronese等,2001),因?yàn)镻EG具有延遲生物分子被各種機(jī)制從循環(huán)中除去的能力，包括降低腎清除率、蛋白水解和免疫原性。聚乙二醇化包括PEG聚合物與大分子，優(yōu)選與賴氨酸的伯胺的共價(jià)連接。

這個(gè)實(shí)施例描述了聚乙二醇化坎普他汀類似物Ac-V4(1-甲基-W)/H9A-K-PEG 5000(SEQ ID NO:36)的制備方法，并評價(jià)了該化合物抑制補(bǔ)體激活的能力。

Fmoc-NH-NHS-5000PEG購自Nektar transforming therapeutics,490discovery Dr,Huntsville,AL 35806。

化合物Ac-V4(1-甲基-W)/H9A-K-PEG 5000(SEQ ID NO:36)由Fmoc固相肽化學(xué)根據(jù)改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)約進(jìn)行化學(xué)合成。簡言之，PEG溶于3ml二氯甲烷中，人工添加1ml 2M DIEA，和PEG混合5分鐘。

然后將PEG轉(zhuǎn)入容器中，使之偶聯(lián)過夜。接著用20％哌啶對PEG去保護(hù)20分鐘。

然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行合成，為了使PEG與分子側(cè)鏈連接，賴氨酸插入該分子C末端。

用Reagent D(TFA:H2O:TIS:苯酚，87.5:5:2.5:5)(4mL)在25℃90分鐘實(shí)現(xiàn)肽的最終切割，以提供期望的產(chǎn)物。然后在C18反相HPLC柱上純化肽、凍干和MALDI-TOF表征。

使用實(shí)施例4描述的體外試驗(yàn)測試聚乙二醇化的坎普他汀類似物的補(bǔ)體抑制活性。如圖7所示，聚乙二醇化的類似物具有抑制補(bǔ)體激活的活性，然而，比非聚乙二醇化的類似物Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)達(dá)到相同抑制所需綴合物要多7倍。

實(shí)施例11

坎普他汀類似物的白蛋白結(jié)合蛋白綴合物

Dennis等(2002)鑒定了一系列具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:37)的肽，它們以高親合力特異性結(jié)合來自多個(gè)物種的血清白蛋白。化學(xué)計(jì)量法測定這些肽與白蛋白以1:1結(jié)合，位點(diǎn)不同于已知的小分子結(jié)合部位。肽SA21(AcRLIEDICLPRWGCLWEDDNH2；SEQ ID NO:38)當(dāng)通過靜脈內(nèi)推注注射給兔子時(shí)，具有罕見的2.3h的長半衰期。如詳細(xì)說明書中提及，與D3H44的抗組織因子Fab融合的相關(guān)序列使Fab能夠以與SA21相似的親合力結(jié)合白蛋白，同時(shí)保留Fab結(jié)合組織因子1的能力(Nguyen等2006)。在小鼠和兔子中，與白蛋白的這種相互作用導(dǎo)致體內(nèi)清除率與野生型D3H44Fab相比降低25和58倍。在兔子中，半衰期延長37倍達(dá)32.4小時(shí)，和在小鼠中延長26倍達(dá)10.4小時(shí)，在這些動物中達(dá)到白蛋白半衰期的25-43％。超過Fab 2的這些半衰期可與聚乙二醇化的Fab分子、免疫粘附素和白蛋白融合物中所見的情形相匹敵。

這個(gè)實(shí)施例描述了與白蛋白結(jié)合肽融合的坎普他汀類似物的合成，和它在體外試驗(yàn)中抑制補(bǔ)體的活性。

化合物4(1MeW)-ABP由Fmoc固相肽化學(xué)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)約進(jìn)行化學(xué)合成。肽的N-和C末端用乙?；王０坊Ｗo(hù)。進(jìn)一步在C18反相HPLC柱上純化肽、凍干和MALDI質(zhì)譜法TOF表征。

對于環(huán)化，肽-樹脂(根據(jù)氨基酸分析0.10mmol/g填載)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中溶脹5分鐘、過濾和用94:1:5的DCM/TFA/TIS(5mL)25℃處理3次×2分鐘，每次選擇性去保護(hù)S-Mmt保護(hù)基，除去溶劑N2壓力。用CH₂Cl₂、DMF和NMP(各5次×2分鐘，2mL)洗滌這些二(硫醇)、二(Acm)-肽-樹脂中間物、在NMP(2mL)中進(jìn)一步溶脹5分鐘，然后用含Et₃N(2當(dāng)量)的NMP 25℃處理4小時(shí)。然后用DMF和CH₂Cl₂洗滌肽-樹脂(各5次×2分鐘，2mL)。樹脂結(jié)合形式的第一個(gè)環(huán)形成后，再次用DMF洗滌肽-樹脂(5次×2分鐘，2mL)并在DMF(2mL)中溶脹5分鐘、過濾并用含T1(tfa)3(1.5當(dāng)量)的DMF-苯甲醚(4mL)處理以環(huán)化第二個(gè)二硫環(huán)。25℃和緩攪攪拌4小時(shí)后，用DMF除去鉈試劑(8次x 2分鐘，2mL)和用CH₂Cl₂進(jìn)一步洗滌肽-樹脂(5次x 2分鐘，2mL)。用Reagent D(TFA:H2O:TIS:苯酚，87.5:5:2.5:5)(4mL)在25℃90分鐘完成雙環(huán)肽的最終切割，以提供期望的產(chǎn)物。

生成的綴合肽(SEQ ID NO:39)如下所示。

使用實(shí)施例4描述的體外試驗(yàn)測試了白蛋白結(jié)合肽-坎普他汀的補(bǔ)體抑制活性。如圖8所示，該綴合物具有抑制補(bǔ)體激活的活性，然而，比非綴合類似物Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQ ID NO:23)達(dá)到相同量抑制所需的綴合物要多7倍。

本發(fā)明涉及以下實(shí)施方式：

1.一種抑制補(bǔ)體激活的化合物，包含具有下述序列的肽：Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5(SEQ ID NO:26)；

其中：

Xaa1是Ile、Val、Leu、Ac-Ile、Ac-Val、Ac-Leu或包含Gly-Ile的二肽；

Xaa2是Trp或Trp的類似物，其中Trp的類似物與Trp相比疏水特性增加，條件是，如果Xaa3是Trp，則Xaa2是Trp的類似物；

Xaa3是Trp或在其吲哚環(huán)上包含化學(xué)修飾的Trp的類似物，其中化學(xué)修飾增加吲哚環(huán)的氫鍵能；

Xaa4是His、Ala、Phe或Trp；

Xaa5是L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly、包含Thr-Asn或Thr-Ala的二肽、或包含Thr-Ala-Asn的三肽，其中L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly或Asn中任何一個(gè)的羧基末端-OH任選被-NH₂替代；并且

兩個(gè)Cys殘基通過二硫鍵相連。

2.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa2參與與C3的非極性相互作用。

3.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa2參與與C3的非極性相互作用，和Xaa3參與與C3的氫鍵鍵合。

4.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa3參與與C3的氫鍵鍵合。

5.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa2的色氨酸類似物包含鹵代色氨酸。

6.實(shí)施方式5的化合物，其中鹵代色氨酸是5-氟代-L-色氨酸或6-氟代-L-色氨酸。

7.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa2的色氨酸類似物在色氨酸第5位包含低級烷氧基或低級烷基取代基。

8.實(shí)施方式7的化合物，其中Xaa2的色氨酸類似物是5-甲氧基色氨酸或5-甲基色氨酸或1-甲基色氨酸或1-甲?；彼帷?/p>

9.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa2的色氨酸類似物在色氨酸第1位包含低級烷?；虻图壨榛〈?。

10.實(shí)施方式9的化合物，其中Xaa2的色氨酸類似物是1-甲基色氨酸或1-甲?；彼?。

11.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa3的色氨酸類似物包含鹵代色氨酸。

12.實(shí)施方式11的化合物，其中鹵代色氨酸是5-氟代-L-色氨酸或6-氟代-L-色氨酸。

13.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa4是Ala。

14.實(shí)施方式1的化合物，其中Xaa2在色氨酸第1位包含低級烷?；虻图壨榛〈琗aa3任選包含鹵代色氨酸和Xaa4包含丙氨酸。

15.實(shí)施方式14的化合物，其中Xaa2是1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸和Xaa3任選包含5-氟代-L-色氨酸。

16.實(shí)施方式1的化合物，包含SEQ ID NOS：15-25任何序列。

17.實(shí)施方式1的化合物，其包括由編碼該肽的多核苷酸表達(dá)而生產(chǎn)的肽。

18.實(shí)施方式1的化合物，其中該化合物至少部分由肽合成法生產(chǎn)。

19.實(shí)施方式1的化合物，包含SEQ ID NOS：15-25中的任何一個(gè)。

20.實(shí)施方式1的化合物，其中該化合物是聚乙二醇化的。

21.實(shí)施方式20的化合物，包含SEQ ID NO:36。

22.實(shí)施方式1的化合物，進(jìn)一步包含延長該化合物體內(nèi)保留時(shí)間的另外的肽成分。

23.實(shí)施方式22的化合物，其中另外的肽成分是白蛋白結(jié)合肽。

24.實(shí)施方式23的化合物，包含SEQ ID NO:39。

25.一種抑制補(bǔ)體激活的化合物，包含SEQ ID NO:26的非肽或部分肽模擬物，其中該化合物結(jié)合C3并抑制補(bǔ)體激活，在同等試驗(yàn)條件下，其活性比包含SEQ ID NO:1的肽大至少100倍。

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本發(fā)明不限于上面描述和舉例說明的實(shí)施方案，而是能夠在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行變化和改進(jìn)。