本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及的一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白突變體，通過(guò)對(duì)天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E結(jié)構(gòu)域氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變而獲得，與免疫球蛋白分子的除互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）之外的其他區(qū)域結(jié)合，并將其制備成用于免疫球蛋白親和層析的層析介質(zhì)，用于免疫球蛋白的分離、純化。

背景技術(shù)：

葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A，SpA）是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。1947年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質(zhì)，在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中，能與正常人血清形成沉淀。Jensen（1959）也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象，將其命名為A抗原。1963年Lofkvist等分離了A抗原，并證明它是一種蛋白質(zhì)，且與糖有區(qū)別。Grov （1960）將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱(chēng)SpA蛋白A （ProteinA）。編碼SpA的基因于1983年被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)。對(duì)SPA結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn)，SpA分子包含A，B，C，D，E五個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有能與IgG自主結(jié)合的能力。在中性pH條件下，蛋白A捕獲免疫球蛋白分子，在低pH條件下將其釋放出來(lái)。因此，以SpA作為配體的親和層析已經(jīng)成為目前分離、純化治療性單克隆抗體重要手段之一。

蛋白A親和層析是治療性單克隆抗體下游純化的第一步，待純化的培養(yǎng)上清中含有大量生物大分子雜質(zhì)，每次或數(shù)次純化循環(huán)后，必須經(jīng)過(guò)在位清洗，否則層析介質(zhì)的性能將顯著下降。為了延長(zhǎng)層析柱的壽命和確保純化質(zhì)量，必須定期對(duì)層析柱進(jìn)行在位清洗（CIP），最理想的CIP條件是使用0.5M的氫氧化鈉溶液，以較低的流速清洗15-20分鐘。但天然或重組的SpA配基對(duì)NaOH非常敏感，強(qiáng)堿性條件下易變性或脫落，如果選用高濃度的鹽酸胍或尿素進(jìn)行清洗，清洗的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如NaOH清洗效果好，而且清洗成本非常高，不適用于單克隆抗體的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

層析介質(zhì)中蛋白A變性及脫落，是由于蛋白A在堿性條件下，天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）發(fā)生脫氨基反應(yīng)，造成肽鏈斷裂。易發(fā)生脫氨基的氨基酸中，天冬酰胺（Asn）比Gln對(duì)堿性條件更敏感。脫氨基反應(yīng)速率最快的是當(dāng)肽鏈中含有天冬酰胺（Asn）與甘氨酸（Gly）結(jié)合或天冬酰胺（Asn）和絲氨酸（Ser）結(jié)合的序列。由于“天冬酰胺-甘氨酸”序列對(duì)于堿性是最敏感的，SpA結(jié)構(gòu)域中E含有“天冬酰胺-甘氨酸”序列（N₂₈-G₂₉），因此推測(cè)其耐堿性最差。目前的耐堿性SpA序列的突變主要集中在B、C結(jié)構(gòu)域，如目前應(yīng)用較廣泛的耐堿性SpA親和介質(zhì)Mabselect SuRe，采用的是SpA結(jié)構(gòu)域B進(jìn)行天冬酰胺的定點(diǎn)突變，將第23位的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸（N23T）。

此外，發(fā)明專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)朇N03806793.5）公開(kāi)了，利用對(duì)SpA的結(jié)構(gòu)域B 序列使用附近突變技術(shù)（“by pass”）進(jìn)行定點(diǎn)突變（N23T，N43E），以提高其耐堿性。發(fā)明專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)?01310097553.9）公開(kāi)了，利用SpA結(jié)構(gòu)域B序列進(jìn)行定點(diǎn)突變（N23T，F(xiàn)30A）以提高其耐堿性。此外，發(fā)明專(zhuān)利（申請(qǐng)?zhí)朇N200780036281.4）公開(kāi)了對(duì)結(jié)構(gòu)域C序列野生型（Cwt）及缺失了“Asn-Lys-Phe-Asn”突變體（Cdel）獲得了與MabselectSure相當(dāng)?shù)哪蛪A性。

在單克隆抗體分離純化過(guò)程中，目前使用的ProteinA介質(zhì)存在著耐堿性差的問(wèn)題。Protein A介質(zhì)經(jīng)過(guò)多次堿性清洗后，動(dòng)態(tài)吸附載量下降、純化效率降低。本發(fā)明通過(guò)對(duì)天然Protein A的E結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定點(diǎn)突變E（N23T，N28D，G29A），該突變體與現(xiàn)有技術(shù)相比，其耐堿性、動(dòng)態(tài)吸附載量及純化效果等均顯著提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及的一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白突變體，其氨基酸序列來(lái)源于天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)其氨基酸序列中“堿敏感”的天冬酰胺進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其突變體較親本分子相比具有更高的耐堿性，且該突變體對(duì)免疫球蛋白的親和力顯著提高。

本發(fā)明所述的一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白突變體，利用天然葡萄球菌蛋白A的E結(jié)構(gòu)域，將其E結(jié)構(gòu)域中部分氨基酸進(jìn)行突變，如N11S，N21A，N23T，N28D，N28A，G29A，N43E，N52A；及突變點(diǎn)的組合突變，如E（N23T，N28D），E（N23T，N28A），E（N23T，N43E），E（N28D，N43E），E（N32T，N28D，G29A）等。經(jīng)過(guò)活性測(cè)試、耐堿性測(cè)試及親和力測(cè)試等大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其中優(yōu)選實(shí)施例為將其第23位天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸，第28位天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，?9位甘氨酸突變?yōu)楸彼幔∟23T，N28D，G29A）。

將優(yōu)選的免疫球蛋白結(jié)合蛋白突變體利用基因工程技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化，獲得具有較高免疫球蛋白親和力、耐堿性強(qiáng)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白分子，將該結(jié)合蛋白分子利用親和層析介質(zhì)制備方法制備成用于免疫球蛋白親和層析的層析介質(zhì)，該層析介質(zhì)與現(xiàn)有市場(chǎng)化的層析介質(zhì)相比，其耐堿性、動(dòng)態(tài)吸附載量機(jī)純化效果均顯著提高。

附圖說(shuō)明

圖1、BL21/pET32a上清液SDS-PAGE電泳圖。

圖2、i Protein A與MabslectSure 性能比較圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、天然SpA的耐堿性突變點(diǎn)選擇

天然SpAD 耐堿性取決于其氨基酸序列，一般認(rèn)為，在堿性條件下，發(fā)生在天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的脫氨基反應(yīng)是造成肽鏈斷裂的重要原因。而且脫氨基反應(yīng)速率最快的是當(dāng)肽鏈中含有天冬酰胺（Asn）與甘氨酸（Gly）結(jié)合或天冬酰胺（Asn）和絲氨酸（Ser）結(jié)合的序列。而SpA與IgG的親和力取決于多肽和蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

SpA不同結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分析見(jiàn)下表1。

表1、SpA不同結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分析

選取含天冬酰胺殘基較少的E結(jié)構(gòu)域作為突變模板，與以往SpA突變常用的“by pass”策略不同，對(duì)E結(jié)構(gòu)域直接進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變目標(biāo)氨基酸首選其他結(jié)構(gòu)域相應(yīng)位點(diǎn)的天然氨基酸（如Ser，Glu），若此位點(diǎn)不含天然氨基酸則選用丙氨酸（Ala）。 對(duì)于此前報(bào)道不適合定點(diǎn)突變的N28，使用與之結(jié)構(gòu)類(lèi)似的天冬氨酸進(jìn)行代替。針對(duì)SpA結(jié)構(gòu)域E的定點(diǎn)突變見(jiàn)下表2。

表2、SpA結(jié)構(gòu)域E的定點(diǎn)突變

實(shí)施例2、含結(jié)構(gòu)域E突變體的制備

（1）含結(jié)構(gòu)域E突變體的載體構(gòu)建

人工合成表1中的各種突變體基因序列。與經(jīng)NcoI及BamHI酶切的載體pET32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（BL21/DE3），篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取，酶切鑒定后證明結(jié)構(gòu)域E突變體基因克隆至pET32a中。

（2）含結(jié)構(gòu)E突變體的菌種構(gòu)建與發(fā)酵

用CaCl₂法將pET32a-P轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 /DE3，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測(cè)和酶切分析獲得含有pET32a的重組轉(zhuǎn)化子（BL21/pET32a）。挑取大腸桿菌工程菌BL21 /pET32a，接種于LB培養(yǎng)基中，接種量1~2%V/V，于30℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日在無(wú)菌條件下將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按l: 10-1: 5接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃發(fā)酵至OD₆₀₀達(dá)到0.4~0.8，升溫至42℃誘導(dǎo)，5小時(shí)后收離心收菌。

取少量細(xì)胞加2X上樣緩沖液，按標(biāo)準(zhǔn)做SDS-PAGE凝膠電泳，圖1顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的BL21/pET32a的碎菌后的上清在20kD的位置出現(xiàn)一條新的蛋白帶（左二），轉(zhuǎn)化PET32空載體的BL21 /DE3菌和經(jīng)誘導(dǎo)的BL21/pET32a碎菌后的沉淀中不出現(xiàn)次帶，證明重組蛋白ProteinA已在BL21/pET32a中誘導(dǎo)表達(dá)。（圖1各泳道分別為：marker，誘導(dǎo)后上清液，誘導(dǎo)前上清液）。

（3）結(jié)構(gòu)域E突變體純化

將上述收集菌體用NaCl十磷酸鹽緩沖液（pH7. 0~8. 0）懸浮，超聲破碎，4 ℃離心，收集上清得粗提液。經(jīng)Ni Sepharose 6FF純化帶有his標(biāo)簽的突變體蛋白。再使用EK酶酶切除去突變體蛋白的His純化標(biāo)簽。

實(shí)驗(yàn)例1、結(jié)構(gòu)域E突變體的結(jié)合活性

為驗(yàn)證定點(diǎn)突變后的SpA結(jié)構(gòu)域E突變體仍具有與人IgG結(jié)合能力。采用表面等離子技術(shù)測(cè)定使用上述突變體與人IgG抗體的結(jié)合活性。利用Biacore 2000（Uppsala, Sweden），將人的多克隆IgG和HAS（陰性參照）偶聯(lián)在CMS傳感器芯片（Biacore）。以10種不同的濃度（100-550nM）在HBS （10 mM HEPES，0. 15M NaCl，3. 4 mM EDTA，0. 005%表面活性劑P20，pH 7. 4）中制備重組蛋白A突變體溶液。以隨機(jī)順序和30 ul/min的流速將樣品注射到表面作為復(fù)制本，使用10 mM的HCl再生表面。利用BIA 3. 0. 2 b軟件分析數(shù)據(jù)。利用蘭格謬爾模型并計(jì)算表觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)和親和性常數(shù)（如表3 所示）。與其他突變體相比，E（N23T，N28D，G29A）與IgG有較高的親和力，E（N23T，N28D，G29A）具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：2 所示的核苷酸序列。

表3、利用Biacore對(duì)SpA結(jié)構(gòu)域E突變體進(jìn)行結(jié)合活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)例2、結(jié)構(gòu)域E突變體耐堿性研究

為了考察不同E結(jié)構(gòu)域突變體的耐堿性，按照下列步驟，制備不同E突變體瓊脂糖凝膠，并填充至親和層析柱中，按照標(biāo)準(zhǔn)的IgG純化程序考察其動(dòng)態(tài)載量變化。結(jié)果（表4）顯示，E（N23T，N28D，G29A）經(jīng)過(guò)7次CIP （7hour）后，其動(dòng)態(tài)載量仍維持在95%，遠(yuǎn)優(yōu)于其他E結(jié)構(gòu)域的突變體。

1、E結(jié)構(gòu)域突變體瓊脂糖凝膠的制備：

1）用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖凝膠在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在30-60℃的溫度下反應(yīng)2-3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水清洗至中性后抽干溶劑

2）將上述產(chǎn)物與本發(fā)明的重組蛋白A在5-25 ℃溫度下反應(yīng)15-20小時(shí)，反應(yīng)烷后清洗再抽干溶劑，即得到重組蛋白A瓊脂糖凝膠

3）將上述裝填至20mL（XK/16/20）10cm高柱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、標(biāo)準(zhǔn)化的IgG純化色譜洗脫程序：

1）結(jié)合液清洗平衡親和層析色譜柱

2）0.2ml/min上樣，樣品為10mg/ml人多克隆IgG，上樣量為20CV（柱體積）

3）結(jié)合緩沖液清洗未結(jié)合的免疫球蛋白，用量為6CV

4）洗脫緩沖液1.0ml/min進(jìn)行洗脫，用量為6 CV

5）結(jié)合緩沖液對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，用量為6 CV

6）使用CIP堿液進(jìn)行在位清洗，柱基質(zhì)與0.5M NaOH之間接觸時(shí)間為30分鐘。

3、所使用的緩沖液：

結(jié)合緩沖液配方：20mMPBS加150mM NaCl（0.92g NaH₂PO₄·2H₂O，5.04g Na₂HPO₄·12H₂O，8.77g NaCl，SuperQ水溶至1L，pH調(diào)至7.0）；

洗脫液配方：檸檬酸3.8g，檸檬酸二鈉0.82g，SuperQ水溶至1L，pH調(diào)至3.0。

CIP溶液：0.5M NaOH。

表4、不同結(jié)構(gòu)域E突變體的堿穩(wěn)定性研究

實(shí)驗(yàn)例3、新型耐堿性親和介質(zhì)（i Protein A）的性能研究

（1）E（N23T，N28D，G29A）四聚體瓊脂糖凝膠（i Protein A）的制備

通過(guò)化學(xué)合成的方法，設(shè)計(jì)合成E（N23T，N28D，G29A）基因的四聚體重復(fù)片段的序列，按實(shí)施例1所述方法，表達(dá)、純化上述E（N23T，N28D，G29A）四聚體蛋白。

按照上述實(shí)施例的制備方法制備E突變體（N23T，N28D，G29A）四聚體的瓊脂糖凝膠。

（2）i Protein A親和介質(zhì)與MabselcetSure親和介質(zhì)的耐堿性比較

為進(jìn)一步考察E（N23T，N28D，G29A）四聚體的耐堿性，使用MabselectSure預(yù)裝柱（5ml）和iProteinA柱（XK165，裝填量5ml），按下述方法進(jìn)行IgG純化，經(jīng)過(guò)不同CIP循環(huán)測(cè)定色譜柱的動(dòng)態(tài)載量。結(jié)果（表5）顯示，i Protein A親和介質(zhì)與市售耐堿性親和介質(zhì)（MabselctSure）相比，具有更好的耐堿穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表5及圖2。

標(biāo)準(zhǔn)化的IgG純化層析色譜洗脫程序：

1）結(jié)合緩沖液平衡層析色譜柱

2）0.2ml/min上樣，樣品為10mg/ml人多克隆IgG，上樣量為20CV（柱體積）

3）結(jié)合緩沖液清洗未結(jié)合蛋白，用量為6 CV

4）洗脫緩沖液1.0ml/min進(jìn)行洗脫，用量為6 CV

5）結(jié)合緩沖液對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，用量為6 CV

6）使用CIP堿液進(jìn)行在位清洗，柱基質(zhì)與0.5M NaOH之間接觸時(shí)間為60min。

表5、i Protein A親和介質(zhì)與MabselctSure親和介質(zhì)的耐堿性比較

（3）i Protein A親和介質(zhì)與MabselcetSure動(dòng)態(tài)載量和純化效果性比較

根據(jù)實(shí)施例4.1中，利用第四十次CIP循環(huán)洗脫的IgG收液計(jì)算iProtein A和MabselctSure的動(dòng)態(tài)載量。同時(shí)，對(duì)兩種介質(zhì)洗脫液中IgG純度和聚體含量使用HPLC方法（TSKgel G3000SW色譜柱）進(jìn)行分析，計(jì)算IgG單體純度和聚體含量。結(jié)果（附表6）表明，iProteinA與MabselctSure相比，具有更好的動(dòng)態(tài)載量和純化效果。

此外，專(zhuān)利CN10152278(A)記載，結(jié)構(gòu)域C序列野生型（Cwt）及缺失了“Asn-Lys-Phe-Asn”突變體（Cdel），僅僅獲得與MabselectSure相當(dāng)?shù)哪蛪A性，且多次CIP后其動(dòng)態(tài)載量低于MabselectSure。因此，本發(fā)明公開(kāi)的i Protein A耐堿性及純化效果同樣優(yōu)于Cwt與Cdel。

表6、i Protein A親和介質(zhì)與MabselectSure純化效果性比較

SEQUENCE LISTING

<110> 上海張江生物技術(shù)有限公司

<120> 一種免疫球蛋白結(jié)合蛋白突變體及其用途

<130> 20150506

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Thr Ala Asp Gln Arg Asp Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacgcggcgc agcatgatga agcgcagcag aacgcgtttt atcaggtgct gaacatgccg 60

aacctgaccg cggatcagcg cgatgccttt attcagagcc tgaaagatga tccgagccag 120

agcgcgaacg tgctgggcga agcgcagaaa ctgaacgata gccaggcgcc gaaa 174