一種新疆紫草內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說，是一種新疆紫草內(nèi)生真菌，及其菌絲的水溶性 提取物（WAE)用于促進新疆紫草毛狀根生長和提高紫草素類成分含量的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫草是我國的常用中藥材，味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有涼血、活血、解毒透瘆 等功效?！吨腥A人民共和國藥典》（2010版)收錄紫草的主要來源為紫草科（Boraginaceae) 新疆紫草A 或內(nèi)蒙紫草A講的干燥根。紫草藥材的有效成分是萘醌 類成分紫草素及其衍生物和紫草多糖，而研宄表明新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.比內(nèi)蒙紫草的萘醌類有效成分的含量高，臨床療效好，利用價值高，為新疆特有種， 有"道地藥材"之譽，因而行銷國內(nèi)外，已成為是傳統(tǒng)中藥材紫草的主要來源。然而近些年， 由于紫草藥用部位是根部，無節(jié)制的采挖和盜挖導(dǎo)致野生資源破壞嚴重，新疆紫草已被列 為國家三級重點保護野生藥材。由于新疆紫草產(chǎn)于新疆天山海拔2600~3300m的高寒山 區(qū)和草甸帶，野生狀態(tài)下對生境要求嚴格，因此尚無馴化成功和大面積人工栽培成功的報 道，少量栽培紫草品質(zhì)參差不齊，不能批量供應(yīng)市場。因此，有效提高栽培紫草的品質(zhì)、促進 新疆紫草的大面積規(guī)范化種植及產(chǎn)業(yè)化成為另一個迫切需要解決的問題。
[0003] 植物內(nèi)生真菌（Endophyticfungiorfungalendophtes)是指在生活史中的某 一個階段存在于健康植物組織內(nèi)部，不會引起宿主明顯病癥或者對宿主造成明顯傷害的真 菌。研宄表明，在目前研宄過的所有植物中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌，可存在于植物的根、莖、葉、花、 果實等各個部位。1993年，Strobel等首次報道了從短葉紫杉Tkrys△reri/b/ia的樹皮 中分離得到一株能夠產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌引起了國內(nèi)外眾多研 宄者的極大關(guān)注，紛紛把目光投向藥用植物內(nèi)生真菌的研宄。近二十年藥用植物內(nèi)生真菌 的研宄多集中在內(nèi)生真菌的生物多樣性、次生代謝產(chǎn)物和內(nèi)生真菌與宿主之間的相互關(guān)系 等方面。內(nèi)生真菌在生產(chǎn)天然藥用成分、豐富天然藥物寶庫中的作用已被許多研宄所證實。 除此之外，研宄還發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌能夠促進宿主植物的生長，增強宿主的抗逆性，促進藥 用植物中有效成分的積累，已成為中藥品質(zhì)研宄一個嶄新的發(fā)展方向。但是關(guān)于一種新疆 紫草內(nèi)生真菌及其菌絲的水溶性提取物（WAE)用于促進新疆紫草毛狀根生長和提高紫草素 類成分含量的用途目前還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物的制備方 法。
[0008] 本發(fā)明的第五個目的是，提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物的應(yīng)用。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種新疆紫草內(nèi)生真菌，所述的新疆 紫草內(nèi)生真菌的保藏編號為CGMCCNo. 4712。
[0010] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的新疆紫草內(nèi)生真菌在 促進新疆紫草毛狀根生長和提高新疆紫草毛狀根中紫草素類成分含量中的應(yīng)用。
[0011] 所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫草素。
[0012] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲 水溶性提取物，所述的菌絲水溶性提取物的制備方法為：收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的所述的 新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得 到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物。
[0013] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲 水溶性提取物的制備方法，包括以下步驟：收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的所述的新疆紫草內(nèi)生 真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸，100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即 為新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物。
[0014] 為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌 絲水溶性提取物在促進新疆紫草毛狀根生長和提高新疆紫草毛狀根中紫草素類成分含量 中的應(yīng)用。
[0015] 所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫草素。
[0016] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種新疆紫草內(nèi)生真菌，并從新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲中制備了水溶 性提取物（WAE)，發(fā)現(xiàn)WAE能有效促進新疆紫草毛狀根生長，同時能顯著性地提高毛狀根中 紫草素類成分的含量。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0018] 本發(fā)明提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌，其分類命名為深綠木霉 atrwiriofe，菌株代號為AE9,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏日期 (2011年3月27日），保藏編號為CGMCCNo. 4712。
[0019] 它的顯微形態(tài)為：培養(yǎng)的菌絲體無色、分枝繁復(fù)，由具有橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，分 枝角度為近似90°;分生孢子梗的可育延伸物沒有或者很少產(chǎn)生，沒有不育的菌毛；雖然成 對著生的分枝比較常見，但是分生孢子梗的典型分枝方式為單側(cè)分枝；分生孢子綠色，亞球 形至卵圓形，沒有明顯的脫落痕跡，光滑，成簇著生于分生孢子梗的頂端。
[0020] 1.新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)的制備。
[0021] 收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的以上所述新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入適量蒸餾水重 懸，100-120°C滅菌30-60min。待自然冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌 水溶性提取物。
[0022] 2.新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)對新疆紫草毛狀根生長和紫草素 生物合成的影響。
[0023] 在新疆紫草毛狀根懸浮培養(yǎng)第16-24天，添加總糖濃度為50-400 mg/L的新疆紫 草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物WAE，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12-30天，毛狀根生物量提高了 12%-55%， 紫草素的含量提高了 15-40倍，乙酰紫草素的含量提高了 4-14倍。新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲 水溶性提取物菌絲WAE能夠有效地提高新疆紫草毛狀根的生物量，促進紫草素類成分的生 物合成。
[0024] 實施例1內(nèi)生深綠木霉菌AE9的發(fā)酵 將新疆紫草內(nèi)生真菌AE9接種至1/2B5固體培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)3-5天；然后采用打孔 器打孔的方式將固體培養(yǎng)基上的D16菌絲接種至250ml三角瓶（內(nèi)含100ml1/2B5培養(yǎng)液） 中，26°C、180rpm培養(yǎng)3-5天即得培養(yǎng)種子液；最后將培養(yǎng)種子液接種至5L三角瓶（內(nèi)含4L 1/2B5培養(yǎng)液）中，26°C、160rpm培養(yǎng)10天。
[0025] 實施例2新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)的制備 收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的新疆紫草內(nèi)生真菌AE9菌絲體，加入適量蒸餾水重懸，高壓鍋 110°C滅菌30-60min。待自然冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌水溶性 提取物。采用硫酸-苯酚法測定總糖濃度。
[0026] 實施例3新疆紫草毛狀根的擴繁和生產(chǎn) 1.毛狀根擴繁 將2~4cm的毛狀根接種在裝有50mLSH培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，蔗糖30g/L， 肌醇1g/L，水解酪蛋白0.5g/L。培養(yǎng)液pH5. 8,在20~25°C，搖床速度（100-4-10) r/min，暗培養(yǎng)條件下進行振蕩培養(yǎng)15d收獲，備用。
[0027] 2.毛狀根生產(chǎn)階段 將1培養(yǎng)的毛狀根接種在裝有100mLM-9培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，接種量2g/ 瓶，培養(yǎng)基口!15.8，蔗糖30 8/1。在20-251：、搖床轉(zhuǎn)速為（100+10)1'/1^11下暗培養(yǎng)。 培養(yǎng)25d收獲，滅菌吸水紙吸干其表面水分，稱重，計算毛狀根增殖倍數(shù)。
[0028] 實施例4新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物（WAE)對新疆紫草毛狀根生長和 紫草素類成分生物合成的影響 根據(jù)實施例2制備AE9菌絲WAE溶液。按硫酸-苯酚法測定的總糖濃度后，添加一定 體積的WAE溶液配制成總糖濃度為75、150、300mg/L的1/2B5誘導(dǎo)培養(yǎng)液，110°C滅菌30 分鐘后自然冷卻待用。將正常培養(yǎng)21天的新疆紫草毛狀根的培養(yǎng)液更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼 續(xù)培養(yǎng)18天后收獲。新疆紫草毛狀根干重和2種紫草素含量見表1。從表中數(shù)據(jù)可以看 出，不同濃度的WAE均能顯著性地提高新疆紫草毛狀根的生物量；誘導(dǎo)濃度為300mg/L時 效果最好，毛狀根的生物量提高了 55%。同時不同濃度的WAE也均能顯著性地提高新疆紫草 毛狀根中紫草素類成分的含量：紫草素的含量提高了 15-40倍，乙酰紫草素的含量提高了 4-14倍。內(nèi)生真菌AE9菌絲WAE能夠有效地提高新疆紫草毛狀根的生物量，促進紫草素類 成分的生物合成。
[0029] 表1 新疆紫草內(nèi)生真菌AE9菌絲水提取物對新疆紫草毛狀根生長和紫草素合 成的影響（X土SD，n=10)
【主權(quán)項】
1. 一種新疆紫草內(nèi)生真菌，其特征在于，所述的新疆紫草內(nèi)生真菌的保藏編號為CGMCC No. 4712〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新疆紫草內(nèi)生真菌在促進新疆紫草毛狀根生長和提高新疆 紫草毛狀根中紫草素類成分含量中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫 草素。
4. 一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物，其特征在于，所述的菌絲水溶性提取物 的制備方法為：收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的權(quán)利要求1所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入 蒸餾水重懸，100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真 菌菌絲水溶性提取物。
5. -種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 收集發(fā)酵培養(yǎng)10-13天的權(quán)利要求1所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲體，加入蒸餾水重懸， 100-120°C滅菌30-60min，冷卻，減壓抽濾后得到的濾液，即為新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶 性提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物在促進新疆紫草毛狀 根生長和提高新疆紫草毛狀根中紫草素類成分含量中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草素類成分為紫草素或乙酰紫 草素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新疆紫草內(nèi)生真菌及其應(yīng)用，所述的新疆紫草內(nèi)生真菌的保藏編號為CGMCC No.4712。本發(fā)明還提供一種新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲水溶性提取物及其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種新疆紫草內(nèi)生真菌，并從新疆紫草內(nèi)生真菌菌絲中制備了水溶性提取物（WAE），發(fā)現(xiàn)WAE能有效促進新疆紫草毛狀根生長，同時能顯著性地提高毛狀根中紫草素類成分的含量。CGMCC No. 471220110327
【IPC分類】A01N63-04, A01P21-00, C12N1-14, C12R1-645, A01G7-06
【公開號】CN104745482
【申請?zhí)枴緾N201410461671
【發(fā)明人】韓婷, 秦路平, 賈曉光, 鄭承劍, 賈敏
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2014年9月12日