本發(fā)明涉及一種運用基因工程手段得到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2及其應用。

背景技術：
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真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Fungal immunomodulatory proteins,以下簡稱為FIPs)具有增強免疫力等多種重要的生理功能。

FIPs最早是用食用菌類提取而被發(fā)現(xiàn)的，但提取工藝復雜、周期長、成本高、得率低，很難開發(fā)利用。雖然FIPs具有序列和結構保守性，但是不同來源的FIPs活性和穩(wěn)定性差異很大。

通過基因工程方法從已完成基因組測序的真菌中獲得可開發(fā)利用的新FIPs蛋白，既能豐富FIPs家族的種類，更能為人類健康的保健和治療提供新的免疫調(diào)節(jié)劑。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是通過生物信息學方法篩選到新的來源于真菌的免疫調(diào)節(jié)蛋白，使其能夠應用于制備免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物。

本發(fā)明人通過生物信息學方法篩選到一種來源于真菌Dichomitus squalens LYAD-421 SS1的免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2，發(fā)現(xiàn)其適合于在保健食品和醫(yī)藥中使用。

所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2，全長111個氨基酸，理論分子量為12.512kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

FIP-dsq2蛋白是一種新型的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明人通過將其氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)：FIP-dsq2蛋白與小孢靈芝、赤靈芝、紫靈芝和金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白GMI、FIP-gja、LZ-8和FIP-fve的序列同源性僅分別為61.3％、60.4％、58.6％和51.8％。說明FIP-dsq2是一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。

本發(fā)明還提供并合成了編碼上述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的基因：通過一對引物FIP-dsq2-F(EcoRI)：5'-C CAA GAA TTC GTC GAC ACT TCC-3'和FIP-dsq2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG ATT CCA TTG AGC-3'，用基因合成的方法克隆了這一真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的基因，DNA全序列分析結果表明，fip-dsq2全長336bp，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了包含蛋白FIP-dsq2基因的重組表達載體。方法是將本發(fā)明的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。優(yōu)選的表述載體是pGEX-6T-1。

作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，所述表達載體合適的限制性酶切位點之間是pGEX-6T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位點之間，得到重組大腸表達載體pGEX-fip-dsq2。

將上述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞大腸桿菌。所述宿主細胞優(yōu)選為大腸桿菌Rosetta，得到重組菌株Rosetta(pGEX-fip-dsq2)。

本發(fā)明還提供了包含真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株Rosetta(pGEX-fip-dsq2)。

本發(fā)明還提供了制備真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的方法，包括以下步驟：

1)將含F(xiàn)IP-dsq2基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的表達；以及

3)回收并純化所表達的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。

經(jīng)腫瘤抑制、凋亡和遷移實驗證實：FIP-dsq2蛋白對人肺腺癌腫瘤細胞A549具有明顯的抑制增殖、誘導凋亡和阻止遷移的作用，可應用于保健品和醫(yī)藥等工業(yè)(詳見實施例2～4)。

通過如下實驗證明了本發(fā)明提供的新的免疫調(diào)節(jié)蛋白的功能：

1、體外抗腫瘤活性

實驗結果：

FIP-dsq2對肺腺癌A549細胞具有毒性作用，半致死計量IC₅₀為15.08μg/mL(圖2)；8μg/ml的不同來源的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白比較實驗結果表明，F(xiàn)IP-dsq2對A549的毒性作用略弱于靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8，顯著高于金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve

結論：

FIP-dsq2對腫瘤細胞具有極強的高毒性作用，及具應用潛力。(實施例3)

2、誘導腫瘤細胞凋亡分析

實驗結果：

FIPs對A549細胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve處理A549細胞24h后，凋亡率分別為20.71％、38.82％、10.88％(圖3)。

結論：

FIP-dsq2對腫瘤細胞A549具有凋亡作用，其誘導凋亡作用低于LZ-8，卻顯著高于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物(實施例4)。

3、抑制腫瘤細胞遷移檢測

實驗結果：

24h后，未處理細胞(NC)劃出傷口明顯愈合，8μg/ml的LZ-8處理后，傷口愈合現(xiàn)象不明顯；8μg/ml的FIP-dsq2處理后，傷口愈合現(xiàn)象較為顯著；而8μg/ml的FIP-fve處理A549細胞24h后，傷口愈合情況極為顯著，與陰性對照極為相似(圖4)。

結論：

FIP-dsq2可以抑制腫瘤細胞A549遷移，F(xiàn)IP-dsq2對腫瘤細胞A549的遷移抑制作用略微差于LZ-8，卻顯著強于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物(實施例5)。

本發(fā)明優(yōu)點和有益效果：

1、可以提供相當數(shù)量的免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)FIP-dsq2純品，完全能滿足臨床與醫(yī)藥應用需求。

FIP-dsq2在該大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)高效表達，表達量為29mg/L(實施例2)；經(jīng)柱純化后，蛋白質(zhì)的含量達到電泳純(圖1)。而目前通常從幾千克食用菌中只能提取毫克級蛋白。

2、FIP-dsq2具有抗腫瘤活性，具有治療應用潛力。

抗腫瘤效應檢測結果表明，F(xiàn)IP-dsq2對A549具有毒性作用(實施例3)，可以誘導A549凋亡(實施例4)，抑制A549遷移(實施例5)；其抗腫瘤效應與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8相當，但顯著高于金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve，極具應用潛力。

3、首次運用基因工程手段提供了一個新的真菌來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白。

由于運用基因工程手段來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2產(chǎn)品還未見報道。本發(fā)明首次提供了一個新的真菌來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。而且，根據(jù)本發(fā)明的技術方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。

附圖說明：

圖1～圖4是對本發(fā)明純化制備的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2進行分析和功能實驗，其中：

圖1是SDS-PAGE分析純化的FIPs：其中，條帶1和4為蛋白marker，條帶2、3、5分別為純化的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8、金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve和Dichomitus squalens免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。

圖2是FIP-dsq2蛋白抑制腫瘤細胞A549增殖結果。

圖3是FIP-dsq2蛋白誘導腫瘤細胞A549凋亡結果。

圖4是FIP-dsq2蛋白抑制腫瘤細胞A549遷移結果。

具體實施方式

以下實施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，并不限制本發(fā)明的范圍。

試驗材料

1、細胞株：人肺腺癌細胞A549，購買于北京協(xié)和醫(yī)院細胞資源中心。

2、試劑耗材

CCK試劑盒：全式金細胞活性檢測試劑盒；

TransDetct^TM Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit：全式金細胞凋亡檢測試劑盒；

PCR引物合成和基因測序均由上海生工生物公司完成；

酶類：內(nèi)切酶EcoRI和XhoI購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司；Prescission Protease由實驗室制備；

儀器：離心機、振蕩搖床、顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀；

生化試劑：氨芐青霉素、青霉素(鈉鹽)、硫酸鏈霉素、溴酚蘭、噻唑蘭(MTT)、胎牛血清(FBS)，二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產(chǎn)品。

3、培養(yǎng)基

高糖DMEM培養(yǎng)液，加入10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，0.22μm濾膜過濾滅菌后4℃保存。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。

本實施例中的抗腫瘤效應檢測，均以靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(LZ-8)和金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-fve)為陽性對照。

實施例1真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2編碼基因篩選、克隆和表達載體構建

以金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve為誘餌，在NCBI真菌基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，在擔子真菌Dichomitus squalens LYAD-421SS1基因組中發(fā)現(xiàn)與FIP-fve同源性為51.8％的FIP-dsq2編碼基因，基因全長336bp(333bp外加一個終止密碼子TAA)，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。經(jīng)密碼子優(yōu)化后，合成基因。

設計并合成引物FIP-dsq2-F(EcoRI)：5'-C CAA GAA TTC GTC GAC ACT TCC-3'和FIP-dsq2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG ATT CCA TTG AGC-3'，用以上引物擴增合成基因。用EcoRI和XhoI酶切PCR擴增產(chǎn)物，獲得目標基因fip-dsq2，將目標基因連接到經(jīng)相同酶切的表達載體pGEX-6T-1，獲得含有真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2基因的重組表達載體pGEX-fip-dsq2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，獲得重組菌株Rosetta(pGEX-fip-dsq2)。

實施例2真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2表達純化

取陽性轉(zhuǎn)化子Rosetta(pGEX-fip-dsq2)菌株，接種于20mL含有50μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm過夜活化。次日，以2％的接菌量，接種于200mL含有50μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.8-1.0，加0.1mM IPTG，20℃200rpm過夜誘導16h后，離心收集菌體。0.2體積的PBS溶解菌體，超聲波破碎，離心收集上清。GST柱純化后，用100U/ml的Prescission Protease 4℃過夜酶切，去除GST標簽。過Q柱和分子篩純化FIP-dsq2蛋白。

實驗結果：

經(jīng)以上表達系統(tǒng)表達FIP-dsq2蛋白的理論分子量為14.08KDa(包括部分載體序列和限制酶切位點翻譯氨基酸)；FIP-dsq2在大腸桿菌中高效表達，表達量為29mg/L；經(jīng)柱純化后，蛋白質(zhì)的含量達到電泳純(圖1)。

結論：

FIP-dsq2在該大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)高效表達，因此可以快速提供相當數(shù)量的蛋白質(zhì)純品，以滿足臨床與醫(yī)藥應用需求。

實施例3CCK法測定真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2體外抗腫瘤活性

實驗方法：

1)在DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)A549細胞，計數(shù)腫瘤細胞，稀釋到終濃度為2.5×10⁵細胞/ml。

2)在96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入100μl腫瘤細胞懸浮液，培養(yǎng)24h后，分別加入100μl的重組蛋白樣品，終濃度為0、1、2、4、8、16、32和64μg/ml。同時加入相同方法制備的8μg/mL靈芝和金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8和FIP-fve做陽性對照。每個樣品5個平行。

3)混勻后，放于5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

4)24小時后，CCK法檢測細胞活性(具體操作參見說明書)。

實驗結果：

FIP-dsq2對肺腺癌A549細胞具有毒性作用，半致死計量IC₅₀為15.08μg/mL(圖2)；8μg/ml的不同來源的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白比較實驗結果表明，F(xiàn)IP-dsq2對A549的毒性作用略弱于靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8，顯著高于金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve。

結論：

FIP-dsq2對腫瘤細胞具有極強的高毒性作用，及具應用潛力。

實施例4真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2誘導腫瘤細胞凋亡分析

實驗方法：

1)在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細胞，細胞計數(shù)，使其終濃度為lx10⁶細胞/ml。

2)在6孔培養(yǎng)板中每孔加入0.8ml腫瘤細胞懸浮液，培養(yǎng)24h后，分別加入0.2ml終濃度為8μg/ml的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve，以正常生長的腫瘤細胞做陰性對照；在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

3)去上清，胰酶消化，3000rpm，室溫離心5分鐘，收集腫瘤細胞。凋亡檢測試劑盒檢測凋亡，具體操作參見說明書。

實驗結果：

FIPs對A549細胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve處理A549細胞24h后，凋亡率分別為20.71％、38.82％、10.88％(圖3)。

結論：

FIP-dsq2對腫瘤細胞A549具有凋亡作用，其誘導凋亡作用低于LZ-8，卻顯著高于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物。

實施例5真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2抑制腫瘤細胞遷移檢測

實驗方法：

4)在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細胞，細胞計數(shù)，使其終濃度為5x10⁵細胞/ml。

5)在6孔培養(yǎng)板中加入上述腫瘤細胞懸浮液，在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，細胞平鋪長滿，用tip頭在培養(yǎng)板單層細胞中間劃線，PBS洗去懸浮細胞和碎片。

6)分別加入終濃度為8μg/ml的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve，以正常生長的腫瘤細胞做陰性對照；在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

7)顯微鏡觀察細胞生長情況，并拍照。

實驗結果：

24h后，未處理細胞(NC)劃出傷口明顯愈合，8μg/ml的LZ-8處理后，傷口愈合現(xiàn)象不明顯；8μg/ml的FIP-dsq2處理后，傷口愈合現(xiàn)象較為顯著；而8μg/ml的FIP-fve處理A549細胞24h后，傷口愈合情況極為顯著，與陰性對照極為相似(圖4)。

結論：

FIP-dsq2可以抑制腫瘤細胞A549遷移，F(xiàn)IP-dsq2對腫瘤細胞A549的遷移抑制作用略微差于LZ-8，卻顯著強于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物。