一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為青霉屬（Penicillium sp.），已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.11913。將臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌I接種于臺(tái)灣相思土培苗，通過(guò)對(duì)植株苗高、生物量的測(cè)定，得出接種該菌株在低磷環(huán)境下的處理植株的苗高、生物量均基本較大程度高于對(duì)照，表明其在低磷環(huán)境下對(duì)促進(jìn)植株生物量增長(zhǎng)具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生真菌能在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思植株生物量生長(zhǎng)。CGMCC No. 1191320160127
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-株在低磯環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量増長(zhǎng)的內(nèi)生真菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株在低憐環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分 離出第一株內(nèi)生菌。但真正開(kāi)始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是 在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開(kāi)展研究。 植物內(nèi)生真菌的分布廣、種類(lèi)多，前人研究表明從絕大多數(shù)植物體內(nèi)都能分離得到內(nèi) 生真菌，由此可見(jiàn)內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多種 的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可W 分為：固氮菌、固鐘菌、固憐菌等植物促生菌、具有抗病蟲(chóng)害的生防菌和具有促進(jìn)植物對(duì)不 良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。 有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思生長(zhǎng)的影響研究還存在空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一株在低憐環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌， 該真菌為青霉屬(戶(hù)6打如別知?巧7.)，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中屯、登記保藏，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC No. 11913。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 該菌的分離、純化包括： A、 材料:將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成Ξ個(gè)部分，用自來(lái)水清洗干凈，分裝到 自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s 一無(wú)菌水沖洗3-4次一 15%的次氯酸鋼漂洗(根lOmin，莖5min， 葉2min)^無(wú)菌水沖洗4-5次。當(dāng)樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上 劃線(xiàn)作為對(duì)照，W檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒 不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法； C、 接種部位的選擇:葉片：葉尖部、葉中部和葉基部3個(gè)處理;枝莖:上中下分為3部位， 其中第3部位為枝莖交接處;根部:分為根尖和根基2個(gè)部分； D、 接種:將消毒后的外植體用接種刀切開(kāi)，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28Γ恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)5-7天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化； 生長(zhǎng)緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直到其生長(zhǎng)穩(wěn)定后純化； 固體培養(yǎng):使用改良馬下固體培養(yǎng)基，配方為蛋白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 . Og/L、憐酸氨二鐘1. Og/L、硫酸儀0.5g/L、瓊脂14. Og/L、其它為無(wú)菌水，pH值6.4± 0.2，培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為4她； E、 將分離繁殖出的不同種類(lèi)的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)2-3次點(diǎn)接純 化、轉(zhuǎn)接后分別得到單一菌種的上述的s/7.功能菌株； 上述的一種在低憐環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方法， 是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28Γ，培養(yǎng)時(shí)間48~72h，利用 血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106c化/ml即為成品備用;液 體培養(yǎng)基:為改良馬下培養(yǎng)基，其中蛋白腺5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、憐 酸氨二鐘1. Og/L、硫酸儀0.5g/L、其它為無(wú)菌水、pH值6.4 ± 0.2。 上述的一種在低憐環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法， 是應(yīng)用該菌株的菌液誘施于臺(tái)灣相思苗木根際±壤或苗木直接接種。 上述的一種在低憐環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法， 是用5.5 X 106c化/ml菌液，按每株100ml在林地誘于每株臺(tái)灣相思的根際。 本發(fā)明設(shè)及的菌株是從臺(tái)灣相思植株中分離純化得到的，經(jīng)接種于臺(tái)灣相思±培苗， 根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其在低憐環(huán)境下對(duì)植株生長(zhǎng)具有促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量 增長(zhǎng)的作用，尋找到對(duì)促進(jìn)植株在低憐環(huán)境下生物量增長(zhǎng)的有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于 生產(chǎn)。
[0004] 通過(guò)菌液誘施的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗，并在接種15天后進(jìn)行低憐脅迫試驗(yàn)， 在脅迫Od時(shí)測(cè)定其苗高，脅迫90d時(shí)測(cè)定其苗高及其生物量。根據(jù)測(cè)得的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng) 判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)植株生長(zhǎng)具有緩解低憐脅迫的作用，尋找到對(duì)促進(jìn)植株生物量有益的 功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)植株苗高和生物量的測(cè)定，得出接種該菌株的處理的 苗高增長(zhǎng)率和生物量均基本較大程度高于對(duì)照，表明其在低憐環(huán)境下對(duì)促進(jìn)植株生物量增 長(zhǎng)具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生真菌能在低憐環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思植株生 物量生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0005] 圖1為不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗苗高的影響； 圖2為不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗生物量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0006] -、根際±壤誘施與苗木直接接種應(yīng)用 本試驗(yàn)采用±培盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)所用材料為福建省潭州市市林業(yè)局提供的臺(tái)灣相思一 年生苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的臺(tái)灣相思苗木定植于直徑15cm，高10cm的塑料盆中。所用±壤是嚴(yán) 格經(jīng)過(guò)熏蒸消毒的黃屯、±。經(jīng)過(guò)混勻稱(chēng)量，每盆放入等量的31^±壤。經(jīng)過(guò)一個(gè)月的恢復(fù)性 生長(zhǎng)后，連續(xù)Ξ天于臺(tái)灣相思根際施入濃度為5.5 X 106c化/ml的lOOmL菌液，用蒸饋水溶液 作為空白對(duì)照。
[0007] 菌液制備:將供試菌株接入40mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬下培養(yǎng)基，其中蛋 白腺5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、憐酸氨二鐘1.Og/L、硫酸儀0.5g/L、其它 為無(wú)菌水、pH值6.4±0.2,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)7化的培養(yǎng)。用無(wú)菌生理鹽水按十倍稀 釋法將菌液稀釋?zhuān)醚蛴?jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度配制成5.5 X 106c化
[000引二、低憐脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì) 盆栽試驗(yàn)±壤的基質(zhì)為黃屯、±。經(jīng)測(cè)定該±壤中各養(yǎng)分物質(zhì)見(jiàn)表1。接種15天后進(jìn)行低 憐脅迫試驗(yàn)處理，運(yùn)段時(shí)間主要是讓接種菌株侵入植株。
[0009] 表1基質(zhì)±壤養(yǎng)分情況 單位:mg/g
本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了 4個(gè)憐處理水平，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)(表2 )。憐肥采用K也P〇4，定期施氮肥、 鐘肥及其他微量元素，直至收獲。低憐脅迫于2015年5月4日進(jìn)行。根據(jù)天氣狀況及時(shí)為臺(tái)灣 相思苗補(bǔ)充水分。
[0010] 表2低憐脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單位:mg/kg
在脅迫0加寸、90加寸測(cè)定植株的苗高，90d后測(cè)定其生物量。檢測(cè)方法如下： (1) 苗高的測(cè)定 鋼尺測(cè)定苗高 (2) 生物量的測(cè)定 將植株的不同部位分別放入信封中并標(biāo)上記號(hào)，放入烘箱105°C烘干半小時(shí)(純化酶）， 在60°C下烘干，經(jīng)過(guò)1化后，稱(chēng)重后再放入烘箱中，重復(fù)測(cè)定直至恒重為止。稱(chēng)得樣品的重量 (W)，即為樣品干重，W此表示植株的生物量，精確到O.Olg。
[0011] (3)數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理與作圖采用Excel2003,數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0。
[0012] Ξ、結(jié)果與分析 (1)不同低憐脅迫下不同處理對(duì)臺(tái)灣相思苗高的影響 四個(gè)不同低憐脅迫條件分別為:重度脅迫、中度脅迫、輕度脅迫、正常條件。如圖1所示， 在四個(gè)不同低憐脅迫程度下，接種菌株I的幼苗的苗高增長(zhǎng)率分別比對(duì)照大113.48%、 130.17%、73.11%、40.24%，由此可知，菌株I有利于促進(jìn)植株苗高的增長(zhǎng)。
[0013] (2)不同低憐脅迫下不同處理對(duì)臺(tái)灣相思生物量的影響 生物量是反映苗木生產(chǎn)力水平的重要指標(biāo)，它與苗木的生長(zhǎng)發(fā)育存在著非常密切的關(guān) 系。如圖2所示，在四個(gè)不同低憐脅迫程度下，接種菌株I的幼苗的生物量分別比對(duì)照大 92.60%、103.20%、10.38%、12.82%，由此可得，菌株I有利于促進(jìn)植株生物量的生長(zhǎng)。
[0014] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株在低憐環(huán)境下能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌，將該株 臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌菌株采用誘根的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗。通過(guò)對(duì)植株的苗高、生物量 的測(cè)定，得出接種該菌株的處理的苗高、生物量增長(zhǎng)均較大程度高于對(duì)照，表明其對(duì)于促進(jìn) 植株生物量的增長(zhǎng)具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生真菌在低憐環(huán)境下能促進(jìn) 臺(tái)灣相思生物量的增長(zhǎng)。
[0015] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌，其特征在于：該真菌為青 霉屬(PaoiciDiuffi S/7.)，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心登記保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 11913。2. -種如權(quán)利要求1所述的一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思生物量增長(zhǎng)的內(nèi)生真菌的 應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，將所述的青霉屬(s/7.)菌 株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì) 算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0 X 106cfu/ml，備用;液體培養(yǎng)基:為改良馬丁 培養(yǎng)基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀1. Og/L、硫酸 鎂0.5g/L、其它為無(wú)菌水、pH值6.4 ± 0.2。3. -種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于:所述應(yīng)用菌液用于臺(tái)灣相思 苗木根際土壤澆施或苗木直接接種。
【文檔編號(hào)】C12R1/80GK106010984SQ201610454595
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】謝安強(qiáng), 陳燦, 林晗, 吳承禎, 洪滔, 周艷芬
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)