一種培養(yǎng)雨生紅球藻的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)雨生紅球藻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝦青素(又稱為蝦紅素）是一種紅色素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于0 -胡蘿卜素。蝦青素 是類胡蘿卜素的一種。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素有重要的生理功能，它的抗氧化能力較強(qiáng)，能更有 效的阻止不飽和脂肪酸過氧化。另外，蝦青素還具有很強(qiáng)的抑制腫瘤生長、增強(qiáng)免疫功能、 抵御紫外線傷害等多種生理功效。因而，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品和化妝品等領(lǐng)域。
[0003]目前，市場上的蝦青素主要有化學(xué)合成品和天然蝦青素兩種。人工合成的蝦青素 與天然蝦青素相比不僅其著色能力和生物效價(jià)低得多（Bowen，etal.，1999)，而且不被允 許應(yīng)用于食品等行業(yè)。天然蝦青素則因?yàn)楦尤菀妆晃詹⑶也簧婕盎瘜W(xué)工藝而更受歡 迎?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的天然蝦青素主要有四種來源：（1)甲殼類動物加工的廢棄物；（2)真菌， 某些真菌可以合成蝦青素，如紅法夫酵母、深紅酵母等。（3)細(xì)菌，乳酸分支桿菌、短桿菌 (Yokoyama&Miki，1995)等細(xì)菌可以合成蝦青素。（4)微藻，雨生紅球藻是目前所知天然蝦 青素含量最高的物種，其積累量約可達(dá)到細(xì)胞干重的2%~4%，甚至更高，被譽(yù)為天然蝦青 素的濃縮品與最佳生物來源。此外，衣藻，綠球藻、小球藻、柵藻等綠藻在不利的環(huán)境條件下 也會積累少量的蝦青素，但其蝦青素含量遠(yuǎn)低于雨生紅球藻的蝦青素含量，一般都在〇. 5% 以下。因此，利用雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素是到目前為止最為高效可行的辦法。
[0004] 目前，利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法多種多樣，例如專利申請CN1181184中 公開，利用復(fù)雜的培養(yǎng)液，在生物反應(yīng)器中擴(kuò)大生長、轉(zhuǎn)化為蝦青素，達(dá)到快速、高效蝦青素 累積的目的；專利申請CN1004536325中公開，利用成套設(shè)備，在氮、磷含量適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液 中，用LED光源控制雨生紅球藻擴(kuò)大生長、并累積蝦青素。目前，阻礙雨生紅球藻大規(guī)模生 產(chǎn)的主要因素是生物污染，以及雨生紅球藻培養(yǎng)過程中種群密度低而導(dǎo)致的單位面積產(chǎn)量 低，從而使生成成本較高。在管道式光生物反應(yīng)器或小型固定化系統(tǒng)組成的生物反應(yīng)器或 其氣升式生物反應(yīng)器中進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻時(shí)，存在的缺陷是管道壁易被藻細(xì)胞遮 蔽導(dǎo)致培養(yǎng)期間透光性下降及清洗困難，雖然已采用不同類型的槳葉輪攪拌混合，但只適 合實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模試驗(yàn)。然而，雨生紅球藻在開放式大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)還是存在特異性雜菌容 易污染，嚴(yán)重影響產(chǎn)品產(chǎn)量與品質(zhì)，制約其應(yīng)用規(guī)模的缺陷。如果收獲的雨生紅球藻細(xì)胞中 大量的藻細(xì)胞被雜菌污染，藻細(xì)胞的天然蝦青素的含量將會急劇下降。特別是，采用大規(guī)模 開放池規(guī)?；a(chǎn)時(shí)，一旦爆發(fā)流行時(shí)甚至造成雨生紅球藻絕收。
[0005]因此，現(xiàn)在急需開發(fā)一種大規(guī)模開放式培養(yǎng)雨生紅球藻，提高天然蝦青素的產(chǎn)量 的方法，解決雨生紅球藻生長緩慢的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的天然蝦青素的產(chǎn)量低，雨生紅球藻生長緩慢的缺 陷，提供一種能夠在開放式培養(yǎng)條件下顯著提高雨生紅球藻中蝦青素含量和雨生紅球藻的 產(chǎn)量的雨生紅球藻的培養(yǎng)方法。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)將雨生紅球藻加入培養(yǎng)液中進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，獲 得含有游動細(xì)胞的雨生紅球藻；再將獲得的含有游動細(xì)胞的雨生紅球藻加入到培養(yǎng)液中進(jìn) 行第二階段培養(yǎng)，使至少部分游動細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍蛹?xì)胞，其中，在步驟（1)和/或步驟（2)中 依次加入抗生素A和抗生素B，或者先在步驟（1)中加入抗生素A，再在步驟（2)中加入抗生 素B，抗生素A和抗生素B不同。采用該方法培養(yǎng)雨生紅球藻能夠提高天然蝦青素的產(chǎn)量。
[0008] 因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)雨生紅球藻的方法，該方法包括 以下步驟：
[0009] (1)在光照開放式培養(yǎng)的條件下，將雨生紅球藻在培養(yǎng)液中進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，獲 得含有游動細(xì)胞的雨生紅球藻；
[0010] (2)在光照開放式培養(yǎng)的條件下，將步驟（1)獲得的含有游動細(xì)胞的雨生紅球藻在 培養(yǎng)液中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，使至少部分游動細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不動細(xì)胞；
[0011] 其中，在步驟（1)和/或步驟（2)中依次加入抗生素A和抗生素B;或者先在步驟 (1) 中加入抗生素A，再在步驟（2)中加入抗生素B，抗生素A和抗生素B不同。
[0012] 采用本發(fā)明方法培養(yǎng)雨生紅球藻，能夠極大提高第一階段培養(yǎng)獲得的雨生紅球藻 中游動細(xì)胞的比例，游動細(xì)胞可達(dá)到50%-90%，能夠極大地提高第二階段培養(yǎng)培養(yǎng)獲得的雨 生紅球藻中不動細(xì)胞的比例，不動細(xì)胞可達(dá)到40%-80%，從而極大地提高雨生紅球藻中蝦青 素的含量和雨生紅球藻的產(chǎn)量，可以使培養(yǎng)后的雨生紅球藻（以干重計(jì)）中蝦青素的含量達(dá) 到1. 2-2. 5重量％，雨生紅球藻細(xì)胞的干重達(dá)到0. 5-1. 5mg/mL。
[0013] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)雨生紅球藻的方法，該方法包括以下步驟：（1)在光照開 放式培養(yǎng)的條件下，將雨生紅球藻在培養(yǎng)液中進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，獲得含有游動細(xì)胞的雨 生紅球藻；（2)在光照開放式培養(yǎng)的條件下，將步驟（1)獲得的含有游動細(xì)胞的雨生紅球藻 在培養(yǎng)液中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，使至少部分游動細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不動細(xì)胞；其中，在步驟（1)和 /或步驟（2)中依次加入抗生素A和抗生素B;或者先在步驟（1)中加入抗生素A，再在步驟 (2) 中加入抗生素B，抗生素A和抗生素B不同。
[0016] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在步驟（1)和/或步驟（2)中依次加入抗生素A 和抗生素B，或者先在步驟（1)中加入抗生素A，再在步驟（2)中加入抗生素B，其實(shí)是四種 技術(shù)方案：只在第一階段培養(yǎng)中依次加入抗生素A和抗生素B;只在第二階段培養(yǎng)中依次加 入抗生素A和抗生素B;在第一階段培養(yǎng)和第二階段培養(yǎng)中都依次加入抗生素A和抗生素 B;在第一階段培養(yǎng)中加入抗生素A，在第二階段培養(yǎng)中加入抗生素B，其中，抗生素A總是在 抗生素B之前加入，且抗生素A和抗生素B不同。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，只要依次加入不同的抗生素A和抗生素B即可實(shí)現(xiàn)本發(fā) 明的目的，但為了更有利于提高蝦青素的產(chǎn)量，優(yōu)選地，先在步驟（1)中加入抗生素A，再在 步驟（2)中加入抗生素B。
[0018] 優(yōu)選地，在每階段的培養(yǎng)中，先向營養(yǎng)液中加入抗生素，再加入雨生紅球藻。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，抗生素A的種類可以為常規(guī)的抗生素，為了進(jìn)一步提高 雨生紅球藻中游動細(xì)胞的比例，并有利于后續(xù)的第二階段培養(yǎng)，進(jìn)而更有利于提高蝦青素 的產(chǎn)量，優(yōu)選地，抗生素A的種類選自氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、青霉素、灰黃 霉素、硫酸慶大霉素和頭孢霉素中的至少一種。
[0020] 更優(yōu)選地，當(dāng)抗生素A為氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、青霉素、灰黃霉 素、硫酸慶大霉素和頭孢霉素的組合時(shí)，更有利于提高雨生紅球藻中游動細(xì)胞的比例，從而 更有利于提高蝦青素的產(chǎn)量。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，抗生素A中每種抗生素的加入量可以為本領(lǐng)域常 規(guī)的用量，例如可以為：相對于lmL的培養(yǎng)液，抗生素A中每種抗生素的用量可以為 0. 025-0. 200mg，優(yōu)選為0. 050-0. 100mg。在步驟（1)中，相對于lmL的正常營養(yǎng)液，初始加 入的雨生紅球藻細(xì)胞可以為0. 05-0. 2mg(以干重計(jì))，初始加入的雨生紅球藻細(xì)胞一般含有 15%-40%的游動細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明中，游動細(xì)胞是指具有明顯鞭毛的藻細(xì)胞。
[0023] 抗生素A中的各組分的含量可以相同也可以不同，為了操作方便，各組分的含量 優(yōu)選相同。
[0024] 在第一階段培養(yǎng)的上述優(yōu)選情況下，能夠進(jìn)一步提高第一階段培養(yǎng)中雨生紅球藻 的數(shù)量和活力，并且能夠進(jìn)一步提高雨生紅球藻中游動細(xì)胞的比例，使得游動細(xì)胞的比例 可達(dá)到50%-90%。
[0025] 在本發(fā)明中藻細(xì)胞的數(shù)量、游動細(xì)胞的數(shù)量和不動細(xì)胞的數(shù)量根據(jù)血球計(jì)數(shù)板來 測量。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，抗生素B的種類可以為常規(guī)的抗生素，為了更有利于提 高蝦青素的積累量，優(yōu)選地，抗生素B的種類選自氯霉素、青霉素、灰黃霉素、青霉素和頭孢 霉素中的至少一種。
[0027] 更優(yōu)選地，當(dāng)抗生素B為氯霉素、青霉素、灰黃霉素、青霉素和頭孢霉素的組合時(shí)， 更有利于提高蝦青素的積累量。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，抗生素B中每種抗生素的加入量可以為本領(lǐng)域常規(guī)的用 量，例如,相對于lmL的培養(yǎng)液，抗生素B中每種抗生素的用量可以為0.010-0. 200mg，優(yōu)選 為0.020-0. 100mg。步驟（2)中，相對于lmL的培養(yǎng)液，加入的步驟（1)獲得的含游動細(xì)胞 的雨生紅球藻細(xì)胞可以為〇.5-2mg(以干重計(jì))。
[0029] 抗生素B中的各組分的含量可以相同也可以不同，為了操作方便，各組分的含量 優(yōu)選相同。
[0030] 在第二階段培養(yǎng)的上述優(yōu)選情況下，能夠進(jìn)一步提高第二階段培養(yǎng)中不動細(xì)胞 的比例，進(jìn)一步提高蝦青素的積累量。使得經(jīng)過第二階段培養(yǎng)的不動細(xì)胞的比例可達(dá)到 60%-80%〇
[0031] 本發(fā)明中，不動細(xì)胞是指失去鞭毛后的藻細(xì)胞，即厚壁孢子細(xì)胞。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，在步驟（1)中，所述光照開放式培養(yǎng)的條件可以為 常規(guī)的用于雨生紅球藻培養(yǎng)的條件，例如，該光照開放式培養(yǎng)的條件可以包括：光照強(qiáng)度為 1000-25001ux，更優(yōu)選為1300-20001ux;培養(yǎng)溫度為18-28°C，更優(yōu)選為20-25°C;培養(yǎng)時(shí)間 為7-20天，更優(yōu)選為10-15天。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，步驟（2)中，所述光照開放式培養(yǎng)的條件可以為常 規(guī)的用于雨生紅球藻培養(yǎng)的條件，例如，該光照開放式培養(yǎng)的條件可以包括：光照強(qiáng)度為 20000-350001ux，更優(yōu)選為 25000-