一種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌，所述混合內生真菌由臺灣相思內生真菌木霉屬（Trichoderma sp.）A菌株和鐮刀菌屬（Fusarium sp.）E菌株組成，其已于2016年1月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，其中A菌株的保藏號為CGMCC No. 11911，E菌株的保藏號為CGMCC No. 11909。本發(fā)明混合內生真菌中所含菌株是從臺灣相思植株中分離純化得到的，將該混合內生真菌制備成應用菌液，具有促進臺灣相思苗高及地徑增長的作用，從而促進植株生長。CGMCC No. 1190920160127CGMCC No. 1191120160127
【專利說明】
一種能促進臺灣相思苗高及地徑増長的混合內生真菌
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 植物內生菌的研究始于19世紀末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分 離出第一株內生菌。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是 在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。
[0003] 植物內生真菌的分布廣、種類多，前人研究表明，絕大多數(shù)植物體內都能分離得到 內生真菌，由此可見內生真菌普遍存在于植物體內。在全世界范圍內至少在80多個屬290多 種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內生菌。目前從植物中分離的內生菌根據(jù)其具有的獨特功能可 以分為：固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病蟲害的生防菌和具有促進植物對 不良環(huán)境的修復能力的抗性菌。
[0004] 經(jīng)查閱文獻材料，目前有關內生真菌對臺灣相思生長的影響研究還為空白。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌，其 所用菌株是從臺灣相思植株中分離純化得到的，其制成的應用菌液具有促進臺灣相思苗高 及地徑增長的作用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案： 一種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌，其由臺灣相思內生真菌木霉屬 (TYicAoc/erffia Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬（Fusarit/ffi Sj〇.)E菌株組成；所述木霉屬 (rricAoc/e_?a Sj〇.)A菌株和鏡刀菌屬(Ft/sari? Sj〇.)E菌株已于2016年1月27日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏(地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號），其中，A菌株的保藏號為CGMCCNo. 11911，E菌株的保藏號為CGMCCNo. 11909。
[0007] 所用臺灣相思內生真菌的分離、純化過程包括： A、 材料:將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到 自封袋內，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s-無菌水沖洗3-4次-15%的次氯酸鈉漂洗(根10min，莖5min， 葉2min)-無菌水沖洗4-5次;將樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上 劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒 不徹底，需繼續(xù)調整消毒方法； C、 接種部位的選擇:葉片：葉尖部、葉中部和葉基部3個處理;枝莖:上中下分為3部位， 其中第3部位為枝莖交接處;根部:分為根尖和根基2個部分； D、 接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內培 養(yǎng)5-7天后觀察菌落生長狀況;有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進行分離純化;生 長緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩(wěn)定后純化； 固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 · Og/L、磷酸氫二鉀1 · Og/L、硫酸鎂0 · 5g/L、瓊脂14 · Og/L、其它為無菌水，pH值6 · 4土 0.2，培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48h; E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養(yǎng)基進行純化，經(jīng)過2-3次點接純 化、轉接后分別得到單一菌種的上述rricAoc/er?a S/7.和Fusari? S/7.功能菌株。
[0008]所得能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌可制備成應用菌液，用于臺 灣相思苗木的根際土壤澆施與苗木直接接種。
[0009]所述應用菌液的制備方法是分別將木霉屬（7>icAoc/er_ffla S/7. )A菌株和鐮刀菌屬 印.）E菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h， 利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5X10 6cfu/mL，再按體積比 1:1將兩種菌液混合制得;所述液體培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸 出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀1. Og/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4 土 0.2。
[0010]該應用菌液的使用方法是按每株l〇〇mL將所得應用菌液澆施于臺灣相思的根際。
[0011] 本發(fā)明所用菌株是從臺灣相思植株中分離純化得到的，其具有促進臺灣相思苗高 及地徑增長的作用，從而促進植株生長。
[0012] 將該混合內生真菌制備的應用菌液通過澆施的方法接種于臺灣相思幼苗，測定接 種4個月、6個月時臺灣相思的苗高、地徑。結果顯示，臺灣相思內生真菌AE處理的植株與對 照植株的苗高增長率、地徑增長率差異顯著，菌株AE處理的苗高增長率為對照的1.5倍菌株 AE處理的地徑增長率為對照的2.3倍，證明該混合內生真菌AE對臺灣相思苗高、地徑的增長 具有明顯的促進作用。
【具體實施方式】
[0013] -種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌，其由臺灣相思內生真菌木 霉屬（7>icAot/er?a Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬（Fusarit/ffi Sj〇.)E菌株組成；所述木霉屬 (rricAoc/e_?a Sj〇.)A菌株和鏡刀菌屬(Ft/sari? Sj〇.)E菌株已于2016年1月27日在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，其中，A菌株的保藏號為CGMCC No. 11911，E菌株的保藏號為CGMCC No. 11909。
[0014] 所述能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌可制備成應用菌液，用于臺 灣相思苗木的根際土壤澆施與苗木直接接種。
[0015]所述應用菌液的制備方法是分別將木霉屬（7>icAot/er_ffla Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬 印.）E菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h， 利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5X10 6cfu/mL，再按體積比 1:1將兩種菌液混合制得;所述液體培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸 出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4 土 0.2。
[0016] 為了使本發(fā)明所述的內容更加便于理解，下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的 技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0017] 根際土壤澆施與苗木直接接種應用 本試驗采用土培盆栽試驗，試驗所用材料為福建省漳州市市林業(yè)局提供的臺灣相思一 年生苗。選擇長勢一致的臺灣相思苗木定植于直徑15cm、高10cm的塑料盆中。所用土壤是嚴 格經(jīng)過熏蒸消毒的黃心土。經(jīng)過混勻稱量，每盆放入3kg 土壤。經(jīng)過一個月的恢復性生長后， 連續(xù)三天于臺灣相思根際施入100mL濃度為5.5 X 106cfu/mL的菌液AE，另用蒸餾水溶液澆 施作為空白對照CK。
[0018] 菌液制備:將供試菌株分別接入40mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其 中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、磷酸氫二鉀1.Og/L、硫酸鎂0.5g/L、 其它為無菌水、pH值6.4 ± 0.2;在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72h的培養(yǎng)，用無菌生理鹽水按十 倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5 X 106cfu/mL，再按體積比1:1將兩種菌液混合制得。
[0019] 于接種4個月、6個月時，采用鋼尺測定苗高，數(shù)顯游標卡尺測定地徑，結果見表1。
[0020] 表1不同處理對臺灣相思幼苗地徑和苗高的影響
如表1所示，接種菌株AE的幼苗苗高增長率為47.432%，對照僅為26.438%，通過方差分 析可得，菌株AE處理后的臺灣相思幼苗苗高增長率與對照組相比達到極顯著水平（sig= 0.000，顯著水平為0.01)。接種菌株AE的幼苗地徑增長率為35.466%，對照僅為15.190%，與 對照組差異性達到極顯著水平(sig=0.001，顯著水平為0.01)。
[0021] 由此可見，本發(fā)明提供的混合內生真菌能顯著促進臺灣相思苗高及地徑的增長， 從而促進植株生長。
[0022] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 一種能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌，其特征在于:該混合內生真 菌由臺灣相思內生真菌木霉屬（yh'cAoc/ei-ffla Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬(Fusari? Sj〇.)E菌株 組成;所述木霉屬（rricAoc/erffia SjO. )A菌株和鐮刀菌屬(Fusari? SjO. )E菌株已于2016年1 月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，其中，A菌株的保藏號 為CGMCC No. 11911，E菌株的保藏號為CGMCC No. 11909。2. -種如權利要求1所述能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌的應用，其 特征在于:將所述混合內生真菌制備成應用菌液，用于臺灣相思苗木的根際土壤澆施與苗 木直接接種。3. 根據(jù)權利要求2所述能促進臺灣相思苗高及地徑增長的混合內生真菌的應用，其特 征在于：所述應用菌液的制備方法是分別將木霉屬（rricAot/eiwa s/7. )A菌株和鐮刀菌屬 印.）E菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h， 利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5X106cfu/mL，再按體積比 1:1將兩種菌液混合制得； 所述液體培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖 20 · Og/L、磷酸氫二鉀1 · Og/L、硫酸鎂0 · 5g/L、其它為無菌水、pH值6 · 4 ± 0 · 2。
【文檔編號】A01N63/04GK105969672SQ201610452322
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】周艷芬, 林晗, 陳燦, 林宇, 洪滔, 吳承禎
【申請人】福建農(nóng)林大學