本發(fā)明涉及通過(guò)主動(dòng)穿透細(xì)胞膜將完整免疫球蛋白形式的抗體定位在細(xì)胞質(zhì)中的方法。

本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)完整免疫球蛋白形式的抗體通過(guò)穿透細(xì)胞膜定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)并涉及包含所述輕鏈可變區(qū)的抗體。

本發(fā)明還涉及與所述抗體融合且選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

本發(fā)明還涉及用于預(yù)防、治療或診斷癌癥的組合物，其包含：所述抗體；或與所述抗體融合且選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

本發(fā)明還涉及編碼所述輕鏈可變區(qū)和所述抗體的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生通過(guò)穿透細(xì)胞定位在細(xì)胞溶膠中的抗體的方法，所述方法包括以下步驟：用能夠通過(guò)穿透細(xì)胞定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)替換抗體的輕鏈可變區(qū)。

背景技術(shù)：

完整免疫球蛋白形式的抗體具有高度穩(wěn)定的y形結(jié)構(gòu)(分子量：150kda)，其由兩條重鏈(50kda)蛋白和兩條輕鏈(25kda)蛋白組成。抗體輕鏈和重鏈分為可變區(qū)(其氨基酸序列在抗體間不同)和恒定區(qū)(其氨基酸序列在抗體間相同)。重鏈恒定區(qū)包括ch1、鉸鏈、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域且輕鏈恒定區(qū)包含cκ或cλ結(jié)構(gòu)域。

抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)具有氨基酸序列在抗體間特別不同的部分且這些部分構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn)且因此也稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)”。當(dāng)檢查抗體的三維結(jié)構(gòu)時(shí)，這些cdr形成抗體表面的環(huán)。環(huán)以下存在結(jié)構(gòu)上支持環(huán)的框架區(qū)。在重鏈和輕鏈中，分別存在三個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)且這六個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)彼此組合且與抗原直接接觸?？贵w的重鏈恒定區(qū)(fc)通過(guò)其與fcrn(新生fc受體)的結(jié)合保證在血液中的長(zhǎng)半衰期且由于該特征，與小分子藥物不同的是，抗體在機(jī)體中可為持久的。另外，抗體與fcγr(fcγ受體)等的結(jié)合使其可能特異性地通過(guò)抗體依賴(lài)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)靶物質(zhì)的細(xì)胞的死亡。近來(lái)出于治療多種疾病的目的已開(kāi)發(fā)的許多產(chǎn)品可通過(guò)多種人源化的方法展現(xiàn)改善的治療效果，如使用人抗體fr(框架)的cdr移植方法從而克服免疫原性。

常規(guī)的抗體由于其大尺寸和親水性而不能直接穿透活細(xì)胞。因此，最常規(guī)的抗體特異性靶向細(xì)胞外分泌蛋白或細(xì)胞膜蛋白(kimsj等人,2005)。一般的抗體和大分子生物藥物具有的局限在于其不能穿過(guò)疏水細(xì)胞膜且因此不能結(jié)合且抑制多種疾病相關(guān)物質(zhì)。一般而言，在用于與機(jī)制如細(xì)胞生長(zhǎng)、特異性抑制等有關(guān)的研究的實(shí)驗(yàn)中使用的特異性地與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合的商業(yè)抗體不能直接用于處理活細(xì)胞且為使這些抗體結(jié)合細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，通過(guò)細(xì)胞膜滲透方法使用兩親糖苷皂苷的在細(xì)胞膜中形成孔的預(yù)處理過(guò)程是必須的。小分子物質(zhì)、核酸或納米粒等可通過(guò)使用多種試劑或方法如電穿孔或熱激轉(zhuǎn)運(yùn)到活細(xì)胞中，但由于上述的大多試劑和實(shí)驗(yàn)條件負(fù)面影響蛋白或抗體的特征三維結(jié)構(gòu)，蛋白或抗體可喪失其活性。已開(kāi)發(fā)出特異性地與細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合且抑制其活性的細(xì)胞內(nèi)抗體(胞內(nèi)抗體)，但這些抗體還不具有穿透活細(xì)胞的膜的能力且因此僅可應(yīng)用于基因療法且其在未來(lái)的應(yīng)用性非常有限(manikandanj等人,2007)。

與多種類(lèi)型的抗體片段包括上述完整免疫球蛋白形式的抗體、大分子物質(zhì)如重組蛋白等不同的是，小分子物質(zhì)由于其小尺寸和疏水性質(zhì)容易且有效地穿透活細(xì)胞。然而，為使小分子藥物與多種細(xì)胞中的疾病相關(guān)物質(zhì)特異性結(jié)合，需要靶物質(zhì)的表面具有疏水口袋。具有該疏水口袋的靶物質(zhì)僅形成細(xì)胞中總的疾病相關(guān)物質(zhì)的約10％且由于該原因，小分子藥物不能特異性地靶向大多細(xì)胞中的致病性蛋白(imaik等人,2006)。

在多種疾病包括癌癥中，存在在細(xì)胞中的蛋白-蛋白相互作用(ppi)中起重要作用的蛋白或與轉(zhuǎn)錄或信號(hào)相關(guān)的多種蛋白的突變和異常過(guò)表達(dá)。這樣的蛋白中，通過(guò)其大和平的表面顯示復(fù)雜的相互作用的與疾病特別相關(guān)的物質(zhì)難以特異性地通過(guò)上述小分子藥物抑制(blundell等人,2006)。例如ras，其為細(xì)胞質(zhì)重要的腫瘤相關(guān)因子之一(目前尚不存在治療劑)，作為通過(guò)細(xì)胞膜受體傳輸細(xì)胞外信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的分子開(kāi)關(guān)發(fā)揮作用。在約30％的人類(lèi)癌癥特別是結(jié)腸直腸癌和胰腺癌中，ras在細(xì)胞中總是由于癌癥相關(guān)突變活化且這樣的致癌相關(guān)突變已知為賦予常規(guī)抗癌療法強(qiáng)抗性的主要腫瘤相關(guān)因子(scheffzekk等人,1997)。

在克服目前的技術(shù)限制的嘗試中，已實(shí)施多項(xiàng)研究以為可有效抑制蛋白-蛋白相互作用的抗體片段或大分子物質(zhì)賦予細(xì)胞穿透能力。發(fā)現(xiàn)了具有堿性氨基酸序列和疏水或兩親性質(zhì)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ptd)具有穿透活細(xì)胞的能力(leenan等人,2007)。另外，已作出許多嘗試以使蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與多種類(lèi)型的抗體片段通過(guò)遺傳工程化方法融合從而識(shí)別特異性細(xì)胞內(nèi)蛋白。然而，大多融合蛋白不從動(dòng)物細(xì)胞分泌且僅以非常小的量釋放到上清中(nakajimao等人,2004)且具有富集精氨酸的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白具有的問(wèn)題是其在產(chǎn)生過(guò)程中弱抵抗宿主弗林蛋白酶(chauhana等人,2007)。另外，存在的問(wèn)題是融合蛋白的細(xì)胞穿透效率低，使得難以將這些融合蛋白開(kāi)發(fā)成為治療性抗體(falnesp等人,2001)。在克服表達(dá)相關(guān)問(wèn)題的嘗試中，已實(shí)施了研究以在蛋白純化后通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵或生物素-鏈霉親和素鍵融合細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域，但這些方法導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)變形。

另外，使用一些自身抗體實(shí)施的研究報(bào)道了抗體和短鏈可變區(qū)(scfv)抗體片段可通過(guò)胞吞作用穿透進(jìn)入細(xì)胞。自身抗體是在具有自身免疫疾病的人和小鼠中發(fā)現(xiàn)的抗dna抗體且這些抗體中的一些具有穿透活細(xì)胞的特征(michaelr等人,1995；michaelp等人,1996；jeskezackd等人,1996)。至今報(bào)道的穿透細(xì)胞的自身抗體在其引入細(xì)胞后大多定位于核且已積極實(shí)施了研究以將這些穿透細(xì)胞的自身抗體與在核中顯示效應(yīng)的特定蛋白融合(weisbart等人,2012)。然而，蛋白通過(guò)使用自身抗體穿透進(jìn)入活細(xì)胞具有的局限是蛋白最終定位于核且因此不能特異性地與胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中的多種疾病相關(guān)物質(zhì)結(jié)合且抑制其活性。

天然存在的大分子物質(zhì)中，具有穿透細(xì)胞的性質(zhì)的典型物質(zhì)包括病毒(hiv、hsv)、毒素(霍亂毒素、白喉毒素)等。已知這些物質(zhì)通過(guò)為細(xì)胞內(nèi)活躍的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的胞吞作用穿透細(xì)胞。該胞吞作用主要分為三種途徑：通過(guò)由配體結(jié)合參與受體內(nèi)化的網(wǎng)格蛋白的胞吞作用；在一些毒素如霍亂毒素中發(fā)現(xiàn)的通過(guò)胞膜窖的胞吞作用；和在葡聚糖、埃博拉病毒等中發(fā)現(xiàn)的巨吞飲。其中網(wǎng)格蛋白和胞膜窖參與的胞吞作用主要始于當(dāng)分布在細(xì)胞膜上的受體與特異性配體結(jié)合時(shí)。網(wǎng)格蛋白定位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面。當(dāng)物質(zhì)與受體結(jié)合時(shí)，網(wǎng)格蛋白使得纖維殼形成囊泡，其運(yùn)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞。胞膜窖通過(guò)小窩蛋白-1的作用形成低聚體同時(shí)形成運(yùn)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的穩(wěn)定囊泡(小窩體)。在巨吞飲中，細(xì)胞膜的一部分突出以圍繞物質(zhì)由此形成運(yùn)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的大染色體(gerber等人,2013)。其它內(nèi)體逃逸機(jī)制不存在時(shí)，通過(guò)這樣的胞吞作用通路穿透細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)大多通過(guò)溶酶體通路降解。

為了避免通過(guò)溶酶體通路的降解，病毒、毒素等具有的機(jī)制是通過(guò)該機(jī)制其從內(nèi)體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。盡管內(nèi)體逃逸機(jī)制尚不清楚，至今已知三種內(nèi)體逃逸機(jī)制的假設(shè)。第一種假設(shè)的機(jī)制是通過(guò)該機(jī)制形成內(nèi)體膜中發(fā)現(xiàn)的孔。在該假設(shè)中，內(nèi)體膜中的物質(zhì)如陽(yáng)離子兩親肽與帶負(fù)電荷的細(xì)胞脂質(zhì)雙層結(jié)合以引起內(nèi)部壓力或內(nèi)膜收縮由此形成桶形孔或環(huán)形通道(jenssen等人,2006)。第二種假設(shè)的機(jī)制是通過(guò)該機(jī)制內(nèi)體破裂成為質(zhì)子海綿效應(yīng)的結(jié)果。在該假設(shè)中，由于具有質(zhì)子化氨基的物質(zhì)的高緩沖效應(yīng)，內(nèi)體的滲透壓可增加從而內(nèi)體膜可降解(lin和engbersen,2008)。在第三種假設(shè)中，特定的基序(其在中性環(huán)境中維持親水線(xiàn)圈形狀但在酸性環(huán)境如內(nèi)體中變?yōu)槭杷菪Y(jié)構(gòu))通過(guò)與內(nèi)體的膜融合從內(nèi)體逃逸(horth等人,1991)。然而，基于上述假設(shè)所實(shí)施的證明多種天然存在的物質(zhì)的內(nèi)體逃逸機(jī)制的研究仍不充分。

因此，本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)出人源化輕鏈可變(vl)單結(jié)構(gòu)域，其穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中。另外，為了構(gòu)建穩(wěn)定的完整免疫球蛋白形式的抗體，本發(fā)明的發(fā)明人改進(jìn)了具有細(xì)胞質(zhì)穿透能力的輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域(vl)抗體片段從而容易與多種人重鏈可變區(qū)(vh)相互作用并結(jié)合，同時(shí)維持其穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的能力由此開(kāi)發(fā)出穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的完整免疫球蛋白形式的抗體(cytotransmab)。

另外，本發(fā)明的發(fā)明人篩選了重鏈可變區(qū)(vh)文庫(kù)以選擇具有與活化的ras特異性結(jié)合的能力的重鏈可變區(qū)(vh)并以所選擇的重鏈可變區(qū)(vh)替換了完整免疫球蛋白形式的抗體的重鏈可變區(qū)(vh)，其穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中由此構(gòu)建了穿透活細(xì)胞且與細(xì)胞質(zhì)中的活化ras特異性結(jié)合的完整免疫球蛋白形式的抗ras細(xì)胞質(zhì)穿透抗體(imab(內(nèi)化和干擾單克隆抗體))由此抑制細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)。

另外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了穿透細(xì)胞質(zhì)的抗ras單克隆抗體穿透多種ras依賴(lài)性癌細(xì)胞系且通過(guò)特異性地中和細(xì)胞質(zhì)中的ras抑制細(xì)胞生長(zhǎng)且發(fā)現(xiàn)了即使當(dāng)抗體與肽融合用于賦予腫瘤組織特異性時(shí)，其在ras依賴(lài)的腫瘤中展現(xiàn)特異性抑制活化的ras的活性而不負(fù)面影響穿透細(xì)胞質(zhì)和中和活化的ras的能力由此完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

因此，本發(fā)明的目的是提供在通過(guò)胞吞過(guò)程主動(dòng)滲透活動(dòng)物細(xì)胞的膜后通過(guò)內(nèi)體逃逸機(jī)制將完整免疫球蛋白形式的抗體定位在細(xì)胞溶膠中的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供輕鏈可變區(qū)(vl)和包含所述輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)誘導(dǎo)完整免疫球蛋白形式的抗體在通過(guò)胞吞過(guò)程主動(dòng)滲透活動(dòng)物細(xì)胞的膜后通過(guò)內(nèi)體逃逸機(jī)制定位在細(xì)胞溶膠中。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與所述抗體融合且選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防、治療或診斷癌癥的組合物，其包含：所述抗體；或與所述抗體融合且選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼所述輕鏈可變區(qū)和所述抗體的多核苷酸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的抗體的方法，所述方法包括以下步驟：用能夠主動(dòng)穿透活細(xì)胞且通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)體逃逸機(jī)制定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)替換抗體的輕鏈可變區(qū)。

技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供通過(guò)穿透細(xì)胞膜將完整免疫球蛋白形式的抗體定位在細(xì)胞溶膠中的方法，其中所述抗體包含能夠穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)(vl)。

以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

根據(jù)本發(fā)明的上述方法，完整免疫球蛋白形式的抗體可通過(guò)能夠誘導(dǎo)完整免疫球蛋白形式的抗體通過(guò)胞吞作用穿透活細(xì)胞的膜且通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)體逃逸機(jī)制定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)(vl)穿透活細(xì)胞的膜且定位在細(xì)胞溶膠中。

具體地，本發(fā)明的抗體為完整免疫球蛋白形式的抗體，其展現(xiàn)出穿透活細(xì)胞的膜的能力和定位在細(xì)胞溶膠中的能力且與所述抗體的部分片段對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)展現(xiàn)出穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的能力。

圖1示意性地顯示了本發(fā)明的抗體或抗體輕鏈可變區(qū)的細(xì)胞內(nèi)活性。

所述抗體可為嵌合、人或人源化抗體。

所述抗體可為igg、igm、iga、igd或ige。例如，所述抗體可為igg1、igg2、igg3、igg4、igm、ige、iga1、iga5或igd且最優(yōu)選可為igg型單克隆抗體。

在本發(fā)明中，完整免疫球蛋白形式的抗體所具有的結(jié)構(gòu)擁有兩條全長(zhǎng)輕鏈和兩條全長(zhǎng)重鏈且每條輕鏈通過(guò)二硫鍵(ss-鍵)與每條重鏈連接。抗體的恒定區(qū)分為重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)且重鏈恒定區(qū)具有γ、μ、α、δ和ε型及γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2亞類(lèi)。輕鏈恒定區(qū)具有κ和λ型。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“重鏈”可被理解為包括含有可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vh和三個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3的全長(zhǎng)重鏈及其片段，所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vh所包含的氨基酸序列具有足以賦予抗原特異性的可變區(qū)序列。另外，本文使用的術(shù)語(yǔ)“輕鏈”可被理解為包括含有可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vl和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域cl的全長(zhǎng)輕鏈及其片段，所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vl所包含的氨基酸序列具有足以賦予抗原特異性的可變區(qū)序列。

穿透細(xì)胞溶膠的能力可為通過(guò)胞吞作用主動(dòng)穿透活細(xì)胞且然后通過(guò)內(nèi)體逃逸定位在細(xì)胞溶膠中的能力。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，能夠穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)可包含：

含有選自以下的氨基酸序列的cdr1或與所述cdr1具有至少90％同源性的序列：seqidno:4、7和10；和

含有選自以下的氨基酸序列的cdr3或與所述cdr3具有至少90％同源性的序列：seqidno:6、9和12。

關(guān)于所述cdr1、cdr2和cdr3的序列的信息如下。

更具體地，輕鏈可變區(qū)可進(jìn)一步包含含有選自以下的氨基酸序列的cdr2或與所述cdr2具有至少90％同源性的序列：seqidno:5、8和11。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可包含seqidno:4的cdr1、seqidno:5的cdr2和seqidno:6的cdr3。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可包含seqidno:7的cdr1、seqidno:8的cdr2和seqidno:9的cdr3。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可包含seqidno:10的cdr1、seqidno:11的cdr2和seqidno:12的cdr3。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可為以下輕鏈可變區(qū)，其中由輕鏈可變區(qū)的n末端開(kāi)始編號(hào)的第2個(gè)和第4個(gè)氨基酸分別用亮氨酸(l)和甲硫氨酸(m)取代。

該輕鏈可變區(qū)為通過(guò)取代第2個(gè)和第4個(gè)殘基獲得的輕鏈可變區(qū)，所述第2個(gè)和第4個(gè)殘基在位于fr(框架)中的cdr游標(biāo)區(qū)所包含的殘基中就獲得保持其穿透細(xì)胞溶膠的能力的cdr結(jié)構(gòu)而言是重要的。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可為以下輕鏈可變區(qū)，其中由輕鏈可變區(qū)的n末端開(kāi)始編號(hào)的第9個(gè)、第10個(gè)、第13個(gè)、第17個(gè)、第19個(gè)、第21個(gè)、第22個(gè)、第42個(gè)、第45個(gè)、第58個(gè)、第60個(gè)、第79個(gè)和第85個(gè)氨基酸分別用絲氨酸(s)、絲氨酸(s)、丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、天冬氨酸(d)、纈氨酸(v)、異亮氨酸(i)、蘇氨酸(t)、賴(lài)氨酸(k)、賴(lài)氨酸(k)、纈氨酸(v)、絲氨酸(s)、谷氨酰胺(q)和蘇氨酸(t)取代。

該輕鏈可變區(qū)為基于以下測(cè)序結(jié)果獲得的輕鏈可變區(qū)，所述測(cè)序結(jié)果表明fr(框架)中共14個(gè)殘基不同于曲妥單抗(herceptin)，而曲妥單抗在由fda批準(zhǔn)的市售人源化抗體中是高度穩(wěn)定的且包含vh3亞基的重鏈可變區(qū)和vκ1亞基的輕鏈可變區(qū)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可為以下輕鏈可變區(qū)，其中由輕鏈可變區(qū)的n末端開(kāi)始編號(hào)的第89個(gè)和第91個(gè)氨基酸分別用谷氨酰胺(q)和酪氨酸(y)取代。

該輕鏈可變區(qū)基于對(duì)人抗體可變區(qū)之間的vh-vl界面殘基進(jìn)行分析的結(jié)果獲得，所述結(jié)果表明常規(guī)的穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)的小鼠cdr3中的兩個(gè)殘基是不同的。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可包含選自以下的氨基酸序列：seqidno:1、2和3。

關(guān)于序列的信息如下。

穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變區(qū)(vl)各個(gè)結(jié)構(gòu)域的名稱(chēng)和序列

在本文提供的seqidno中表示的所有殘基根據(jù)kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)(kabatea等人,1991)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體所穿透進(jìn)入且定位在細(xì)胞溶膠中的細(xì)胞可為活動(dòng)物細(xì)胞。也就是說(shuō)，抗體可主動(dòng)穿透活動(dòng)物細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可不但靶向于細(xì)胞溶膠，而且靶向于多種存在于細(xì)胞溶膠中的細(xì)胞器和存在于細(xì)胞中的分子。例如，抗體可為以下抗體，其靶向于細(xì)胞溶膠、細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或細(xì)胞器大分子，但是不限于此。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞器大分子可為蛋白、脂質(zhì)、dna或rna。更具體地，蛋白可為以下蛋白，其與對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、dna修復(fù)、dna完整性、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的控制相關(guān)。蛋白可為以下蛋白，其用磷酸基、羧酸基、甲基、硫酸基、脂質(zhì)、羥基或酰胺基進(jìn)行修飾、活化或突變。

在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體可靶向于在細(xì)胞溶膠中活化的ras且與其特異性結(jié)合?；罨膔as可為gtp結(jié)合的腫瘤相關(guān)因子且ras可為突變的ras。ras的突變可為與疾病相關(guān)的各種突變且其實(shí)例包括但不限于在kras、hras或nras的甘氨酸12、甘氨酸13和谷氨酰胺61處發(fā)生的取代突變。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體對(duì)細(xì)胞溶膠中活化的ras的結(jié)合親和力可歸因于抗體的重鏈可變區(qū)(vh)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)可包含：

seqidno:14的cdr1或與其具有至少90％同源性的氨基酸序列；

seqidno:15的cdr2或與其具有至少90％同源性的氨基酸序列；和

seqidno:16的cdr3或與其具有至少90％同源性的氨基酸序列。

關(guān)于這些序列的信息如下。

在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)可包含seqidno:13的氨基酸序列。

關(guān)于該序列的信息如下。

與ras特異性結(jié)合且抑制其活性的重鏈可變區(qū)通過(guò)以下方法篩選。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，篩選使用以下文庫(kù)進(jìn)行，其中cdr1、cdr2和cdr3區(qū)中共18個(gè)殘基處的人工突變?cè)谒鶚?gòu)建的人重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1)彼此融合的狀態(tài)下誘導(dǎo)。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用其中人重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1)彼此融合的文庫(kù)對(duì)重鏈可變區(qū)進(jìn)行選擇，其可與活化的(gtp結(jié)合的)ras特異性結(jié)合，即使在其與穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變區(qū)(vl)融合的狀態(tài)下。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，krasg12d(一種活化的(gtp結(jié)合的)ras突變體)用作靶分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，與癌癥相關(guān)的ras突變主要發(fā)生在殘基12、13和61處，其中殘基12和13位于ras蛋白的p環(huán)中且影響gap(gtp酶活化蛋白)的結(jié)合，而gap水解與ras蛋白結(jié)合的gtp以誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)變?yōu)槭Щ钚问?。另外，殘?1與gap的水解活性位點(diǎn)結(jié)合以防止gtp水解。因此，多種與癌癥相關(guān)的ras突變不限于krasg12d突變，這是因?yàn)槠湫盘?hào)傳導(dǎo)相關(guān)區(qū)(開(kāi)關(guān)i和開(kāi)關(guān)ii)與rasg12d突變的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)區(qū)(開(kāi)關(guān)i和開(kāi)關(guān)ii)等同。

在一個(gè)實(shí)施方案中，nras和hras中范圍在殘基1和殘基165之間的催化結(jié)構(gòu)域與kras中的催化結(jié)構(gòu)域都具有至少85％類(lèi)似性。在催化結(jié)構(gòu)域中，與下游信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)結(jié)合的開(kāi)關(guān)i(殘基32-38)和開(kāi)關(guān)ii(殘基59-67)與kras中的那些完全一致。然而，范圍在殘基165和殘基189之間的c末端早期結(jié)構(gòu)域具有15％類(lèi)似性，但是其結(jié)構(gòu)不影響下游信號(hào)傳導(dǎo)。因此，所使用的靶分子不限于活化的krasg12d。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)針對(duì)活化的(gtp結(jié)合的)ras以表達(dá)重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1)的狀態(tài)進(jìn)行初始篩選。然后fab通過(guò)與表達(dá)且分泌含有穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)(vl)和輕鏈恒定區(qū)(cl)的輕鏈的酵母進(jìn)行配對(duì)來(lái)篩選。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供誘導(dǎo)完整免疫球蛋白形式的抗體穿透細(xì)胞膜且定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)(vl)。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，輕鏈可變區(qū)可包含：

含有選自以下的氨基酸序列的cdr1或與所述cdr1具有至少90％同源性的序列：seqidno:4、7和10；和

含有選自以下的氨基酸序列的cdr3或與所述cdr3具有至少90％同源性的序列：seqidno:6、9和12。

另外，在本發(fā)明的實(shí)施例中，輕鏈可變區(qū)可為以下輕鏈可變區(qū)，其中由輕鏈可變區(qū)的n末端開(kāi)始編號(hào)的第2個(gè)和第4個(gè)氨基酸分別用亮氨酸(l)和甲硫氨酸(m)取代。

另外，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可為以下輕鏈可變區(qū)，其中由輕鏈可變區(qū)的n末端開(kāi)始編號(hào)的第9個(gè)、第10個(gè)、第13個(gè)、第17個(gè)、第19個(gè)、第21個(gè)、第22個(gè)、第42個(gè)、第45個(gè)、第58個(gè)、第60個(gè)、第79個(gè)和第85個(gè)氨基酸分別用絲氨酸(s)、絲氨酸(s)、丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、天冬氨酸(d)、纈氨酸(v)、異亮氨酸(i)、蘇氨酸(t)、賴(lài)氨酸(k)、賴(lài)氨酸(k)、纈氨酸(v)、絲氨酸(s)、谷氨酰胺(q)和蘇氨酸(t)取代。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可為以下輕鏈可變區(qū)，其中由輕鏈可變區(qū)的n末端開(kāi)始編號(hào)的第89個(gè)和第91個(gè)氨基酸分別用谷氨酰胺(q)和酪氨酸(y)取代。

另外，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)可包含選自以下的氨基酸序列：seqidno:1、2和3。

根據(jù)本發(fā)明的輕鏈可變區(qū)的穿透細(xì)胞的能力可為通過(guò)胞吞作用穿透細(xì)胞且然后通過(guò)內(nèi)體逃逸定位在細(xì)胞溶膠中的能力。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包含所述輕鏈可變區(qū)的抗體。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可為以下抗體，其穿透細(xì)胞膜且定位在細(xì)胞溶膠中?？贵w可為嵌合、人或人源化抗體。抗體可為選自以下的任何一種：igg、igm、iga、igd和ige?？贵w可為以下抗體，其靶向于細(xì)胞溶膠、細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或細(xì)胞器大分子。細(xì)胞器大分子可為蛋白、脂質(zhì)、dna或rna。蛋白可為以下蛋白，其與對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、dna修復(fù)、dna完整性、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的控制相關(guān)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體可為以下抗體，其與在細(xì)胞溶膠中活化的ras特異性結(jié)合且可包含與細(xì)胞溶膠中活化的ras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)?；罨膔as可為突變的ras。

另外，重鏈可變區(qū)可包含：

含有與seqidno:14所述氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列的cdr1；

含有與seqidno:15所述氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列的cdr2；和

含有與seqidno:16所述氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列的cdr3。

在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)可包含seqidno:13的氨基酸序列。

本發(fā)明的一個(gè)方面還提供與所述抗體融合且選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

蛋白可為抗體、抗體片段、免疫球蛋白、肽、酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、毒素、抗原肽、激素、載體蛋白、運(yùn)動(dòng)功能蛋白、受體、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、儲(chǔ)存蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、內(nèi)部蛋白、外部蛋白、分泌蛋白、病毒蛋白、糖蛋白、裂解的蛋白、蛋白復(fù)合物、化學(xué)修飾的蛋白等。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案提供與完整免疫球蛋白形式的抗體的輕鏈可變區(qū)的n末端融合的rgd4c肽，其通過(guò)穿透細(xì)胞溶膠與活化的(ctp結(jié)合的)ras特異性結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，rgd4c肽優(yōu)選通過(guò)(g4s)1接頭與輕鏈可變區(qū)的n末端融合，但是不限于此。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“小分子藥物”是指分子量小于約1000da且作為對(duì)抗疾病的治療劑具有活性的有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物或有機(jī)金屬化合物。所述術(shù)語(yǔ)在本文中以廣義使用。本文中的小分子藥物涵蓋分子量小于約1000da的寡肽和其它生物分子。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“納米?！笔侵赴镔|(zhì)的直徑為1-1,000nm的顆粒。納米?？蔀榻饘偌{米粒、由金屬納米粒核和包封所述核的金屬殼構(gòu)成的金屬/金屬核殼復(fù)合體、由金屬納米粒核和包封所述核的非金屬殼構(gòu)成的金屬/非金屬核殼或由非金屬納米粒核和包封所述核的金屬殼構(gòu)成的非金屬/金屬核殼復(fù)合體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，金屬可選自金、銀、銅、鋁、鎳、鈀、鉑、磁性鐵及其氧化物，但是不限于此且非金屬可選自硅、聚苯乙烯、膠乳和丙烯酸類(lèi)物質(zhì)，但是不限于此。

在本發(fā)明中，脂質(zhì)體包含至少一個(gè)包封內(nèi)部水性小室的能夠自身締合的脂質(zhì)雙層。脂質(zhì)體可通過(guò)膜類(lèi)型及其大小表征。小單層囊泡(suv)可具有單膜且直徑可為20-50nm。大單層囊泡(luv)的直徑可為至少50nm。寡層大囊泡和多層大囊泡可具有多重通常是同心的膜層且直徑可為至少100nm。具有數(shù)重非同心膜的脂質(zhì)體(即在較大的囊泡中包含數(shù)個(gè)小囊泡)稱(chēng)為多泡囊泡。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“融合”是指使具有相同或不同功能或結(jié)構(gòu)的兩個(gè)分子成為一體且融合方法可包括能夠使腫瘤組織穿透肽與蛋白、小分子藥物、納米?；蛑|(zhì)體結(jié)合的任何物理、化學(xué)或生物方法。優(yōu)選地，融合可通過(guò)接頭肽進(jìn)行且例如接頭肽可介導(dǎo)與生物活性分子在本發(fā)明的抗體輕鏈可變區(qū)、抗體或其片段的多個(gè)位置的融合。

本發(fā)明還提供用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其包含：所述抗體；或與所述抗體融合且選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

包含根據(jù)本發(fā)明的抗體或與所述抗體融合且選自肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體的生物活性分子的用于預(yù)防或治療癌癥的組合物的使用可穿透細(xì)胞且保留在細(xì)胞溶膠中而不影響人抗體重鏈可變區(qū)(vh)對(duì)抗原的高特異性和親和力且因此可定位在目前基于小分子藥物被分類(lèi)為疾病治療靶標(biāo)的細(xì)胞溶膠中且同時(shí)可展現(xiàn)出高效地治療和診斷通過(guò)蛋白和蛋白之間寬且平的表面顯示出在結(jié)構(gòu)上復(fù)雜的相互作用的腫瘤和疾病相關(guān)因子。另外，其可選擇性地抑制在多種常規(guī)腫瘤治療劑的使用中作為主要的藥物抗性相關(guān)因子的kras突變體且同時(shí)可與常規(guī)治療劑聯(lián)用由此展現(xiàn)出有效的抗癌活性。

癌癥可選自鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、鱗狀細(xì)胞肺癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼黑素瘤、直腸癌、肛門(mén)癌、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴瘤、肝癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和頭頸癌。

當(dāng)將組合物制備成用于預(yù)防或治療癌癥或血管生成相關(guān)疾病的藥物組合物時(shí)，組合物可包含藥用載體。包含在組合物中的藥用載體通常在制劑中使用。包含在組合物中的藥用載體的實(shí)例可包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油等，但是不限于此。除上述成分外，藥物組合物可進(jìn)一步包含潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、甜味劑、矯味劑、乳化劑、助懸劑、防腐劑等。

用于預(yù)防或治療癌癥或血管生成相關(guān)疾病的藥物組合物可口服或胃腸外給藥。上述胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、內(nèi)皮給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥、肺內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥等。由于蛋白或肽當(dāng)口服給藥時(shí)被消化，因此優(yōu)選將用于口服給藥的組合物配制成包覆活性物質(zhì)或被保護(hù)以對(duì)抗在胃中降解。另外，藥物組合物可通過(guò)任何可轉(zhuǎn)運(yùn)活性物質(zhì)至靶細(xì)胞的裝置給藥。

用于預(yù)防或治療癌癥或血管生成相關(guān)疾病的藥物組合物的合適劑量可隨多種因素而變化，例如配制方法、給藥方法、患者的年齡、體重、性別、病理狀態(tài)、食物、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄率和反應(yīng)敏感性等。優(yōu)選地，組合物的合適劑量基于成人為0.001-100mg/kg。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物有效劑量”是指足以預(yù)防或治療癌癥或血管生成相關(guān)疾病的量。

組合物可用藥用載體和/或賦形劑根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易實(shí)施的方法配制且可按單位劑量形式提供或包封在多劑量小瓶中。在本申請(qǐng)中，藥物組合物的制劑可為油性或水性介質(zhì)中的溶液、混懸液、糖漿或乳液形式或可為提取物、粉末、顆粒、片劑或膠囊且可進(jìn)一步包含分散劑或穩(wěn)定劑。另外，組合物可單獨(dú)或與其它治療劑組合給藥且可與常規(guī)治療劑先后或同時(shí)給藥。同時(shí)，組合物包含抗體或抗原結(jié)合片段且因此可配制成為免疫脂質(zhì)體。包含抗體的脂質(zhì)體可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。免疫脂質(zhì)體為包含磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)組合物且可通過(guò)反相蒸發(fā)法制備。例如，抗體的fab’片段可通過(guò)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體綴合。脂質(zhì)體可進(jìn)一步包含化學(xué)治療劑例如多柔比星。

本發(fā)明還提供用于診斷癌癥的組合物，其包含：所述抗體；或與所述抗體融合并選自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子藥物、納米粒和脂質(zhì)體。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“診斷”是指證實(shí)病理生理狀況的存在或特征。本發(fā)明中的診斷是指證實(shí)癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。

完整免疫球蛋白形式的抗體及其片段可與熒光物質(zhì)結(jié)合用于分子成像從而通過(guò)圖像診斷癌癥。

用于分子成像的熒光物質(zhì)是指產(chǎn)生熒光的所有物質(zhì)。優(yōu)選地發(fā)射紅色或近紅外熒光且更優(yōu)選地發(fā)射具有高量子產(chǎn)率的熒光。然而，熒光不限于此。

優(yōu)選地，用于分子成像的熒光物質(zhì)為熒光物質(zhì)、熒光蛋白或用于成像的其它物質(zhì)，其可與特異性結(jié)合于完整免疫球蛋白形式的抗體及其片段(kds)的腫瘤組織穿透肽結(jié)合，但是不限于此。

優(yōu)選地，熒光物質(zhì)為熒光素、bodypy、四甲基羅丹明、alexa、花青素、allopicocyanine或其衍生物，但是不限于此。

優(yōu)選地，熒光蛋白為dronpa蛋白、增強(qiáng)綠色熒光蛋白(egfp)、紅色熒光蛋白(dsrfp)、cy5.5(其為發(fā)射近紅外熒光的花青素?zé)晒馕镔|(zhì))或其它熒光蛋白，但是不限于此。

優(yōu)選地，用于成像的其它物質(zhì)為氧化鐵、放射性同位素等，但是不限于此且其可應(yīng)用于成像設(shè)備例如mr、pet。

本發(fā)明還提供編碼所述輕鏈可變區(qū)或包含所述輕鏈可變區(qū)的抗體或其片段的多核苷酸。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指以單鏈或雙鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。其包括rna基因組序列、dna(gdna和cdna)及由其轉(zhuǎn)錄的rna序列。除非另有描述，其還包括天然多核苷酸的類(lèi)似物。

多核苷酸不但包括編碼上述輕鏈區(qū)的核苷酸序列，而且包括與其互補(bǔ)的序列?；パa(bǔ)序列包括與核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列和與核苷酸序列基本上互補(bǔ)的序列。例如，這是指以下序列，其可在本領(lǐng)域已知的嚴(yán)格條件下與編碼seqidno:1至seqidno:3中任意一個(gè)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交。

另外，多核苷酸可為經(jīng)修飾的。修飾包括核苷酸的添加、缺失、非保守性取代或保守性取代。編碼氨基酸序列的多核苷酸被理解為包括與核苷酸序列具有基本同一性的核苷酸序列?；就恍钥芍感蛄挟?dāng)與核苷酸序列比對(duì)以盡可能多地與任何其它序列對(duì)應(yīng)且使用本領(lǐng)域通常使用的算法對(duì)所比對(duì)的序列進(jìn)行分析時(shí)具有至少80％同源性、至少90％同源性或至少95％同源性。

本發(fā)明還提供產(chǎn)生穿透活細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的抗體的方法，所述方法包括以下步驟：用能夠穿透活細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)替換抗體的輕鏈可變區(qū)。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案可提供以下方法，其中常規(guī)的完整免疫球蛋白形式的抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)用穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)(vl)替換從而所替換的完整免疫球蛋白形式的單克隆抗體將具有與能夠穿透細(xì)胞溶膠的完整免疫球蛋白形式的單克隆抗體相同的穿透細(xì)胞溶膠的性質(zhì)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過(guò)穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)(vl)穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的完整免疫球蛋白形式的抗體的實(shí)例包括以下步驟：

(1)構(gòu)建克隆有以下核酸的穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈表達(dá)載體，在所述核酸中包含人輕鏈可變區(qū)(vl)和人輕鏈恒定區(qū)(cl)的輕鏈中的輕鏈可變區(qū)(vl)用人源化輕鏈可變區(qū)(vl)替換；

(2)構(gòu)建克隆有編碼以下重鏈的核酸的重鏈表達(dá)載體，所述重鏈與所構(gòu)建的輕鏈相互作用從而表達(dá)完整免疫球蛋白形式的抗體且包含重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1-鉸鏈-ch2-ch3)；

(3)將所構(gòu)建的輕鏈和重鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞中且在所述細(xì)胞中表達(dá)含有穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的人源化輕鏈可變區(qū)(vl)的完整免疫球蛋白形式的抗體；和

(4)純化和回收所表達(dá)的能夠穿透細(xì)胞溶膠的完整免疫球蛋白形式的抗體。

上述方法可通過(guò)表達(dá)輕鏈表達(dá)載體和重鏈表達(dá)載體產(chǎn)生能夠穿透細(xì)胞溶膠的完整免疫球蛋白形式的抗體。另外，用表達(dá)包含能夠識(shí)別細(xì)胞中的特異性蛋白的重鏈可變區(qū)的重鏈的載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化可表達(dá)能夠穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中以與特異性蛋白結(jié)合的抗體。載體可為在單一載體中共表達(dá)重鏈和輕鏈的載體系統(tǒng)或在不同載體中表達(dá)重鏈和輕鏈的載體系統(tǒng)。在后者情況下可通過(guò)共轉(zhuǎn)化和靶向轉(zhuǎn)化將兩種載體引入到宿主細(xì)胞中。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指在宿主細(xì)胞中表達(dá)靶基因的方式。例如，載體可包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體和病毒載體如例如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體?？捎米髦亟M載體的載體可通過(guò)操作本領(lǐng)域通常使用的質(zhì)粒(例如psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19等)、噬菌體(例如λgt4λb、λ-charon、λδz1和m13等)或病毒(例如cmv、sv40等)產(chǎn)生。

重組載體中本發(fā)明的輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)(cl)、重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1-鉸鏈-ch2-ch3)可與啟動(dòng)子可操作地連接。本文使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指核苷酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子序列)和第二核苷酸序列之間的功能性連接基。因此，控制序列可控制第二核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

重組載體通常可構(gòu)建成用于克隆的載體或用于表達(dá)的載體。作為用于表達(dá)的載體，可使用本領(lǐng)域通常用于表達(dá)來(lái)自植物、動(dòng)物或微生物的外源蛋白的載體。重組載體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法構(gòu)建。

可將重組載體構(gòu)建成使用原核細(xì)胞或真核細(xì)胞作為宿主的載體。例如，當(dāng)所使用的載體為表達(dá)載體且使用原核細(xì)胞作為宿主時(shí)，載體通常包括可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如plλ啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等)、用于啟動(dòng)翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和針對(duì)轉(zhuǎn)錄/翻譯的終止序列。當(dāng)載體使用真核細(xì)胞作為宿主時(shí)，在載體所包括的真核細(xì)胞中操作的復(fù)制起點(diǎn)可包括f1復(fù)制起點(diǎn)、sv40復(fù)制起點(diǎn)、pmb1復(fù)制起點(diǎn)、腺?gòu)?fù)制起點(diǎn)、aav復(fù)制起點(diǎn)、cmv復(fù)制起點(diǎn)和bbv復(fù)制起點(diǎn)等，但是不限于此。另外，可使用源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒的啟動(dòng)子(例如腺病毒后期啟動(dòng)子、痘苗病毒7.5k啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子或hsv的tk啟動(dòng)子)且啟動(dòng)子通常具有作為轉(zhuǎn)錄終止序列的聚腺苷酸化序列。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。

本領(lǐng)域已知的任何種類(lèi)的宿主細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。原核細(xì)胞的實(shí)例包括屬于芽孢桿菌屬的菌株例如大腸桿菌jm109、大腸桿菌bl21、大腸桿菌rr1、大腸桿菌le392、大腸桿菌b、大腸桿菌x1776、大腸桿菌w3110、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸道菌群和菌株例如粘質(zhì)沙雷氏菌和多種假單胞菌屬種等。另外，當(dāng)將載體轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞中時(shí)，可使用宿主細(xì)胞例如酵母(釀酒酵母)、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞例如sp2/0、cho(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)k1、chodg44、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rn和mdck細(xì)胞系等。

本發(fā)明的另一個(gè)方面可提供產(chǎn)生穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的完整免疫球蛋白形式的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞的步驟。

重組載體可使用本領(lǐng)域已知的插入方法插入到宿主細(xì)胞中。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)移可根據(jù)cacl2法或電穿孔法等進(jìn)行且當(dāng)宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞時(shí)，載體可根據(jù)顯微鏡注射法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法和基因轟擊法等轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，但是轉(zhuǎn)移方法不限于此。當(dāng)使用微生物例如大腸桿菌等時(shí)，生產(chǎn)率比使用動(dòng)物細(xì)胞高。然而，盡管其由于糖基化不適于產(chǎn)生完整ig形式的抗體，其可用于產(chǎn)生抗原結(jié)合片段例如fab和fv。

用于選擇所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法使用由所選標(biāo)簽表達(dá)的表型容易地進(jìn)行。例如，當(dāng)所選標(biāo)簽為特異性抗生素抗性基因時(shí)，轉(zhuǎn)化體可通過(guò)在包含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體容易地選擇。

本發(fā)明的另一個(gè)方面可提供產(chǎn)生以下完整免疫球蛋白形式的抗體的方法，所述抗體穿透細(xì)胞溶膠且與細(xì)胞溶膠中活化的(gtp結(jié)合的)腫瘤相關(guān)因子ras特異性結(jié)合且抑制ras的活性，所述方法使用穿透活細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的完整免疫球蛋白形式的抗體。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，穿透動(dòng)物細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中且與細(xì)胞溶膠中活化的(gtp結(jié)合的)ras特異性結(jié)合的完整免疫球蛋白形式的抗體使用能夠與活化的(gtp結(jié)合的)ras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)產(chǎn)生且可通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生：

(1)構(gòu)建克隆有以下核酸的重鏈表達(dá)載體，所述核酸包含與活化的(gtp結(jié)合的)ras特異性結(jié)合的人重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1-鉸鏈-ch2-ch3)；

(2)將所構(gòu)建的重鏈表達(dá)載體和穿透細(xì)胞的輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞中且在所述細(xì)胞中表達(dá)穿透活細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中以特異性識(shí)別活化的(gtp結(jié)合的)ras的完整免疫球蛋白形式的抗體；和

(3)純化和回收所表達(dá)的能夠穿透細(xì)胞溶膠且特異性識(shí)別活化的(gtp結(jié)合的)ras的完整免疫球蛋白形式的抗體。

有利的效果

根據(jù)本發(fā)明使完整免疫球蛋白形式的抗體穿透活細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的方法，抗體可穿透活細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中而不必使用特別的外部蛋白遞送系統(tǒng)。

具體地，為了實(shí)現(xiàn)具有穿透細(xì)胞溶膠的穩(wěn)定能力的完整免疫球蛋白形式的抗體，本發(fā)明提供容易與多種人重鏈可變區(qū)(vh)相互作用且與其結(jié)合且同時(shí)穿透細(xì)胞溶膠且定位在細(xì)胞溶膠中的輕鏈可變區(qū)。包含該輕鏈可變區(qū)的完整免疫球蛋白形式的抗體穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中且對(duì)細(xì)胞不顯示出非特異性細(xì)胞毒性。當(dāng)抗體的重鏈可變區(qū)(vh)用能夠特異性識(shí)別活化的(gtp結(jié)合的)ras的重鏈可變區(qū)(vh)替換時(shí)，抗體可靶向于活細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中活化的(gtp結(jié)合的)ras且抑制ras的活性。

根據(jù)本發(fā)明的穿透細(xì)胞溶膠的完整免疫球蛋白形式的抗體的使用可穿透細(xì)胞且保留在細(xì)胞溶膠中而不影響人抗體重鏈可變區(qū)(vh)對(duì)抗原的高特異性和親和力且因此可定位在目前基于小分子藥物被分類(lèi)為疾病治療靶標(biāo)的細(xì)胞溶膠中且同時(shí)可展現(xiàn)出高效地治療和診斷通過(guò)蛋白和蛋白之間寬且平的表面顯示出在結(jié)構(gòu)上復(fù)雜的相互作用的腫瘤和疾病相關(guān)因子。另外，其可選擇性地抑制在多種常規(guī)腫瘤治療劑的使用中作為主要的藥物抗性相關(guān)因子的kras突變體且同時(shí)可與常規(guī)治療劑聯(lián)用由此展現(xiàn)出有效的抗癌活性。

附圖說(shuō)明

圖1的示意圖顯示了被稱(chēng)為“cytotransmab”的完整免疫球蛋白形式的抗體的概念，所述抗體穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中。

圖2a顯示了對(duì)以下序列進(jìn)行分析的結(jié)果，所述序列包括在由小鼠輕鏈可變區(qū)m3d8vl獲得改進(jìn)的穿透細(xì)胞溶膠的與人源化抗體重鏈可變區(qū)穩(wěn)定結(jié)合的人源化輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域ht3vl的方法中使用的克隆。

圖2b使用m3d8vl、人源化輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域ht0vl及其突變體(ht2vl和ht3vl)的wam建模通過(guò)疊加法比較了模型結(jié)構(gòu)。

圖3a顯示了對(duì)輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域穿透細(xì)胞溶膠的能力進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

圖3b顯示了為了確認(rèn)輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域穿透細(xì)胞溶膠的機(jī)制而進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

圖4a顯示了對(duì)ht3vl的氨基酸序列及常規(guī)人抗體阿達(dá)木單抗(humira)和人源化抗體貝伐單抗(avastin)的輕鏈可變域(vl)的氨基酸序列進(jìn)行分析的結(jié)果從而確認(rèn)ht3vl是否可應(yīng)用于多種人抗體重鏈可變區(qū)。

圖4b顯示了對(duì)可變區(qū)之間的界面殘基進(jìn)行分析的結(jié)果從而構(gòu)建與人抗體重鏈可變區(qū)最佳相互作用的穩(wěn)定的cytotransmab。

圖5的示意圖顯示了用能夠穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變區(qū)替換不能穿透細(xì)胞的輕鏈可變區(qū)從而構(gòu)建cytotransmab的方法。

圖6a顯示了在純化后通過(guò)還原或非還原sds-page對(duì)cytotransmab進(jìn)行分析的結(jié)果。

圖6b顯示了通過(guò)hplc(高效液相色譜)(agilent1200系列l(wèi)c系統(tǒng)和模塊)(agilent)使用尺寸排阻色譜柱(superdex^tm20010/300gc)(gehealthcare)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果從而確認(rèn)cytotransmab在天然環(huán)境中以單體形式存在。

圖6c顯示了進(jìn)行elisa(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)以測(cè)量cytotransmab(tmab4、hut4或avat4)和igg抗體(貝伐單抗(avastin)和阿達(dá)木單抗(humira))的重鏈可變區(qū)對(duì)靶分子的親和力的結(jié)果。

圖6d顯示了進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸水解實(shí)驗(yàn)以檢查通過(guò)用移植有自身免疫小鼠抗體的cdr的穿透細(xì)胞的人輕鏈可變區(qū)(ht4)替換獲得的cytotransmab中的核酸的水解的結(jié)果。

圖7a顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)多種細(xì)胞系中的1-2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察的結(jié)果從而確認(rèn)其中輕鏈可變區(qū)用穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈區(qū)ht4vl替換的cytotransmab具有穿透細(xì)胞溶膠的能力。

圖7b顯示了檢查數(shù)種細(xì)胞穿透細(xì)胞溶膠的能力的結(jié)果，其通過(guò)如圖7a所示的共聚焦顯微鏡觀察以減小的倍率進(jìn)行從而在細(xì)胞溶膠穿透能力檢查實(shí)驗(yàn)中檢查細(xì)胞穿透效率。

圖8a顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)tmab4的細(xì)胞穿透程度作為tmab4濃度的函數(shù)進(jìn)行觀察的結(jié)果。

圖8b顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)tmab4的細(xì)胞穿透程度作為tmab4處理后時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行觀察的結(jié)果。

圖9a的圖顯示了通過(guò)在體外用cytotransmab處理hela和panc-1細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而獲得的結(jié)果。

圖9b的圖像顯示了通過(guò)在體外用cytotransmab處理hela和panc-1細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞的抑制程度而獲得的結(jié)果。

圖10顯示了通過(guò)脈沖追蹤和共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)引入的tmab4的轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定性進(jìn)行觀察的結(jié)果。

圖11a顯示了使用鈣黃綠素進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察以間接確認(rèn)cytotransmabtmab4或hut4的細(xì)胞溶膠定位的結(jié)果。

圖11b的條形圖顯示了對(duì)圖11a所示共聚焦顯微鏡圖像的鈣黃綠素?zé)晒膺M(jìn)行定量的結(jié)果。

圖12a的示意圖顯示了以下過(guò)程，其中當(dāng)cytotransmab定位在細(xì)胞溶膠中時(shí)，觀察到由于經(jīng)分裂的gfp的互補(bǔ)締合而引起的gfp熒光。

圖12b顯示了進(jìn)行western印跡分析以對(duì)所構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系中鏈霉親和素-gfp1-10的表達(dá)水平進(jìn)行分析的結(jié)果。

圖12c顯示了對(duì)gfp11-sbp2融合的cytotransmab由于經(jīng)分裂的gfp的互補(bǔ)締合而引起的gfp熒光進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

圖13的示意圖顯示了通過(guò)將僅具有穿透細(xì)胞溶膠的能力的完整igg形式的cytotransmab的重鏈可變區(qū)(vh)用與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)進(jìn)行替換來(lái)構(gòu)建抗ras·gtpimab的過(guò)程。

圖14顯示了僅具有穿透細(xì)胞溶膠的能力的igg形式的cytotransmab的施用且作為示意圖顯示了通過(guò)使用以下單克隆抗體(抗ras·gtpimab：內(nèi)化和干擾單克隆抗體)誘導(dǎo)特異性針對(duì)ras突變細(xì)胞的細(xì)胞毒性的策略，所述抗體具有用與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)替換的重鏈可變區(qū)且所述抗體穿透細(xì)胞且在細(xì)胞中與結(jié)合有g(shù)tp的ras特異性結(jié)合。

圖15的示意圖顯示了獲得僅對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d蛋白具有高親和力的人源化抗體重鏈可變單結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)篩選策略。

圖16顯示了在獲得對(duì)結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d的高親和力的上述過(guò)程的每個(gè)步驟中對(duì)單獨(dú)的結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d的條件下和與結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d競(jìng)爭(zhēng)的條件下的結(jié)合進(jìn)行facs分析的結(jié)果。

圖17顯示了純化后通過(guò)12％sds-page在還原或非還原條件下分析抗ras·gtpimabrt4的結(jié)果。

圖18顯示了進(jìn)行elisa以測(cè)量對(duì)gtp結(jié)合的和gdp結(jié)合的野生型kras及gtp結(jié)合的和gdp結(jié)合的kras突變體(krasg12d、krasg12v和krasg13d)的親和力的結(jié)果。

圖19顯示了通過(guò)使用spr(biacore2000)(gehealthcare)分析抗ras·gtpimabrt4對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d的親和力的結(jié)果。

圖20顯示了進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察以檢查抗ras·gtpimabrt4穿透細(xì)胞溶膠的能力的結(jié)果。

圖21顯示了通過(guò)在體外用抗ras·gtpimabrt4處理nih3t3、nih3t3krasg12v和nih3t3hrasg12v細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而獲得的結(jié)果。

圖22顯示了在nih3t3hrasg12v細(xì)胞系中評(píng)估對(duì)非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制的結(jié)果。

圖23顯示了對(duì)抗ras·gtpimabrt4是否與細(xì)胞中活化的hrasg12v突變體疊加進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

圖24顯示了對(duì)抗ras·gtpimabrt4是否與細(xì)胞中結(jié)合有g(shù)tp的krasg12v突變體疊加進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

圖25顯示了通過(guò)在體外用rgd-tmab4和rgd-rt4處理hct116和panc-1細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而獲得的結(jié)果。

圖26a顯示了在異種移植有hct116細(xì)胞的小鼠中對(duì)rgd融合的抗ras·gtpimabrt4的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用進(jìn)行分析的結(jié)果。

圖26b的圖顯示了測(cè)量小鼠體重從而檢查rgd融合的抗ras·gtpimabrt4的非特異性副作用的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些實(shí)施例僅為示意性目的而不應(yīng)被理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

實(shí)施例1：開(kāi)發(fā)穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變(vl)單結(jié)構(gòu)域的原理

圖1的示意圖顯示了被稱(chēng)為“cytotransmab”的穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的完整免疫球蛋白抗體的概念。為了實(shí)現(xiàn)該抗體并理解人源化抗體輕鏈可變區(qū)穿透細(xì)胞溶膠的能力，參照了關(guān)于小鼠輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域m3d8vl穿透細(xì)胞溶膠的能力和與輕鏈可變區(qū)片段對(duì)應(yīng)的cdr之間的相關(guān)性的常規(guī)研究(lee等人,2013)。

圖2a顯示了對(duì)以下序列進(jìn)行分析的結(jié)果，所述序列包含在由小鼠輕鏈可變區(qū)m3d8vl獲得改進(jìn)的穿透細(xì)胞溶膠的與人源化抗體重鏈可變區(qū)穩(wěn)定結(jié)合的人源化輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域ht3vl的過(guò)程中使用的克隆。

具體地，基于在小鼠輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域m3d8vl和通過(guò)使用cdr移植技術(shù)對(duì)單結(jié)構(gòu)域m3d8vl進(jìn)行人源化而獲得的ht0vl之間比較穿透細(xì)胞溶膠的能力而確認(rèn)的是，即使輕鏈可變區(qū)(vl)的cdr1序列是保守的，仍然喪失了穿透細(xì)胞溶膠的能力。

因此，為了改進(jìn)cdr1的結(jié)構(gòu)以具有與m3d8vl類(lèi)似的結(jié)構(gòu)由此恢復(fù)人源化抗體輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域穿透細(xì)胞溶膠的能力，對(duì)fr(框架)中的cdr區(qū)(游標(biāo)區(qū))進(jìn)行了比較性分析。由此發(fā)現(xiàn)殘基2和4不同于能夠穿透細(xì)胞溶膠的小鼠m3d8vl的那些。具體地，由于殘基2和4作為顯著影響cdr1結(jié)構(gòu)(游標(biāo)區(qū))的上部核心，因此通過(guò)對(duì)ht0vl進(jìn)行反向突變開(kāi)發(fā)出具有與m3d8vl的cdr1結(jié)構(gòu)類(lèi)似的cdr1結(jié)構(gòu)的ht2vl(參見(jiàn)圖2a)。

然后為了構(gòu)建穩(wěn)定的cytotransmab并生成vh3和vκ1亞基之間的配對(duì)(其在穩(wěn)定的抗體中是非常普遍的)由此開(kāi)發(fā)出與多種人抗體重鏈可變區(qū)互補(bǔ)穩(wěn)定結(jié)合并保持其穿透到細(xì)胞溶膠中的能力的輕鏈可變區(qū)，比較性地分析了ht2vl的fr(框架)和人源化治療性單克隆抗體曲妥單抗(herceptin)(其具有vh3和vκ1亞基且是非常穩(wěn)定的)的輕鏈可變區(qū)fr(框架)。由此證實(shí)ht2vl的fr(框架)中的14個(gè)殘基不同于曲妥單抗的輕鏈可變區(qū)fr(框架)中的那些。這14個(gè)殘基用曲妥單抗的輕鏈可變區(qū)fr(框架)的序列進(jìn)行突變由此開(kāi)發(fā)出ht3vl(參見(jiàn)圖2a)。

圖2b使用m3d8vl、人源化輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域ht0vl及其突變體(ht2vl和ht3vl)的wam建模通過(guò)疊加法比較了模型結(jié)構(gòu)。所發(fā)現(xiàn)的是，cdr1區(qū)與m3d8vl的cdr1區(qū)的結(jié)構(gòu)差異通過(guò)如上所述對(duì)殘基2和4進(jìn)行反向突變而減小。

實(shí)施例2：對(duì)能夠穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變(vl)單結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表達(dá)和純化

為了比較在上述實(shí)施例中設(shè)計(jì)的ht2vl和ht3vl實(shí)際穿透細(xì)胞溶膠的能力，對(duì)人源化輕鏈可變(vl)單結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了純化。

具體地，通過(guò)nhei/bamhi限制酶將在n末端包含phoa信號(hào)肽且在c末端包含蛋白a標(biāo)簽的穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域克隆到pig20載體中且然后通過(guò)電穿孔將載體轉(zhuǎn)化到用于蛋白表達(dá)的大腸桿菌bl21(de3)plyse中。在包含100μg/ml氨芐西林的lba培養(yǎng)基中以180rpm和37℃培養(yǎng)大腸桿菌直至在600nm的吸光度達(dá)到0.6-0.8。然后用0.5mmiptg(異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷)處理培養(yǎng)物且然后在23℃溫育20小時(shí)以表達(dá)蛋白。表達(dá)后，通過(guò)高速離心機(jī)以8,000rpm離心培養(yǎng)物30分鐘并收集上清液且然后與igg-瓊脂糖樹(shù)脂(gehealthcare)反應(yīng)。用50mltbs(tris-hcl,137mmnacl,2.7mmkcl,ph7.4)洗滌樹(shù)脂且然后用5ml5mmnh4ac(ph5.0)緩沖液洗滌。然后通過(guò)使用0.1mhac(ph3.0)緩沖液由樹(shù)脂洗脫蛋白且緩沖液用tbs(ph7.4)通過(guò)透析替換。然后蛋白濃度通過(guò)bca(二辛可寧酸(pierce))測(cè)定測(cè)量且蛋白純度通過(guò)sds-page分析。

實(shí)施例3：對(duì)穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變(vl)單結(jié)構(gòu)域穿透細(xì)胞溶膠的能力和細(xì)胞穿透機(jī)制進(jìn)行確認(rèn)

圖3a顯示了對(duì)輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域穿透細(xì)胞溶膠的能力進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

具體地，為了確認(rèn)m3d8vl、ht0vl、ht2vl和ht3vl穿透細(xì)胞溶膠的能力，將蓋玻片添加至24孔板且將5×10⁴個(gè)hela細(xì)胞/孔添加至0.5ml含有10％fbs(胎牛血清)的培養(yǎng)基中且在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定化時(shí)，用在0.5ml新鮮培養(yǎng)基中的10μmm3d8vl、ht0vl、ht2vl或ht3vl處理每個(gè)孔且在5％co2和37℃的條件下溫育6小時(shí)。然后去除培養(yǎng)基且用pbs洗滌每個(gè)孔且然后用弱酸性溶液(200mm甘氨酸,150mmnacl,ph2.5)處理以由細(xì)胞表面去除蛋白。然后用pbs洗滌每個(gè)孔且在4％多聚甲醛中在25℃固定細(xì)胞10分鐘。用pbs洗滌后，每個(gè)孔用包含0.1％皂苷、0.1％疊氮化鈉和1％bsa的pbs緩沖液在25℃溫育10分鐘以在細(xì)胞膜中形成孔。用pbs洗滌后，每個(gè)孔用包含2％bsa的pbs緩沖液在25℃溫育1小時(shí)以消除非特異性結(jié)合。然后每個(gè)孔用識(shí)別輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域的蛋白a標(biāo)簽的兔igg(sigma)處理且將每個(gè)孔在25℃溫育2小時(shí)，用pbs洗滌三次且然后用經(jīng)紅色熒光(tritc)標(biāo)記的抗兔抗體(sigma)處理，然后在25℃溫育1小時(shí)。最后細(xì)胞核用hoechst33342進(jìn)行藍(lán)色染色且用共聚焦顯微鏡觀察。由此證實(shí)除ht0vl外，m3d8vl、ht2vl和ht3vl具有細(xì)胞穿透能力。

圖3b顯示了為了確認(rèn)輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域穿透細(xì)胞溶膠的機(jī)制而進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

具體地，當(dāng)如圖3a所示制備hela細(xì)胞并使其穩(wěn)定化時(shí)，將在0.5ml新鮮培養(yǎng)基中的10μmm3d8vl、ht2vl或ht3vl和10μg/mlalexafluor488-轉(zhuǎn)鐵蛋白(tf,綠色熒光)、fitc-霍亂毒素b(ctx-b,綠色熒光)或oregon綠色葡聚糖(dextran,綠色熒光)的稀釋液添加至每個(gè)孔中且在5％co2和37℃的條件下溫育2小時(shí)。然后如圖3a所示對(duì)輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域進(jìn)行染色。如圖3b所示，所有輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域都與霍亂毒素-b疊加，這表明這些結(jié)構(gòu)域通過(guò)胞膜窖穿透細(xì)胞溶膠。

實(shí)施例4：開(kāi)發(fā)容易與人抗體重鏈可變域相互作用的穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變(vl)單結(jié)構(gòu)域

圖4a顯示了對(duì)ht3vl的氨基酸序列及常規(guī)人抗體阿達(dá)木單抗(humira)和人源化抗體貝伐單抗(avastin)的輕鏈可變域(vl)的氨基酸序列進(jìn)行分析的結(jié)果從而確認(rèn)ht3vl是否可應(yīng)用于多種人抗體重鏈可變域。

具體地，對(duì)參與重鏈和輕鏈可變域之間的相互作用的vh-vl界面殘基進(jìn)行了分析。由此發(fā)現(xiàn)vl結(jié)構(gòu)域的cdr3中處于89位的賴(lài)氨酸(k)和處于91位的絲氨酸(s)與人抗體中處于89位的谷氨酰胺(q)和酪氨酸(y)是對(duì)應(yīng)的。

為了謀劃對(duì)殘基進(jìn)行改進(jìn)的策略，更詳細(xì)地分析了vh-vl界面殘基對(duì)重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)的cdr的作用。

圖4b顯示了對(duì)可變區(qū)之間的界面殘基進(jìn)行分析的結(jié)果從而構(gòu)建與人抗體重鏈可變區(qū)最佳相互作用的穩(wěn)定的cytotransmab。

具體地，基于文獻(xiàn)所報(bào)道的關(guān)于人抗體可變區(qū)之間的界面殘基的位置、與位于相對(duì)的可變區(qū)中的特定界面殘基結(jié)合的頻率和界面殘基在人抗體中的豐度的信息，對(duì)ht3vl及在貝伐單抗(avastin)和阿達(dá)木單抗(humira)(由fda批準(zhǔn)的抗體)的重鏈和輕鏈可變區(qū)之間的界面殘基進(jìn)行了分析(vargas-madrazo和paz-garcia,2003)。分析結(jié)果表明在ht3vl的小鼠cdr中，參與可變區(qū)之間的締合的cdr3中的殘基89和91在人抗體中是高度豐富的且可影響重鏈可變區(qū)(vh)的cdr3結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)殘基用在人抗體中高度豐富的氨基酸進(jìn)行突變由此得到可與人抗體重鏈可變區(qū)最佳結(jié)合的ht4vl。

下表1和2顯示了所設(shè)計(jì)的能夠穿透細(xì)胞溶膠的人抗體輕鏈可變區(qū)的序列。表1顯示了根據(jù)kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的人抗體輕鏈可變區(qū)的全長(zhǎng)序列且表2顯示了表1所示抗體序列的cdr序列。

表1：穿透細(xì)胞溶膠的人抗體輕鏈可變區(qū)的全長(zhǎng)序列

表2：穿透細(xì)胞溶膠的人抗體輕鏈可變區(qū)的cdr序列

實(shí)施例5：通過(guò)用穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈區(qū)(vl)進(jìn)行替換來(lái)開(kāi)發(fā)cytotransmab及對(duì)cytotransmab進(jìn)行表達(dá)和純化

圖5的示意圖顯示了用能夠穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變區(qū)替換不能穿透細(xì)胞的輕鏈可變區(qū)從而構(gòu)建cytotransmab的方法。

具體地，為了構(gòu)建用于產(chǎn)生完整igg形式的單克隆抗體的重鏈表達(dá)載體，將對(duì)包含抗體重鏈可變區(qū)(貝伐單抗vh、阿達(dá)木單抗vh或人源化ht0vh)和重鏈恒定區(qū)(ch1-鉸鏈-ch2-ch3)的重鏈進(jìn)行編碼的dna(其具有融合至5’末端的編碼分泌信號(hào)肽的dna)通過(guò)noti/hindiii克隆到pcdna3.4載體(invitrogen)中。另外，為了構(gòu)建表達(dá)輕鏈的載體，將對(duì)穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變區(qū)(ht4vl)或輕鏈可變區(qū)(貝伐單抗vl或阿達(dá)木單抗vl)和模型抗體的輕鏈恒定區(qū)(cl)進(jìn)行編碼的dna(其具有融合至5’末端的編碼分泌信號(hào)肽的dna)通過(guò)使用noti/hindiii克隆到pcdna3.4載體(invitrogen)中。

對(duì)輕鏈和重鏈表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化，然后比較蛋白產(chǎn)率。在搖瓶中，在不含有血清的freestyle293表達(dá)培養(yǎng)基(invitrogen)中混懸生長(zhǎng)的hek293-f細(xì)胞(invitrogen)用質(zhì)粒和聚乙烯亞胺(pei)(polyscience)的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在搖瓶(corning)中進(jìn)行200ml轉(zhuǎn)染后，將hek293-f細(xì)胞以2.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到100ml培養(yǎng)基中并以150rpm在8％co2中培養(yǎng)。為了產(chǎn)生每種單克隆抗體，在10mlfreestyle293表達(dá)培養(yǎng)基(invitrogen)中稀釋適當(dāng)?shù)闹劓満洼p鏈質(zhì)粒(125μg重鏈，125μg輕鏈，共250μg(2.5μg/ml))且將稀釋液與10ml包含750μg(7.5μg/ml)pei的培養(yǎng)基混合且在室溫溫育混合物10分鐘。添加所溫育的培養(yǎng)基混合物至100ml所接種的細(xì)胞培養(yǎng)物，然后其以150rpm在8％co2中培養(yǎng)4小時(shí)，然后將100mlfreestyle293表達(dá)培養(yǎng)基添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中，然后培養(yǎng)6天。按照標(biāo)準(zhǔn)方案從所收集的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化蛋白。將抗體加載于蛋白a瓊脂糖柱(gehealthcare)且用pbs(ph7.4)洗滌?？贵w使用0.1m甘氨酸緩沖液(ph3.0)洗脫且然后立即用1mtris緩沖液中和。濃縮所洗脫的抗體級(jí)份同時(shí)緩沖液通過(guò)透析用pbs(ph7.4)替換。通過(guò)測(cè)量在280nm的吸光度和吸光系數(shù)對(duì)所純化的蛋白進(jìn)行定量。

下表3顯示了每升培養(yǎng)物體積產(chǎn)生的純化的cytotransmab和蛋白的產(chǎn)率。對(duì)三次測(cè)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理且±表示標(biāo)準(zhǔn)差值。對(duì)于所得蛋白的產(chǎn)率，包含改進(jìn)的ht4vl以促進(jìn)其與人重鏈可變區(qū)(vh)相互作用的cytotransmab沒(méi)有顯著不同于野生型單克隆抗體。

表3：cytotransmab的純化產(chǎn)率與野生型igg形式的單克隆抗體(阿達(dá)木單抗和貝伐單抗)的純化產(chǎn)率的比較

這些結(jié)果表明通過(guò)額外地修飾界面殘基獲得的人源化輕鏈可變區(qū)(ht4vl)可與人源化抗體重鏈可變區(qū)最佳相互作用且因此可穩(wěn)定地表達(dá)和純化。

圖6a顯示了在純化后通過(guò)還原或非還原sds-page對(duì)cytotransmab進(jìn)行分析的結(jié)果。

具體地，在非還原條件下出現(xiàn)約150kda的分子量且在還原條件下重鏈顯示出約50kda的分子量且輕鏈顯示出約25kda的分子量。這表明所純化的cytotransmab和單克隆抗體在溶液狀態(tài)下以單體形式存在且不通過(guò)非天然二硫鍵形成二聚體或低聚體。

圖6b顯示了通過(guò)hplc(高效液相色譜)(agilent1200系列l(wèi)c系統(tǒng)和模塊)(agilent)使用尺寸排阻色譜柱(superdex^tm20010/300gc)(gehealthcare)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果從而確認(rèn)cytotransmab在天然環(huán)境中以單體形式存在。

具體地，以0.5ml/min的流速使用高鹽洗脫緩沖液(12mm磷酸鹽,ph7.4,500mmnacl,2.7mmkcl)(sigma)從而消除通過(guò)由堿性殘基引起的電吸引而導(dǎo)致的與樹(shù)脂的非特異性結(jié)合。用作蛋白大小標(biāo)志物的蛋白為脫氫酶(150kda)、白蛋白(66kda)和碳酸酐酶(29kda)。在所有單克隆抗體和cytotransmab中都測(cè)量到單極端點(diǎn)，這表明這些抗體以單體形式存在。

實(shí)施例6：對(duì)cytotransmab的重鏈可變區(qū)的親和力進(jìn)行分析且對(duì)輕鏈可變區(qū)(vl)的dna水解能力進(jìn)行分析

圖6c顯示了進(jìn)行elisa(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)以測(cè)量cytotransmab(tmab4、hut4或avat4)和單克隆抗體(貝伐單抗(avastin)和阿達(dá)木單抗(humira))的重鏈可變區(qū)對(duì)靶分子的親和力的結(jié)果。

具體地，將靶分子(vegf-a或tnf-α)在96孔eia/ria板(costarcorning)中在37℃溫育1小時(shí)且然后用0.1％pbst(0.1％吐溫20,ph7.4,137mmnacl,12mm磷酸鹽,2.7mmkcl)(sigma)以10分鐘洗滌三次。用5％pbss(5％脫脂乳,ph7.4,137mmnacl,12mm磷酸鹽,2.7mmkcl)(sigma)溫育1小時(shí)后，靶分子用0.1％pbst以10分鐘洗滌三次。然后使cytotransmab和單克隆抗體(tmab4、貝伐單抗、阿達(dá)木單抗、avat4和hut4)各自與靶分子結(jié)合，然后用0.1％pbst以10分鐘洗滌三次。山羊堿性磷酸酶綴合的抗人mab(sigma)用作標(biāo)志物抗原。使所獲得的物質(zhì)各自與pnpp(棕櫚酸對(duì)硝基苯基酯)(sigma)反應(yīng)并測(cè)量在405nm的吸光度。

如圖6c所示，avat4和hut4喪失了其對(duì)靶分子的親和力。就阿達(dá)木單抗和tnf-α所證實(shí)的是，在位于重鏈和輕鏈中的所有cdr中都涉及抗原識(shí)別位點(diǎn)(shi等人,2013)。就貝伐單抗所發(fā)現(xiàn)的是，重鏈可變區(qū)(vh)的cdr3在與抗原的結(jié)合中發(fā)揮重要作用，但是圖8b所顯示的分析結(jié)果表明貝伐單抗具有vh7亞基。還發(fā)現(xiàn)貝伐單抗的輕鏈可變區(qū)的顯著影響重鏈可變區(qū)(vh)cdr3的殘基96沒(méi)有顯著不同于ht4vl的那個(gè)(charlotte等人,2007)。

圖6d顯示了進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸水解實(shí)驗(yàn)以檢查通過(guò)用移植有自身免疫小鼠抗體的cdr的穿透細(xì)胞的人輕鏈可變區(qū)(ht4)替換獲得的cytotransmab中的核酸的水解的結(jié)果。

具體地，在共10μl混合物體積中，將所純化的puc19底物(2.2nm)和已知能夠水解核酸的m3d8scfv蛋白(0.5μm和0.1μm)或cytotransmab和單克隆抗體(tmab4、avat4、hut4(0.1μm))中的每種在tbs反應(yīng)緩沖液(50mmtris-hcl,50mmnacl,ph7.4)(sigma)中溫育。在本申請(qǐng)中，包含2mmmgcl2的tbs緩沖液和另一種包含50mmedta(sigma)的緩沖液用作對(duì)照。將所制備的樣品在37℃溫育。1小時(shí)后，觀察樣品。

如圖6d所示，觀察結(jié)果表明tmab4、avat4和hut4在0.1μm不具有核酸水解能力。這表明當(dāng)這些抗體穿透細(xì)胞溶膠且保留在細(xì)胞溶膠中時(shí)，其不引起非特異性細(xì)胞毒性。

實(shí)施例7：確認(rèn)cytotransmab穿透細(xì)胞溶膠的能力

圖7a顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)多種細(xì)胞系中的1-2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察的結(jié)果從而確認(rèn)其中輕鏈可變區(qū)用穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈區(qū)ht4vl替換的cytotransmab具有穿透細(xì)胞溶膠的能力。

具體地，在24孔板中將5×10⁴個(gè)hela、panc-1、ht29或mcf-7細(xì)胞/孔添加至0.5ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中且在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定化時(shí)，每個(gè)孔用1μmtmab4、阿達(dá)木單抗(humira)、貝伐單抗(avastin)、hut4或avat4各自在0.5ml新鮮培養(yǎng)基中的稀釋液在5％co2和37℃的條件下溫育6小時(shí)。然后去除培養(yǎng)基且每個(gè)孔用pbs洗滌且然后用弱酸性溶液(200mm甘氨酸,150mmnacl(ph2.5))處理以由細(xì)胞表面去除蛋白。用pbs洗滌后，將細(xì)胞在4％多聚甲醛中在25℃固定10分鐘。然后每個(gè)孔用pbs洗滌且用包含0.1％皂苷、0.1％疊氮化鈉和1％bsa的pbs緩沖液在25℃溫育10分鐘以在細(xì)胞膜中成孔。然后每個(gè)孔用pbs洗滌且然后用包含2％bsa的pbs緩沖液在25℃溫育1小時(shí)從而消除非特異性結(jié)合。然后每個(gè)孔用經(jīng)fitc(綠色熒光)標(biāo)記的特異性識(shí)別人fc的抗體在25℃溫育1.5小時(shí)且細(xì)胞核用hoechst33342進(jìn)行藍(lán)色染色且用共聚焦顯微鏡觀察。與igg形式的靶向于細(xì)胞外分泌的蛋白的單克隆抗體(阿達(dá)木單抗和貝伐單抗)不同的是，tmab4、hut4和avat4顯示出在細(xì)胞中的綠色熒光。

圖7b顯示了檢查數(shù)種細(xì)胞穿透細(xì)胞溶膠的能力的結(jié)果，其通過(guò)如圖7a所示的共聚焦顯微鏡觀察以減小的倍率進(jìn)行從而在細(xì)胞溶膠穿透能力檢查實(shí)驗(yàn)中檢查細(xì)胞穿透效率。

所證實(shí)的是，引入有穿透細(xì)胞溶膠的人源化輕鏈可變區(qū)的cytotransmab穿透所有細(xì)胞的細(xì)胞溶膠且定位在細(xì)胞溶膠中。

圖8a顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)tmab4的細(xì)胞穿透程度作為tmab4濃度的函數(shù)進(jìn)行觀察的結(jié)果。hela細(xì)胞用10nm、50nm、100nm、500nm、1μm和2μmtmab4處理且在37℃培養(yǎng)6小時(shí)。以與上述相同的方式用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞。當(dāng)將tmab4溫育6小時(shí)時(shí)，在細(xì)胞中觀察到綠色熒光，這始于100nm的濃度。隨著濃度由100nm增加，細(xì)胞中的綠色熒光增加。

圖8b顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)tmab4的細(xì)胞穿透程度作為tmab4處理后時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行觀察的結(jié)果。hela細(xì)胞用1μmtmab4處理且然后在37℃培養(yǎng)10分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。以與以上實(shí)施例所述相同的方式染色所培養(yǎng)的細(xì)胞且用共聚焦顯微鏡觀察。

tmab4由30分鐘開(kāi)始顯示出在細(xì)胞中的弱綠色熒光。綠色熒光逐漸增加且在6小時(shí)最強(qiáng)。然后熒光逐漸減小且在48小時(shí)變得非常弱。

實(shí)施例8：評(píng)估cytotransmabs的細(xì)胞毒性

為了檢查在實(shí)施例7中確認(rèn)能夠穿透細(xì)胞溶膠的cytotransmab是否在體外具有細(xì)胞毒性，hela或panc-1細(xì)胞用tmab4、hut4、阿達(dá)木單抗、avat4和貝伐單抗中的每種處理且通過(guò)mtt測(cè)定(sigma)檢查對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。

具體地，在96孔板中在5％co2和37℃的條件下在0.1ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中將1×10⁴個(gè)hela或panc-1細(xì)胞/孔培養(yǎng)12小時(shí)。然后每個(gè)孔用1μmtmab4、hut4、阿達(dá)木單抗、avat4和貝伐單抗各自處理20小時(shí)或44小時(shí)且然后將20μlmtt溶液(1mg/mlpbs)添加至每個(gè)孔中，然后溫育4小時(shí)。將所形成的甲臜溶于200μldmso(二甲基亞砜)中并測(cè)量在595nm的吸光度以確定細(xì)胞活力。

圖9a的圖顯示了通過(guò)在體外用cytotransmab處理hela和panc-1細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而獲得的結(jié)果。圖9b的圖像顯示了通過(guò)在體外用cytotransmab處理hela和panc-1細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞的抑制程度而獲得的結(jié)果。如圖9a和9b所示，所有抗體都沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性。如以上實(shí)施例6所示，與m3d8scfv不同的是，cytotransmab不具有核酸水解能力且因此不具有細(xì)胞毒性。

實(shí)施例9：確認(rèn)cytotransmab的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和降解機(jī)制

圖10顯示了通過(guò)脈沖追蹤和共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)引入的tmab4的轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定性進(jìn)行觀察的結(jié)果。

具體地，以與上述相同的方式制備hela細(xì)胞。所制備的細(xì)胞用3μmtmab4在37℃處理30分鐘且然后用pbs快速洗滌三次且在37℃在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)、6小時(shí)和18小時(shí)。細(xì)胞用pbs和弱酸性溶液以與以上實(shí)施例所述相同的方式洗滌且然后經(jīng)歷細(xì)胞固定、細(xì)胞穿孔和封閉過(guò)程。tmab4用經(jīng)綠色熒光(fitc)或紅色熒光(tritc)標(biāo)記的特異性識(shí)別人fc的抗體進(jìn)行染色。另外，細(xì)胞用針對(duì)早期內(nèi)體標(biāo)志物eea1(早期內(nèi)體抗原1)的抗eea1抗體、針對(duì)小窩體標(biāo)志物小窩蛋白-1的抗小窩蛋白-1抗體、針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物鈣聯(lián)接蛋白的抗鈣聯(lián)接蛋白抗體或針對(duì)高爾基體標(biāo)志物58k高爾基體蛋白的抗58k高爾基體抗體(santacruz)在4℃溫育12小時(shí)且用經(jīng)紅色熒光(tritc)標(biāo)記的第二抗體在25℃溫育1小時(shí)。在細(xì)胞固定前30分鐘，所培養(yǎng)的細(xì)胞用1μmreddnd-99或10μg/mlalexafluor488-轉(zhuǎn)鐵蛋白直接處理。染色操作后，用共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞。作為結(jié)果，tmab4在細(xì)胞中比轉(zhuǎn)鐵蛋白穩(wěn)定且穿透通過(guò)網(wǎng)格蛋白進(jìn)到細(xì)胞溶膠中且定位在早期內(nèi)體中至多2小時(shí)，然后其不被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中且不與任何細(xì)胞器疊加。

圖11a顯示了通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)cytotransmabtmab4或hut4的細(xì)胞溶膠定位進(jìn)行觀察的結(jié)果。

具體地，以與上述相同的方式制備hela細(xì)胞。所制備的細(xì)胞用5μmpbs、tmab4、阿達(dá)木單抗或hut4在不含有血清的培養(yǎng)基中在37℃溫育4小時(shí)。4小時(shí)后，含有pbs或所述抗體的每個(gè)孔用50μm鈣黃綠素處理且在37℃溫育2小時(shí)。用pbs洗滌后，細(xì)胞以與上述相同的方式固定且用共聚焦顯微鏡觀察。由此證實(shí)tmab4和hut4顯示出由內(nèi)體逃逸到細(xì)胞溶膠中的鈣黃綠素的綠色熒光。然而，阿達(dá)木單抗沒(méi)有顯示出在細(xì)胞溶膠中的綠色熒光。

圖11b的條形圖顯示了對(duì)圖11a所示共聚焦顯微鏡圖像的鈣黃綠素?zé)晒膺M(jìn)行定量的結(jié)果。

具體地，使用imagej軟件(nationalinstitutesofhealth,usa)在每種條件下選擇15個(gè)細(xì)胞且然后所獲得的熒光平均值以圖片顯示。

實(shí)施例10：通過(guò)gfp片段的重組來(lái)檢查cytotransmab的細(xì)胞溶膠保留

圖12a的示意圖顯示了以下過(guò)程，其中當(dāng)cytotransmab定位在細(xì)胞溶膠中時(shí)，觀察到由于經(jīng)分裂的gfp的互補(bǔ)締合而引起的gfp熒光。

具體地，為了直接確認(rèn)cytotransmab定位在細(xì)胞溶膠中而使用了經(jīng)分裂的gfp系統(tǒng)。若綠色熒光蛋白gfp被分裂成兩個(gè)片段(gfp1-10和gfp11)，則將失去熒光性質(zhì)且若兩個(gè)片段之間的距離變得較近從而它們彼此結(jié)合，則可恢復(fù)熒光性質(zhì)(cabantous等人,2005)。基于上述特征，在細(xì)胞溶膠中表達(dá)gfp1-10片段并使gfp11片段與cytotransmab的重鏈的c末端融合。因此，觀察到gfp熒光表明cytotransmab定位在細(xì)胞溶膠中。

另外，為了輔助經(jīng)分裂的gfp的互補(bǔ)締合而使用了具有較高親和力的鏈霉親和素-sbp2(鏈霉親和素結(jié)合肽2)(barrette-ng等人,2013)。經(jīng)由三個(gè)ggggs接頭通過(guò)遺傳工程化方法使具有較小尺寸的sbp2與gfp11片段的c末端融合。另外，經(jīng)由三個(gè)ggggs接頭通過(guò)遺傳工程化方法使鏈霉親和素與gfp1-10片段的n末端融合。為了實(shí)現(xiàn)該系統(tǒng)而開(kāi)發(fā)出表達(dá)鏈霉親和素-gfp1-10的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

具體地，將編碼鏈霉親和素-gfp1-10的dna通過(guò)sali/ecori克隆到慢病毒載體pljm1(addgene)中。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將3×10⁶個(gè)hek293t細(xì)胞添加至1ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中且在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。將40μllipofectamine2000(invitrogen,usa)添加至600μlopti-mem培養(yǎng)基(gibco)中且將所構(gòu)建的慢病毒載體和病毒包裝載體(pmdl、prsv或pvsv-g(addgene))小心地添加至其中且在室溫溫育20分鐘且然后添加至皿中。另外，將9ml不含有抗生素的dmem培養(yǎng)基添加至細(xì)胞，然后將其在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)6小時(shí)，然后培養(yǎng)基用10ml含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基替換，然后培養(yǎng)72小時(shí)。60小時(shí)后，將1×10⁵個(gè)hela細(xì)胞添加至1ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中且在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。對(duì)用慢病毒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基進(jìn)行充分過(guò)濾且將培養(yǎng)基中的病毒顆粒添加至所制備的包含hela細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。為了測(cè)量抗生素抗性，嘌呤霉素抗性基因用作選擇標(biāo)志物。

圖12b顯示了進(jìn)行western印跡分析以對(duì)所構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系中鏈霉親和素-gfp1-10的表達(dá)水平進(jìn)行分析的結(jié)果。

具體地，在6孔板中，將1×10⁵個(gè)hela細(xì)胞/孔添加至1ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中且在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)后，將溶胞緩沖液(10mmtris-hclph7.4,100mmnacl,1％sds,1mmedta,雞尾酒抑制劑(sigma))添加至細(xì)胞以獲得細(xì)胞裂解物。使用bca蛋白測(cè)定試劑盒(pierce)對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行定量。sds-page后，將凝膠轉(zhuǎn)移至pvdf膜并分別用識(shí)別鏈霉親和素和β-肌動(dòng)蛋白的抗體(santacruz)在25℃溫育2小時(shí)，然后將其用經(jīng)hrp綴合的第二抗體在25℃溫育1小時(shí)，然后進(jìn)行檢測(cè)。使用imagequantlas4000mini(gehealthcare)進(jìn)行分析。

實(shí)施例11：對(duì)gfp11-sbp2融合的cytotransmab進(jìn)行表達(dá)和純化

為了在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)gfp11-sbp2融合的cytotransmab，經(jīng)由三個(gè)ggggs接頭使gfp11-sbp2與重鏈的c末端融合。然后將對(duì)穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈和具有改進(jìn)的內(nèi)體逃逸的穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈進(jìn)行表達(dá)的動(dòng)物表達(dá)載體和對(duì)gfp11-sbp2融合的重鏈進(jìn)行表達(dá)的動(dòng)物表達(dá)載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到hek293f蛋白表達(dá)細(xì)胞中。然后以與實(shí)施例5所述相同的方式對(duì)gfp11-sbp2融合的穿透細(xì)胞溶膠的單克隆抗體進(jìn)行純化。

實(shí)施例12：通過(guò)細(xì)胞溶膠定位對(duì)gfp11-sbp2融合的cytotransmab的gfp熒光進(jìn)行檢查

圖12c顯示了對(duì)gfp11-sbp2融合的cytotransmab由于經(jīng)分裂的gfp的互補(bǔ)締合而引起的gfp熒光進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

具體地，以與實(shí)施例7所述相同的方式制備hela細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定化時(shí)，這些細(xì)胞用0.2、0.4、0.6、0.8和1μmpbs或tmab4-gfp11-sbp2在37℃培養(yǎng)6小時(shí)。根據(jù)與實(shí)施例7所述相同的方法，細(xì)胞用pbs和弱酸性溶液洗滌且然后固定。另外，細(xì)胞核用hoechst33342進(jìn)行藍(lán)色染色且用共聚焦顯微鏡觀察。觀察到tmab4在0.8μm和1μm顯示出gfp熒光。

上述結(jié)果清楚地表明cytotransmabtmab4穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中。

實(shí)施例13：通過(guò)高度多樣性人vh文庫(kù)對(duì)與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)進(jìn)行選擇

圖13的示意圖顯示了通過(guò)將僅具有穿透細(xì)胞溶膠的能力的完整igg形式的cytotransmab的重鏈可變區(qū)(vh)用與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)進(jìn)行替換來(lái)構(gòu)建抗ras·gtpimab的過(guò)程。

圖14顯示了僅具有穿透細(xì)胞溶膠的能力的igg形式的cytotransmab的施用且作為示意圖顯示了通過(guò)使用以下單克隆抗體(抗ras·gtpimab：內(nèi)化和干擾單克隆抗體)誘導(dǎo)特異性針對(duì)ras突變細(xì)胞的細(xì)胞毒性的策略，所述抗體具有用與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)(vh)替換的重鏈可變區(qū)且所述抗體穿透細(xì)胞且在細(xì)胞中與結(jié)合有g(shù)tp的ras特異性結(jié)合。

為了選擇待引入到抗ras·gtpimab中且與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的穩(wěn)定的人源化重鏈可變單結(jié)構(gòu)域(vh)而使用在先前的研究中構(gòu)建的酵母表達(dá)vh文庫(kù)(baekandkim,2014)。

具體地，所使用的文庫(kù)的fr(框架)為在常規(guī)抗體中最常使用的v基因ighv3-23*04,jh4且文庫(kù)中的cdr3具有9個(gè)殘基。文庫(kù)的構(gòu)建和酵母表面展示方法詳細(xì)描述在先前報(bào)道的論文(baek和kim,2014)中。

實(shí)施例14：制備gtp結(jié)合的krasg12d蛋白

為了制備用于文庫(kù)篩選和親和力分析的gtp結(jié)合的krasg12d抗原而在大腸桿菌中進(jìn)行的表達(dá)和純化詳細(xì)描述在先前報(bào)道的論文(tanakat等人,2007)中。

具體地，通過(guò)使用限制酶bamhi/ecori將對(duì)包含野生型kras和突變體krasg12d、krasg12v和krasg13d(以較高至較低突變頻率列出)各自的caax基序的殘基1-188進(jìn)行編碼的dna克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pgex-3x中。在本申請(qǐng)中，將表達(dá)載體設(shè)計(jì)成具有t7啟動(dòng)子-gst-kras。所有kras突變使用重疊pcr技術(shù)誘導(dǎo)且使用上述方法構(gòu)建表達(dá)載體。通過(guò)電穿孔將pgex-3x-kras載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中且在選擇培養(yǎng)基中選擇。在lb培養(yǎng)基中在100μg/ml氨芐西林抗生素存在下在37℃培養(yǎng)所選擇的大腸桿菌直至在600nm的吸光度達(dá)到0.6。然后將0.1mmiptg添加至其中用于蛋白表達(dá)且然后將大腸桿菌細(xì)胞在30℃再培養(yǎng)5小時(shí)。然后通過(guò)離心收集大腸桿菌細(xì)胞且然后通過(guò)超聲(sonics)破壞。所破壞的大腸桿菌細(xì)胞通過(guò)離心去除并收集剩余的上清液且使用特異性純化gst標(biāo)簽蛋白的谷胱甘肽樹(shù)脂(clontech)純化。谷胱甘肽樹(shù)脂用50ml洗滌緩沖液(140mmnacl,2.7mmkcl,10mmnah2po4,1.8mmkh2po4,1mmedta,2mmmgcl2ph7.4)(sigma)洗滌且然后蛋白用洗脫緩沖液(50mmtris-hclph8.0,10mm還原型谷胱甘肽,1mmdtt,2mmmgcl2)(sigma)洗脫。對(duì)所洗脫的蛋白進(jìn)行透析以將緩沖液用儲(chǔ)存緩沖液(50mmtris-hclph8.0,1mmdtt,2mmmgcl2)(sigma)替換。通過(guò)測(cè)量在280nm的吸光度和吸光系數(shù)對(duì)所純化的蛋白進(jìn)行定量。sds-page分析表明蛋白具有約98％或更高的純度。

然后為了使gtpλs(millipore)或gdp(millipore)底物與kras蛋白結(jié)合，使kras與底物以1:20的分子比例在反應(yīng)緩沖液(50mmtris-hclph8.0,1mmdtt,5mmmgcl2,15mmedta)(sigma)中在30℃反應(yīng)30分鐘并向其中添加60mmmgcl2以停止反應(yīng)且然后儲(chǔ)存在-80℃。

實(shí)施例15：對(duì)特異性針對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d的重鏈可變區(qū)(vh)進(jìn)行選擇

圖15的示意圖顯示了獲得僅對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d蛋白具有高親和力的人源化抗體重鏈可變單結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)篩選策略。

具體地，對(duì)實(shí)施例14所純化的gtp結(jié)合的krasg12d進(jìn)行生物素化(ez-link^tmsulfo-nhs-lc-biotinylation試劑盒(pierceinc.,usa))且然后與在酵母細(xì)胞表面上展示的重鏈可變區(qū)文庫(kù)在室溫反應(yīng)1小時(shí)。使酵母細(xì)胞表面上與生物素化的結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d反應(yīng)的重鏈可變區(qū)文庫(kù)與鏈霉親和素(microbead^tm(miltenyibiotec)在4℃反應(yīng)20分鐘且然后使用macs(磁力活化細(xì)胞分選)來(lái)富集展示出對(duì)gtp-krasg12d具有高親和力的重鏈可變區(qū)的酵母。將所選擇的文庫(kù)展示酵母在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)且在sg-caa+ura培養(yǎng)基(20g/l半乳糖,6.7g/l不含有氨基酸的酵母氮堿,5.4g/lna2hpo4,8.6g/lnah2po4,5g/l酪蛋白氨基酸,0.2mg/l尿嘧啶)(sigma)中培養(yǎng)以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。然后將酵母與以比結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d高10倍的濃度與單獨(dú)的結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d或非生物素化的結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d抗原競(jìng)爭(zhēng)性地展示文庫(kù)的酵母在室溫溫育1小時(shí)，然后使其與綴合有pe的鏈霉親和素(鏈霉親和素-r-藻紅蛋白綴合物(sa-pe)(invitrogen)反應(yīng)且通過(guò)facs(熒光活化細(xì)胞分選)(facscaliber)(bdbiosciences)富集。通過(guò)facs分析對(duì)篩選條件進(jìn)行選擇后，使抗原與展示所富集的文庫(kù)的酵母在與所述相同的條件下結(jié)合且然后使用facsariaii分選儀富集酵母。使通過(guò)第一macs和第一facs篩選富集的人源化重鏈區(qū)文庫(kù)與分泌穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變單結(jié)構(gòu)域(ht4vl)的酵母配對(duì)并以fab形式展示在酵母表面上且然后經(jīng)歷第二facs和第三facs篩選。

具體地，為了構(gòu)建待與重鏈可變域(vh)文庫(kù)配對(duì)并分泌穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈可變域(vl)的酵母，通過(guò)限制酶nhei和bsiwi將編碼穿透細(xì)胞溶膠的ht4vl的dna克隆到輕鏈可變域酵母分泌載體pyds-k中由此獲得pyds-k-ht4vl。通過(guò)電穿孔將所獲得的pyds-k-ht4vl轉(zhuǎn)化到配對(duì)α-型酵母配對(duì)株yvh10中且與在選擇培養(yǎng)基sd-caa+trp(20g/l葡萄糖,6.7g/l不含有氨基酸的酵母氮堿,5.4g/lna2hpo4,8.6g/lnah2po4,5g/l酪蛋白氨基酸,0.4mg/l色氨酸)(sigma)中培養(yǎng)的酵母配對(duì)。

具體地，就酵母配對(duì)而言，當(dāng)在600nm的吸光度為1時(shí)存在1×10⁷個(gè)酵母細(xì)胞。在所培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中，將表達(dá)所選重鏈可變域文庫(kù)的1.5×10⁷個(gè)酵母細(xì)胞和包含ht4vl的1.5×10⁷個(gè)酵母細(xì)胞添加至gtp結(jié)合的krasg12d且用ypd(20g/l右旋糖,20g/l蛋白胨,10g/l酵母提取物,14.7g/l檸檬酸鈉,4.29g/l檸檬酸,ph4.5)(sigma)洗滌三次。然后將酵母細(xì)胞重新混懸在100μlypd中并滴到y(tǒng)pd板上而不鋪開(kāi)，然后干燥這些酵母細(xì)胞且在30℃培養(yǎng)6小時(shí)。然后涂覆有干燥的酵母的部分用ypd培養(yǎng)基洗滌三次且然后在選擇培養(yǎng)基sd-caa中在30℃溫育24小時(shí)至最終酵母濃度為1×10⁶個(gè)細(xì)胞或更少且僅選擇配對(duì)的酵母細(xì)胞。將所選擇的酵母細(xì)胞在sg-caa培養(yǎng)基中溫育以誘導(dǎo)人源化抗體fab片段的表達(dá)且通過(guò)第二和第三facs富集從而使酵母細(xì)胞在結(jié)合有g(shù)dp的krasg12d的濃度為100nm時(shí)與結(jié)合有g(shù)dp的krasg12d具有100倍競(jìng)爭(zhēng)性。

圖16顯示了在獲得對(duì)結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d的高親和力的上述篩選過(guò)程的每個(gè)步驟中對(duì)單獨(dú)的結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d的條件下和與結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d競(jìng)爭(zhēng)的條件下的結(jié)合進(jìn)行facs分析的結(jié)果。由此發(fā)現(xiàn)的是，可選擇出可按重鏈可變域(vh)依賴(lài)性方式與結(jié)合有g(shù)tp的krasg12d特異性結(jié)合的文庫(kù)。

在上述高通量篩選中，最終通過(guò)各個(gè)克隆分析從對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d蛋白具有高親和力和特異性的文庫(kù)中選擇出rt4克隆。

下表4和5顯示了與活化的ras結(jié)合的重鏈可變域的序列信息和seqidno。表4顯示了根據(jù)kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的rt4的全長(zhǎng)序列且表5顯示了表4所示抗體序列的cdr序列。

表4：與活化的ras結(jié)合的重鏈可變域rt4的全長(zhǎng)序列

表5：與活化的ras結(jié)合的重鏈可變域rt4的cdr序列

實(shí)施例16：表達(dá)和純化抗ras·gtpimab且分析對(duì)kras突變的親和力

為了在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)作為如以上實(shí)施例5所述那樣將穿透細(xì)胞且定位在細(xì)胞溶膠中的cytotransmab的重鏈可變區(qū)(vh)用實(shí)施例13所選擇的rt4vh進(jìn)行替換的結(jié)果可穿透細(xì)胞且在細(xì)胞中特異性靶向于gtp結(jié)合的ras的抗ras·gtpimab，通過(guò)noti/hindiii將具有與5’末端融合的編碼分泌肽的dna并包含與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的rt4重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)(ch1-鉸鏈-ch2-ch3)的dna克隆到pcdna3.4載體(invitrogen)中。然后將編碼穿透細(xì)胞溶膠的輕鏈的動(dòng)物表達(dá)載體和所構(gòu)建的對(duì)包含與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)的重鏈進(jìn)行編碼的動(dòng)物表達(dá)載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到表達(dá)蛋白的hek293f細(xì)胞中。然后以與實(shí)施例5所述相同的方式純化抗ras·gtpimab。

圖17顯示了純化后通過(guò)12％sds-page在還原或非還原條件下分析抗ras·gtpimabrt4的結(jié)果。

具體地，在非還原條件下出現(xiàn)約150kda的分子量且在還原條件下出現(xiàn)約50kda的重鏈分子量和約25kda的輕鏈分子量。這表明所表達(dá)和純化的抗ras·gtpimab在不具有非共價(jià)鍵的溶液狀態(tài)下以單體形式存在且不通過(guò)非天然二硫鍵形成二聚體或低聚體。

圖18顯示了進(jìn)行elisa以測(cè)量對(duì)gtp結(jié)合的和gdp結(jié)合的野生型kras及gtp結(jié)合的和gdp結(jié)合的kras突變體(krasg12d、krasg12v和krasg13d)的親和力的結(jié)果。

具體地，將作為靶分子的gtp結(jié)合的kras突變體和gdp結(jié)合的kras突變體各自在96孔eia/ria板(costarcorning)中在37℃溫育1小時(shí)且然后板用0.1％tbst(0.1％吐溫20,ph7.4,137mmnacl,12mmtris,2.7mmkcl,5mmmgcl2)(sigma)以10分鐘洗滌三次。然后板的每個(gè)孔用4％tbsb(4％bsa,ph7.4,137mmnacl,12mmtris,2.7mmkcl,10mmmgcl2)(sigma)溫育1小時(shí)且然后用0.1％tbst以10分鐘洗滌三次。然后每個(gè)孔用在4％tbsb中以不同濃度稀釋的抗ras·gtpimabrt4(和僅具有穿透細(xì)胞溶膠的能力而不具有ras結(jié)合能力的cytotransmabtmab4)溫育，然后每個(gè)孔用0.1％pbst以10分鐘洗滌三次。山羊堿性磷酸酶綴合的抗人mab(sigma)用作標(biāo)志物抗體。每個(gè)孔用pnpp(棕櫚酸對(duì)硝基苯基酯)(sigma)處理并測(cè)量在405nm的吸光度。

為了進(jìn)一步定量分析抗ras·gtpimabrt4對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d的親和力，使用biacore2000儀器(gehealthcare)進(jìn)行spr(表面等離子體共振)。

具體地，在10mm乙酸鈉緩沖液(ph4.0)中稀釋抗ras·gtpimabrt4且以約1100響應(yīng)單位(ru)的濃度固定在cm5傳感器芯片(gehealthcare)上。為了分析，以30μl/min的流速?zèng)_洗tris緩沖液(20mmtris-hcl,ph8.0,100mmnacl,5mmmgcl2,0.005％吐溫20)并以1000nm-62.5nm的濃度使用gtp結(jié)合的krasg12d。對(duì)締合和解離進(jìn)行分析后，通過(guò)以30μl/min的流速?zèng)_洗緩沖液(10mmnaoh,1mnacl,ph10.0)1.5分鐘使cm5芯片再生。對(duì)在締合3分鐘和解離3分鐘獲得的每張傳感圖進(jìn)行歸一化并扣除空白細(xì)胞由此確定親和力。

圖19顯示了通過(guò)使用spr(biacore2000)(gehealthcare)分析抗ras·gtpimabrt4對(duì)gtp結(jié)合的krasg12d的親和力的結(jié)果。

實(shí)施例17：檢查抗ras·gtpimabrt4穿透細(xì)胞溶膠的能力

圖20顯示了進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察以檢查抗ras·gtpimabrt4穿透細(xì)胞溶膠的能力的結(jié)果。

在具有突變的kras的細(xì)胞系(panc-1和hct116)和具有野生型kras的細(xì)胞系(ht29、hela)中分析了抗ras·gtpimabrt4穿透細(xì)胞的能力。

具體地，將每種細(xì)胞系以5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔的密度添加至24孔板中且在0.5ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定化時(shí)，將在0.5ml新鮮培養(yǎng)基中以1μm的濃度稀釋的tmab4和rt4各自添加至每個(gè)孔中，然后在5％co2和37℃的條件下溫育6小時(shí)。后續(xù)操作以與實(shí)施例7所述染色操作相同的方式進(jìn)行。觀察到抗ras·gtpimab顯示出在細(xì)胞中的熒光，這表明cytotransmab沒(méi)有喪失其穿透細(xì)胞溶膠的能力，即使在其用與結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合的重鏈可變區(qū)替換后。

實(shí)施例18：評(píng)估抗ras·gtpimabrt4的細(xì)胞毒性

(1)評(píng)估抗ras·gtpimab對(duì)粘附細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖21顯示了通過(guò)在體外用抗ras·gtpimabrt4處理nih3t3、nih3t3krasg12v和nih3t3hrasg12v細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而獲得的結(jié)果。

具體地，為了檢查抗ras·gtpimab是否在體外具有特異性針對(duì)kras突變體依賴(lài)性細(xì)胞的細(xì)胞毒性，野生型krasnih3t3小鼠成纖維細(xì)胞、具有人工過(guò)表達(dá)的ras突變體的nih3t3krasg12v細(xì)胞、nih3t3hrasg12v突變細(xì)胞和krasg13d突變體人胰腺細(xì)胞(panc-1)用1μmtmab4和rt4中的每種處理且評(píng)估對(duì)粘附細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。

具體地，將每種類(lèi)型的nih3t3和panc-1細(xì)胞以2×10³個(gè)細(xì)胞/孔的密度添加至24孔板中且在0.5ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。然后細(xì)胞用1μmtmab4或rt4處理兩次每次72小時(shí)且觀察共144小時(shí)且然后對(duì)活細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)由此確定細(xì)胞生長(zhǎng)程度。

如圖21所示，用tmab4處理的細(xì)胞沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性，而rt4抑制kras突變細(xì)胞系(nih3t3krasg12v和nih3t3hrasg12v)的生長(zhǎng)且nih3t3細(xì)胞沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性。還抑制了krasg13d突變體panc-1細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，tmab4不具有細(xì)胞毒性，而rt4抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

(2)評(píng)估抗ras·gtpimabrt4對(duì)非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

圖22顯示了在nih3t3hrasg12v細(xì)胞系中評(píng)估對(duì)非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制的結(jié)果。

具體地，為了檢查抗ras·gtpimab是否在kras突變細(xì)胞中抑制非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)集落形成測(cè)定對(duì)nih3t3hrasg12v突變細(xì)胞進(jìn)行分析。具體地，將0.5ml2×dmem培養(yǎng)基和0.5ml1％瓊脂糖溶液的混合物鋪板在12孔板上并硬化以形成0.5％凝膠。然后將0.4ml2×dmem培養(yǎng)基、0.5ml0.7％瓊脂糖和0.05ml1×10³個(gè)nih3t3hrasg12v細(xì)胞與0.05ml(20μm)pbs、tmab4、rt4或lonafarnib(20μm)混合且將混合物鋪板在0.5％瓊脂糖凝膠上并硬化。然后0.35％瓊脂糖凝膠用1μmpbs、tmab4、rt4或lonafarnib在0.5ml1×dmem中的分散液以3天間隔處理共21天。在第21天，細(xì)胞用nbt(硝基藍(lán)四唑鎓)溶液染色且然后對(duì)集落的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

與就對(duì)粘附細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制所進(jìn)行的上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類(lèi)似的是，rt4抑制集落形成，而tmab4不抑制集落形成。

上述結(jié)果表明抗ras·gtpimabrt4與細(xì)胞溶膠中的ras突變體特異性結(jié)合且抑制粘附和非粘附細(xì)胞生長(zhǎng)。

實(shí)施例19：檢查抗ras·gtpimabrt4是否與細(xì)胞中結(jié)合有g(shù)tp的kras特異性結(jié)合

圖23顯示了抗ras·gtpimabrt4是否與細(xì)胞中活化的hrasg12v突變體疊加的結(jié)果。圖24顯示了對(duì)抗ras·gtpimabrt4是否與細(xì)胞中結(jié)合有g(shù)tp的krasg12v突變體疊加進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。

具體地，24孔板用纖連蛋白(sigma)涂覆且然后將0.5ml表達(dá)mcherry(紅色熒光)hrasg12v或mcherry(紅色熒光)krasg12v的nih3t3細(xì)胞的稀釋液以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔的密度添加至板中且在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。然后細(xì)胞用2μmtmab4和rt4中的每種處理且在37℃培養(yǎng)12小時(shí)。然后細(xì)胞在與實(shí)施例7所述相同的條件下染色且用共聚焦顯微鏡觀察。

如圖23和24所示，綠色熒光的rt4與紅色熒光的活化的ras所處的細(xì)胞內(nèi)膜疊加，而tmab沒(méi)有疊加。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗ras·gtpimabrt4與細(xì)胞中結(jié)合有g(shù)tp的ras特異性結(jié)合。

實(shí)施例20：評(píng)估rgd融合的抗ras·gtpimabrt4的細(xì)胞毒性

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)需要賦予腫瘤組織特異性。常規(guī)的cytotransmab與細(xì)胞表面上的hspg結(jié)合且不具有針對(duì)任何其它腫瘤組織的特異性且由于該原因而不能在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中特異性抑制腫瘤生長(zhǎng)。為了克服該問(wèn)題，經(jīng)由一個(gè)ggggs接頭通過(guò)遺傳工程化方法使對(duì)在血管生成細(xì)胞和多種腫瘤中過(guò)表達(dá)的整聯(lián)蛋白αvβ3具有特異性的rgd4c肽(cdcrgdcfc；seqidno:17)與輕鏈的n末端融合。rgd4c肽的特征在于其具有比常規(guī)的rgd肽高的親和力且可使用遺傳工程化方法融合且可維持其特異性結(jié)構(gòu)，即使當(dāng)其與n末端融合時(shí)(koivunene等人,1995)。

圖25顯示了通過(guò)在體外用rgd-tmab4和rgd-rt4處理hct116和panc-1細(xì)胞系且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而獲得的結(jié)果。

為了檢查rgd-tmab4和rgd-rt4本身是否在體外具有細(xì)胞毒性，具有krasg13d突變體的人結(jié)腸直腸癌hct116細(xì)胞和具有krasg12d突變體的人胰腺癌panc-1細(xì)胞用rgd-tmab4和rgd-rt4中的每種處理且評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。

具體地，將每種類(lèi)型的hct116和panc-1細(xì)胞以5×10³個(gè)細(xì)胞/孔的密度添加至24孔板中且在0.5ml含有10％fbs的培養(yǎng)基中在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。然后細(xì)胞用1μmrgd-tmab4和rgd-rt4中的每種處理兩次每次72小時(shí)且觀察共144小時(shí)且然后對(duì)細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)由此確定細(xì)胞生長(zhǎng)程度。

如圖25所示，rgd-tmab4將hct116細(xì)胞生長(zhǎng)抑制約20％且將panc-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制約15％且rgd-rt4將hct116和panc-1細(xì)胞生長(zhǎng)分別抑制約40％和約50％。根據(jù)先前的研究，rgd4c肽對(duì)整聯(lián)蛋白αvβ5所具有的親和力為對(duì)整聯(lián)蛋白αvβ3的親和力的約1/3。然而，整聯(lián)蛋白αvβ3主要在血管生成細(xì)胞中過(guò)表達(dá)且整聯(lián)蛋白αvβ5在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。因此，rgd4c肽具有與hct116和panc-1細(xì)胞的αvβ5結(jié)合的能力由此抑制細(xì)胞粘附(caol等人,2008)。

因此，rgd4c肽融合的tmab4沒(méi)有表現(xiàn)出具有細(xì)胞毒性。另外，在rgd-tmab4和rgd-rt4之間進(jìn)行的比較間接確認(rèn)了tmab4可抑制ras特異性細(xì)胞生長(zhǎng)，即使當(dāng)rgd與其融合時(shí)。

實(shí)施例21：檢查rgd融合的抗ras·gtpimab在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的作用

圖26a顯示了在異種移植有hct116細(xì)胞的小鼠中對(duì)rgd融合的抗ras·gtpimabrt4的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用進(jìn)行分析的結(jié)果。圖26b的圖顯示了測(cè)量小鼠體重從而檢查rgd融合的抗ras·gtpimabrt4的非特異性副作用的結(jié)果。

具體地，為了基于實(shí)施例20的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢查rgd-rt4在體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用，將krasg13d突變體人結(jié)腸直腸hct116細(xì)胞以5×10⁶個(gè)細(xì)胞/小鼠的密度皮下注射到balb/c裸鼠中。約6天后，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約50mm³時(shí)，小鼠被靜脈內(nèi)注射20mg/kgpbs、rgd-tmab4和rgd-rt4中的每種。歷時(shí)18天以2天間隔共進(jìn)行9次注射且使用卡尺測(cè)量腫瘤體積。

如圖26a所示，與對(duì)照pbs不同的是，rgd-tmab4和rgd-rt4抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)且rgd-rt4與rgd-tmab4相比更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。另外，如圖26b所示，在用rgd-rt4處理的測(cè)試組中不存在體重變化，這表明rgd-rt4不具有其它毒性。

序列表

<110>奧隆制藥

<120>通過(guò)使抗體穿透細(xì)胞膜將具有完全免疫球蛋白形式的抗體定位在細(xì)胞質(zhì)中的方法及其用途

<130>pf-b1811

<140>pct/kr2015/007626

<141>2015-07-22

<150>10-2014-0092673

<151>2014-07-22

<150>10-2015-0103163

<151>2015-07-21

<160>17

<170>patentinversion3.2

<210>1

<211>114

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht2vl

<400>1

aspleuvalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

alaproargleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyile

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleugluprogluaspphealavaltyrtyrcyslysgln

859095

sertyrtyrhismettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>2

<211>114

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht3vl

<400>2

aspleuvalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcyslysgln

859095

sertyrtyrhismettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>3

<211>114

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht4vl

<400>3

aspleuvalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcyslysserserglnserleupheasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglylys

354045

alaprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proserargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrtyrhismettyrthrpheglyglnglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

<210>4

<211>17

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht2vlcdr1

<400>4

lysserserglnserleupheasnserargthrarglysasntyrleu

151015

ala

<210>5

<211>7

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht2vlcdr2

<400>5

trpalaserthrarggluser

15

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht2vlcdr3

<400>6

lysglnsertyrtyrhismettyrthr

15

<210>7

<211>17

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht3vlcdr1

<400>7

lysserserglnserleupheasnserargthrarglysasntyrleu

151015

ala

<210>8

<211>7

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht3vlcdr2

<400>8

trpalaserthrarggluser

15

<210>9

<211>9

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht3vlcdr3

<400>9

lysglnsertyrtyrhismettyrthr

15

<210>10

<211>17

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht4vlcdr1

<400>10

lysserserglnserleupheasnserargthrarglysasntyrleu

151015

ala

<210>11

<211>7

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht4vlcdr2

<400>11

trpalaserthrarggluser

15

<210>12

<211>9

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>ht4vlcdr3

<400>12

glnglntyrtyrtyrhismettyrthr

15

<210>13

<211>118

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>rt4

<400>13

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serthrileserargserglyhisserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysargpheglyserilevalpheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserser

115

<210>14

<211>5

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>rt4cdr1

<400>14

sertyralametser

15

<210>15

<211>17

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>rt4cdr2

<400>15

thrileserargserglyhisserthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>16

<211>9

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>rt4cdr3

<400>16

argpheglyserilevalpheasptyr

15

<210>17

<211>9

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>rgd4c

<400>17

cysaspcysargglyaspcysphecys

15