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除去抗A、抗B抗體以及多反應性免疫球蛋白IgG的免疫球蛋白G(IgG)濃縮物的制作方法

文檔序號:1124287閱讀:310來源:國知局

專利名稱::除去抗A、抗B抗體以及多反應性免疫球蛋白IgG的免疫球蛋白G(IgG)濃縮物的制作方法
技術領域
:本發(fā)明涉及除去抗A(AcaA)和抗B(AcaB)抗體的免疫球蛋白G(IgG)濃縮物,其具有明顯降低的多反應性,以及涉及獲得上述濃縮物的方法。
背景技術
:自從Cohn研制出乙醇沉淀法,富集免疫球蛋白(Ig)成分的人血漿用于各種感染或者先天性缺陷疾病的治療(Cohn等,1946,J.Am.Chem.Soc.68,459;Oncley等,1949,J.AmChem.Soc.71,541).對用于靜脈注射(IgIV)的高純化Ig復合結構的需求越來越多,例如從人血漿中獲得。免疫球蛋白的絡合物結構(由二硫鍵連接的四肽鏈),以及來自于數(shù)千供血者的血漿混合物中存在著的各種抗體,成為目前不能夠促進免疫球蛋白生物技術發(fā)展的因素。雖然通過基因工程生產(chǎn)單克隆抗體,它們的極端特異性對治療應用相當于一個缺點,在治療應用中多種特異性顯得是必需的。另一方面,例如,在近些年來的歐洲和美國,例如源自身免疫的許多病理,目前用IgG濃縮物治療會導致它的一個缺陷。獲得免疫球蛋白尤其是IgG濃縮物的方法,除了用乙醇使蛋白選擇性沉淀,也可以包含其它各種方法,例如聚乙二醇沉淀法,受控蛋白水解酶法處理......用于除去免疫球蛋白聚合物中的聚集體,這些局集體可以激活與過壽文反應危險相關的補充系統(tǒng)。同時,在體內(nèi)存在于IgGIV中的二聚體和動脈壓下降相關(BleekerW.K.等,Blood,95,2000,p.1856-1861).Steinbuch等已描述了一種可選擇的方法是乙醇沉淀法(Rev.Fran9.Et.Clin,etBiol,1969,XIV,1054),其依賴于辛酸沉淀。這種酸沉淀了絕大多數(shù)的血漿蛋白,并把免疫球蛋白留在上層清液中。通過陰離子交換劑DEAE纖維素來提純這些免疫球蛋白,提純的條件是該陰離子交換劑不保留IgG。接著對非保留IgG的成分進行濃縮。同時使用色譜技術已經(jīng)研發(fā)了各種方法增加產(chǎn)品的純度。特別提及是的專利申請EP0703922和WO99/64462,其為至少兩個相關聯(lián)的連續(xù)色譜分析步驟,一個使用陰離子交換,另一個使用陽離子交換。這些方法的特異性在于該陰離子交換劑的性能,在傳統(tǒng)的色譜分析條件下不會阻留免疫球蛋白G,但是它們反而在預提純步驟中固定共純化大多數(shù)其它蛋白。也可以引用由申請人提交的類似專利申請WO02/092632,其公開了在陰離子交換劑上,在堿性pH下使用單個色鐠分析步驟制備Ig濃縮物,在色譜分離介質上將它們固定。然而,許多科學刊物指出通過上述分鎦技術獲得的IgG的注射會導致接受治療的患者偶爾會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,有時還很嚴重。例如,可以引用以下文獻BuchtaC等,Biologicals,33,2005,41-48,WilsonJ.R.等,Muscle&Nerve,29(9),1997,1142-1145,CopelanE.A.等,Transfusion,26,1986,410-412andMisbahS,A.等,DrugSafety,9,1993,254-262.對患有溶血的病人血液影響的研究,尤其是使用直接抗人球蛋白試驗(直接抗人球蛋白試驗-DCT)進行的研究,顯示紅細胞表面被直接抑制抗原A、B或者D的免疫球蛋白覆蓋,因此導致溶血。這就是為什么在市場上可得到的IgG是通過選擇性血漿獲得的,以避免存在抗-D免疫球蛋白,或在抗體-A或抗體-B中滴定度高的其他抗體。Buchta等引用上述文獻,考慮通過不同途徑使源于O和B血型供體的抗A抗體、源于O和A血型供體的抗B抗體和血漿衍生物例如IgG顯著減少,這是為了使溶血的風險降到最低,當使用這些血漿衍生物治療患者的時候,該溶血風險與這些抗體的水平直接相關。特別要正視選擇供體,去除抗A和抗B抗體,生產(chǎn)源于特定血型(A和/或B血型)血漿的衍生物,以及排除那些具有高滴定度抗A和抗B抗體的血漿的批次??紤]到成本或提取步驟的復雜性,一些方法被認為是不現(xiàn)實的。應當注意在上述乙醇分餾期間,部分除去了抗A和抗B抗體。由于對IgG的需求不斷地增加,也就需要逐漸增大的供者庫,統(tǒng)計學上將包括更多的O型血的供者。因此,血漿衍生物如IgG將包含大量抗A和抗B抗體,由于這些抗體的濃度太高,通過傳統(tǒng)分餾很難去除。這些增加的需求使得只從AB血型中選擇以確保低含量的抗A和抗B抗體成為不可能。在使用歐洲藥典(1997)的2.6.20實驗時,每批純化的IgG濃縮物或制備受抗A和抗B抗體限制,該實驗是間接Coombs測試(間接Coombs測試-ICT)的體外應用。ICT測試包括加入紅細胞懸液,涂以包含于IgG濃縮物的IgG型抗A和抗B抗體,IgG濃縮物是一種針對人IgG的抗體(抗球蛋白)溶液。與抗A和抗B抗體結合的這些抗體附著于紅細胞,因此導致通過IgG之間橋結構形成凝集??笰和抗B抗體的含量檢測受到了血液血清試驗(Coombs試驗)中常規(guī)試驗直接啟發(fā)。依照歐洲藥典,在稀釋比為1:64、IgG溶液的起始濃度減少至30g/l進行的ICT測試條件下,IgIV不能顯示A或B型紅細胞的任何凝集。這就是被測試的IgG樣品必須稀釋以達到滴定度的原因,即最后稀釋數(shù)值不再引起凝集反應。依據(jù)歐洲藥典,IglV溶液的陰性ICT結果為低于l:64稀釋度,該結果表明抗A和抗B抗體的低含量是可接受的。然而,歐洲藥典規(guī)定,即使IgG濃縮物在實驗中得到陰性結果,即其稀釋度低于1:64,仍不能夠排除溶血反應的危險(Buchta等,如上所引)。應指出美國和日本的藥典沒有對需要控制抗A和抗B抗體剩余含量進行規(guī)定。如上所述,用乙醇分餾法在制備IgG濃縮物期間抗A和抗B抗體—皮部分除去,然而,其剩余含量可能超過了歐洲藥典規(guī)定的上限。另外,依據(jù)申請人在其專利申請WO02/092632中描述研究的方法制備的濃縮物的抗A和抗B抗體剩余含量比通過乙醇分餾法制備的濃縮物的剩余含量含量更高。由于一些批次的IgG濃縮物的抗A和抗B抗體的含量超過了歐洲藥典限定值,因此需要對IgG濃縮物進行額外的純化。一種除去IgG濃縮物中抗體的方法,其包括使用免疫吸附劑作為基質,用親和色譜法純化類似于A和B血型抗原的低聚糖,所述的低聚糖具體的是接枝在色譜基質上的三糖。例如,由MazidM.A.等,J.Appl.Biomater.,3(1),1992,9-15出版的刊物,提及使用含有二氧化硅顆粒的色析法介質,其表面接枝了合成低聚糖的半抗原,其特征為A和B型血,尤其是A型-三糖。此外,HoutM.S.等(ASAIOJ,46(6),2000,702-706)描述了用特定的抗A和抗B抗原接枝的管狀纖維膜除去全血中的抗A和抗B抗體。也有報告指出,色析法介質性質非常穩(wěn)定,這限制了所關注濃縮物中的殘留半抗原的釋;^文。專利申請WO01/27623描述了一種獲得A和B血型中去特異性抗體血漿的方法,即一種適合于任意接受者的血漿。這些特異性抗體實質上是免疫球蛋白M(IgM)所攜帶的。去特異性的獲得包括先通過與A血型試驗性親和性高的介質,然后通過與B血型試驗性親和性高的介質。如果同時出現(xiàn)抗A和抗B(O型血),則有必要連續(xù)通過兩種介質載體。市場購買IgG濃縮物的一個其它特征是它們的多反應性。應想起多克隆抗體如IgG通常與單個抗原決定基(抗原基序)以獨特的方式結合。然而,這種抗體嚴格特異性有時候可以延伸至其它抗原基序,然而,與第二抗原表位的親和性比與名義上的基序的親和性要弱。多克隆IgG可以對具有如肌動蛋白、肌球蛋白、三硝基苯基修飾白蛋白的結構作出更大或更少程度的反應。在這一方面,通過多克隆人類IgG制備靜脈注射用的免疫球蛋白(IgIV),其包括-直接抑制外部抗原和由免疫過程產(chǎn)生的免疫抗體;-識別細胞內(nèi)的蛋白、表面膜抗原、自身循環(huán)蛋白和其它抗體可變區(qū)的天然抗體。后者則稱為抗個體型抗體(KazatchkineM.D.等,Immunol.Rev.,139,1994,79-107).天然抗體不是由目的性免疫法導致的(CoutinhoA.等,Curr.Opin.Immunol.,7,1995,812-818)。由于表現(xiàn)出對自體抗原不同的親合性,因此具有多反應性(BememanA.等,Eur丄Immunol.,22,1992,625-631andLacroix國Desmazes等,J.Immunol.Methods,216,1988,117-137)。IglV的化學處理(6M尿素、1.3M硫氰酸鈉和酸處理pH^2.0)可以增加這些多克隆免疫球蛋白多反應性活性(BouvetJ.P."a/,J.Autoimmun.,16(2):2001,163-172)。然而,用所述的免疫球蛋白治療患者不曾證明其有益的效果??傊谥苽銲gIV過程中抗體的多反應性活性歸結如下-在各自血漿中存在天然抗體,-在各自血漿中存在抗個體型抗體,-制備方法產(chǎn)生的抗體的多反應性。因此,一些學者認為多反應性是IgG內(nèi)在特性,因此天生存在于人體內(nèi)。另一些學者證明了純化單克隆或多克隆IgG能夠顯示其純化前未檢測出的多反應性。甚至從血漿中制備IgG的方法也會產(chǎn)生多反應性,其轉變?yōu)檠趸?應激"和在制備過程中IgG的部分羥基化作用。這被BouvetJ.P等證實,JournalofAutoimmunity,16,2001,pp.163-172,他特別用尿素來處理多克隆IgG而使其變得更高的多反應性,在該文件中,也指出了臨床應用中IgG的部分療效歸因于它們的多反應性。因此可以通過天然多反應性IgG和常規(guī)提純法獲得的多反應性IgG說明這些IgG濃縮物多反應性,這占所有多價^0的0.5%-1%。使用IgG制劑來治療患者可能需要最多至l-2g/kg的高劑量給藥。這些劑量為短期治療,例如,一天7-10倍患者生理IgG量。結果,通過IgG濃縮物生產(chǎn)方法產(chǎn)生的多反應性IgG的給藥水平可導致不良副作用如發(fā)燒、惡心或頭疼。因此,必需進行天然抗體多反應性和抗個體型抗體的區(qū)分,如申請人在其專利申請EP1059088中所示,通過制備方法產(chǎn)生的抗體具有優(yōu)點。申請人在其專利申請EP1059088已顯示在血漿中含天然多反應性IgG的成分,是從人多價IgIV分離出來,由于需要更小劑量的成分,在治療特定炎性疾病如類風濕性多發(fā)性關節(jié)炎上有優(yōu)勢。因此,為了避免紅細胞溶血反應和在治療過程中給予大劑量的IgG而產(chǎn)生的相關副作用,看起來需要使用用于治療的特別用于靜脈注射的顯著去除抗A和抗B抗體的IgG濃縮物,與市售IgG濃縮物相比,優(yōu)選大幅度降^[氐生產(chǎn)方法產(chǎn)生的多反應性,同時應具有相對于免疫療法至少相同的功效。
發(fā)明內(nèi)容因此,本發(fā)明涉及用于治療用途的免疫球蛋白G濃縮物,其特征在于抗A和抗B抗體的各自含量在體外間接Coombs實驗結果為陰性。本發(fā)明也涉及制備免疫球蛋白G的方法,通過該方法有可能不產(chǎn)生多反應性抗體,這些多反應性抗體與天然和抗個體型抗體相比更不太好耐受。因此,通過該方法獲得的IglV比其它試驗的IglV有著更低的多反應性。本發(fā)明這些濃縮物的IgG優(yōu)選從已富集IgG的血漿或血漿成分中獲得多克隆IgG。治療用途的IgG濃縮物具有的IgG濃度為目前經(jīng)常使用的濃度,優(yōu)選在50和100g/l之間。這些濃縮物將用于臨床使用,特別是可由靜脈途徑注射。為此,它們必需對病毒安全,可以任意含有賦形劑,如符合臨床使用的穩(wěn)定劑。本申請人已發(fā)現(xiàn)可以提供所述IgG濃縮物,其含有抗A和抗B抗體含量大大低于標準IgG濃縮物中的含量,標準IgG濃縮物即通過乙醇分鎦法和/或使用色譜分析相關純化技術獲得的濃縮物,如上所述,并不考慮經(jīng)過附加處理以以除去抗體的濃縮物。此外它們的含量遠低于歐洲藥典接受的下限,其很顯著地限制了一些接受治療患者溶血的風險。當本發(fā)明的IgG濃縮物進行試驗以評估抗A和抗B抗體數(shù)量時,可以觀察到抗人類IgG抗體存在的情況下,A,B和/或AB型體外紅細胞凝集試-驗結果顯示為系統(tǒng)陰性,特別是在歐洲藥典方法規(guī)定的起始濃度30g/l條件下。因此用本發(fā)明的IgG濃縮物,甚至使用同樣即非稀釋的IgG樣品進行前面定義的間接Coombs實驗得到系統(tǒng)陰性結果。因此表明在這些濃縮物中抗A和抗B抗體的含量通過ICT實驗已經(jīng)檢測不到。假如在IgG濃縮物中抗A和抗B抗體的水平非常低,那么IAT實驗就不能再使用,甚至在歐洲藥典規(guī)定的條件下也不能使用,這是因為不再發(fā)生紅細胞凝集反應了,甚至在加入抗人類IgG抗體的條件下也不再發(fā)生,這是由于抗A和抗B抗體的稠密度太小以至于不允許紅細胞之間通過固定到紅細胞和抗人類IgG抗體的抗A和抗B抗體的結合形成橋結構。然而有可能檢驗到這些抗A和/或抗B抗體以非常低濃度存在,這是通過引起固定這些抗體的紅細胞的免疫性溶血,以及通過對與傳統(tǒng)濃縮物相比較的消耗的測定來檢驗,該傳統(tǒng)濃縮物未經(jīng)過除去抗A和抗B抗體處理。免疫性溶血是種特殊的免疫反應,其發(fā)生在抗體附著于補體因子出現(xiàn)的靶。補體活動的活化引起穿孔蛋白的釋放,其會穿透紅細胞膜讓血紅蛋白逸出。那需要敏感的方法如利用放射性示蹤劑(參見下文)來測量釋放血紅蛋白量,正比于存在的抗A和抗B抗體量。本申請人已用特別方便的方法證明本發(fā)明的IgG濃縮物含抗A抗體不超過23ng/mg,特別是在19和23ng/mg之間,含抗B抗體不超過20ng/mg,特別是在12和20ng/mg之間。有利地,本申請人發(fā)現(xiàn)也可提供具有極低含量的多反應性IgG的所述IgG濃縮物,特別是通過制備方法產(chǎn)生的IgG濃縮物,從而賦予該濃縮物接近非多反應性特性,該濃縮物與現(xiàn)有技術中的IgG濃縮物一樣對于免疫療法的治療有效。生產(chǎn)方法所導致的多反應活性的IgG的顯著減少,使得在需要高劑量濃縮物的治療后發(fā)生副作用的危險降低。另外,有利的方面是有可能改善副作用,該副作用是由制備方法而產(chǎn)生的IgG濃縮物中的多反應性IgG的存在所引起的,多反應性IgG的存在尤其是在純化法過程中氧化"應激"和羥基化作用所產(chǎn)生。多反應性IgG殘留含量優(yōu)選包含在0.0P/。和0.1%之間,尤其在0.07和0.1%之間。在本發(fā)明條件下,多反應性IgG含量意指摩爾或重量百分數(shù)。由申請人在專利申請1059088描述的方法確定該含量。因此,通過有效成分中幾乎不含有抗A和抗B抗體來定義本發(fā)明的IgG濃縮物,其直接針對紅細胞出現(xiàn)的抗原決定基。IgG濃縮物存在于合適的穩(wěn)定劑中,可以為液態(tài)或凍干粉形式,也可以儲存以備后用。申請人在其專利申請WO2004/091656A2中公開了那些有利的穩(wěn)定劑,即糖醇的混合物,優(yōu)選甘露醇、山梨醇或它們的異構體,甘氨酸和非離子去污劑如Tween⑧80、Tween20、TritonXI00或PluronicF68的混合物,所有三種化合物都是藥學上可接受的。申請人確定濃縮物的制劑是穩(wěn)定的液態(tài)和/或凍千形式。濃縮物中最終甘露醇的濃度優(yōu)選在30g/1和50g/l之間,去污劑的濃度在20和50ppm之間,以及甘氨酸的濃度在7g/1和10g/l之間。這些化合物的濃度表示在IgG濃縮物的最終濃度。所述IgG濃縮物用于治療用途,特別如前面所示,可經(jīng)靜脈內(nèi)途徑注射。為此,本發(fā)明的lgG濃縮物在使用傳統(tǒng)溶劑-去污劑處理方法時必需是病毒安全的,例如現(xiàn)有技術中公知的如使用Tween80/TnBP或TritonX100/TnBP的混合物、和/或過濾步驟以任意除去病毒和/或其他的大分子,它們可能在溶劑-去污劑殺病毒劑處理時沒被除去,例如,蛋白感染素-傳播海綿狀腦病的重要因素。本發(fā)明還涉及獲得例如上述IgG濃縮物的方法,其包括以下步驟a)通過乙醇分餾法和/或層析分離制備IgG濃縮物,聯(lián)合病毒滅活步驟,b)通過介質載體的混合物對所述IgG濃縮物滲濾,以進行免疫親和層析,該介質載體的基質用類似A和B血型抗原的低聚糖組接枝,并c)過濾以除去病毒和/或超過20nm大小的顆粒。申請人:發(fā)現(xiàn)用非凡的方法,不僅可以有利于工業(yè)銷售,而且結合各種步驟可以用特殊的步驟除去抗A和抗B抗體,以制備IgG濃縮物。有可能獲得本發(fā)明的用于治療用途的IgG濃縮物,也可以優(yōu)選包含多反應性IgG的含量相對于總IgG含量低于O.P/。。另外,在所述的濃縮劑中,不希望含有的抗A和抗B抗體的含量低于歐洲藥典實驗所述的下限,甚至所述非稀釋樣品的ICT實驗結果為陰性。優(yōu)選的該方法的步驟a)本身是獲得如前面提及的IgG濃縮物的一種方法。它涉及到由Cohn等發(fā)展的乙醇分餾法或層析分離法,在EP0703922和WO99/64462有敘述的例子。特別優(yōu)先的是申請人在專利申請WO94/29334和WO02/092632Al公開的方法,更具體的是在WO02/092632Al所描述的。在這種情況下,本發(fā)明方法的步驟a)包含通過沉淀來自血漿或來自血漿IgG富集成分的脂質污染物的預純化,在堿性PH下進行單個陰離子交換樹脂色譜分析,在一個步驟中使用PH值為4-7的合適的緩沖液選擇性洗脫IgG。本方法的步驟a)包括病毒滅活處理,優(yōu)選使用如Horowitz在專利US4764369中描述的溶劑-去污劑法。明智的是在步驟a之前進行,或者如果適宜的話在隨后色譜法步驟前進行,以除去這一處理化學殘留物。收集的IgG成分已充分濃縮,然后可以通過超濾和滅菌過濾進行其它濃縮步驟。然后在兩種介質混合物上對該濃縮物進行免疫親和層析,該介質混合物用與A和B血型相似的抗原組接枝,優(yōu)選使用載有所述介質混合物的柱子。色析法的介質優(yōu)選包含瓊脂糖型的天然交聯(lián)聚合物基質,其上間隔基或偶聯(lián)臂隨后用低聚糖接枝,優(yōu)選的是相應于A和B血型抗原決定基的三糖。特別地,使用所述相應于血型A的抗原決定基的三糖的介質獲得了非常好的結果,其結構為N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-巖藻糖(Fuc),而且那些相應于血型B的抗原決定基的具有半乳糖-半乳糖-巖藻糖結構。所TransplantationAS(Sweden)的GLYCOSORBABO。例如,如果使用該介質,符合血型A的抗原決定基的三糖具有如下結構:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage13</formula>讓N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)半乳糖(Gal)巖藻糖(Fuc)例如,如果使用該介質,符合血型B的抗原決定基的三糖具有如下結構:優(yōu)選的,與A血型和B血型類似的抗原接枝的介質混合物,其比例各自為25/75和75/25(v/v)之間。根據(jù)供者人口的血型分布,盡可能有效的調(diào)整兩種介質載體的比例。對于通常的使用,層析柱優(yōu)選裝載50/50(v/v)的上述各自具體介質混合物。分析柱為15-25cm長,使用的直徑可為0.5-lcm。對于中試規(guī)模的應用,能夠使用的層析柱長度為40-60cm,寬度為40-60mm。在這種情況下,層析柱可能裝載600ml的免疫親和介質。在使用的兩次循環(huán)間,所述的介質^ft存在iMNaOH中。-使用前用水洗滌。免疫親和層析柱裝載IgG濃縮物,優(yōu)選比例為每毫升介質0.2到4升,優(yōu)選為1到2升。填裝IgG成分前不需要所述介質的特異性,即通過現(xiàn)有技術已知的血漿分餾技術獲得的任何IgG成分或濃縮物是合適的。濃縮物的過濾不需要洗脫機理。因此,無須考慮IgG濃縮物獲得的方法,隨意使用泵使其濾過層析柱。過濾允許留下抗A和抗B抗體以及多反應性IgG。優(yōu)選的,然后用水洗滌柱以收集仍然停留在柱中死體積內(nèi)的IgG。在過濾IgG濃縮物后,除去抗A和抗B抗體以及除去從制備方法中獲得多反應性IgG,得到IgG成分。抗A和抗B抗體保留在色層分離介質的抗原基序上,其修飾了它們的構象。因此,制備方法中產(chǎn)生的多反應性IgG同時保留在這種構象變化暴露的位點上。其次保留的這些多反應性IgG親和性比抗A和抗B抗體低得多。IgG通過后用分餾法就能夠洗脫,通過^f吏用如含有^f咸土金屬鹽的洗脫緩沖液,其濃度為0.1到0.5M,PH為3-8。在步驟b)之后,該方法可以包括超濾和滅菌濾過的濃縮步驟。色譜柱和介質然后通過如甘氨酸-HCI,PH為2.8的一種酸性溶液洗滌,以吸附留在介質的抗A和抗B抗體。介質在用水沖洗后,用lMNaOH處理。對高度除去抗A和抗B抗體以及多反應性IgG的IgG濃縮物進行過濾以除去耐受溶劑-去污劑處理的任何病毒和/或除去其他超過20nm的顆粒如蛋白感染素、制備步驟中產(chǎn)生的IgG聚合物、膠束脂多糖類、聚集的核苷酸和蛋白。優(yōu)選地,所述處理是帶有從100到15nm減少孔率的過濾器的納濾,特別是安排的連續(xù)3個過濾器,依次減少的界限是IOO,50和20nm。在步驟c)之后,本方法可以包括一個補充的步驟,首先加入穩(wěn)定劑以確保IgG濃縮物在儲存中的穩(wěn)定性,其次是冷凍干燥以阻止IgG在與之相關不同相態(tài)下的變性。優(yōu)選加入藥學上可接受的單一的穩(wěn)定劑,達到IgG在兩種儲存形式下穩(wěn)定的目標,兩種儲存形式即液態(tài)和凍干粉態(tài)的形式,以及達到保持和甚至改善這些IgG的治療效果的目標,這在專利申請WO2004/091656A2中描述過。根據(jù)其它實施方案,如專利WO02/092632Al所描述,其它免疫球蛋白的選擇性收集也是可以的。IgG濃縮物用超濾法任意進行隨后的濃縮步驟,接著進行滅菌濾過并可以儲存在瓶中,優(yōu)選溫度為4。C。如上大量的說明,本發(fā)明的IgG濃縮物中抗A和B抗體的含量比歐洲藥典可接受的界限要低很多。因此,其中描述的測定方法2.6.20(1997)用在本發(fā)明的IgG濃縮物中在抗體含量非常低的水平下檢測抗體被證明不夠靈敏。因此,發(fā)展這些抗體測定方法是必需的,其需要比歐洲藥典ICT實驗結果更低的才企測界限用于一企測抗A和抗B抗體。所述測定本發(fā)明IgG濃縮物中抗A和/或B抗體方法包括以下步驟a)制備和標定A,B和/或0血型恒河猴的紅細胞懸浮液,b)制備單克隆抗D抗體溶液,其濃度為在生物學可接受的緩沖范圍的從0到200ng/ml的濃度范圍,c)用IgG溶液樣品或單克隆抗D抗體溶液接觸所述紅細胞,并且在預定時間內(nèi)培養(yǎng)所獲得的紅細胞混合物,d)將抗人類IgG抗體F(ab')2片段加入各個紅細胞混合物中,并以熒光染料做標記,然后培養(yǎng)所述紅細胞,e)對在步驟d)中獲得的每組紅細胞混合物進行流式細胞計數(shù),f)測定IgG濃縮物中抗A和/或抗B抗體的含量。所述測定抗A抗體和抗B抗體含量的方法的一個實施方案,包括制備1%v/v的A、B和/或0型血的紅細胞懸液,置于pH值在7.0-7.4之間并包含0.8-1.5重量%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中,然后用本領域技術人員公知的普通流式細胞儀檢測出懸液的紅細胞數(shù)量,然后懸液被標定為37-43.106個紅細胞/毫升的懸浮液。制備單克隆抗D抗體的溶液,濃度范圍為0-200ng/ml緩沖液,優(yōu)選PBS緩沖液的PH值在7.0-7.4之間,任意包含0.8-1.5重量。/o的牛血清蛋白BSA。因此各自溶液用吸收測定法來測定它的摩爾消光系數(shù)(s)。然后使用pH值為7.0-7.4之間的、包含0.8-1.5重量Q/o的BSA的PBS緩沖液,將本發(fā)明的IgG濃縮物濃度范圍調(diào)節(jié)在l-5mg/ml之間,優(yōu)選lmg/ml。將各自血型的50-100)il血細胞懸液置于微孔板的每個孔中,例如96孔微孔板,然后在血細胞懸液中注入50-100iLil的IgG溶液,或者注入50-100jul的抗D抗體。整個溶液培養(yǎng)1.5h-2.5h,特別是在培養(yǎng)2h,通常溫度處于30-40。C之間,優(yōu)選37。C。然后優(yōu)選用包含BSA的PBS緩沖液沖洗在微孔板中的各種紅細胞混合物,離心;再向每個置于微孔板的微孔中的紅細胞混合物中加入用熒光染料例如藻紅素標記了的50-100piF(ab'2)羊抗人IgG抗體,其存在于前面定義的PBS和BSA緩沖液。將整個溶液在黑暗中培養(yǎng)大約20-30分鐘。然后再次沖洗因此獲得的各種紅細胞混合物,并使用任意合適的包含檢測分析化合物熒光的設備的市售儀器進行流式細胞計數(shù)。給出的平均熒光強度(MFI)與單克隆抗D抗體的濃度有關,并使用Excel軟件得到線性回歸方程。然后對于每個樣品,使用線性回歸方程獲得抗D抗體當量的濃度。因為測定了三批量樣品,使用Excel軟件確定平均濃度和計算變異系數(shù)。從其中可以推論本發(fā)明的IgG濃縮物中抗A和抗B抗體的含量,其方便得到以上含量。在這個方法中優(yōu)選使用適應于該實驗的流式細胞儀,該實驗是使用人A型血和B型血的血紅細胞,并根據(jù)具體的抗A抗體和抗B抗體成分,運用焚光標記來纟企測這些抗體的比例。所述測定方法步驟如下a)準備并標定A型血和B型血的紅細胞懸液,b)用稀釋過的IgG溶液接觸所述紅細胞懸液,并用一段預定時間培養(yǎng)獲得的混合物,C)在用熒光劑標記過的抗IgG抗體存在下培養(yǎng)所述紅細胞,和d)用流式細胞計測定在步驟c)中獲得的紅細胞懸浮液。制備l。/ov/v的A、B和/或0型血的紅細胞懸液,置于pH值在7.0-7.4之間并包含0.8-1.5重量%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中,然后用本領域技術人員公知的普通流式細胞儀檢測出懸液的紅細胞數(shù)量,然后懸液被標定為37-43.106個紅細胞/毫升的懸浮液。將50-100)il的血紅細胞懸液被放置于96孔微孔板的每個孔中,然后在懸液中注入50-100pl被稀釋了的IgG溶液,該溶液通過增量稀釋,從濃度為30g/l—直稀釋到濃度為0.234g/1。將整個液體培養(yǎng)1.5-2.5小時之間,特別是兩個小時,溫度控制在30-40。C之間,優(yōu)選37。C。然后用包含BSA的PBS緩沖液沖洗紅細胞混合物,離心后,再在每個孔中加入用焚光染料例如藻紅素標記的50-100plF(ab'2)羊抗人IgG抗體。整個步驟(步驟c)培養(yǎng)大約20-30分鐘,避光。然后沖洗得到的懸浮液,并使用任意合適的包含檢測分析化合物熒光的設備的市售儀器進行流式細胞計數(shù)。例如,3種IgG濃縮物的抗A和抗B抗體含量稱為Bl、B2和B3,和,分別用乙醇分餾按照Cohn法(引用所述)(B1),根據(jù)專利號WO02/092632(B2),以及根據(jù)專利號WO02/092632,并繼之以免疫親和層析(B3)來除去抗A和抗B抗體,如下面表l所示。顯示的結果與樣品B1中的抗A抗體和抗B抗體的控制滴度相關,樣品B1中的抗體的含量任意設定為1以作為參考。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>該表格的結果首先顯示了用Cohn法制備的IgG濃縮物(B1)中的抗A抗體和抗B抗體含量約四倍小于用WO02/092632描述的方法制備的IgG濃縮物(B2)中的含量。此外,隨后對這些IgG濃縮物用特異性免疫親和柱進行的處理降低了抗A抗體的滴定度,其系數(shù)接近于5,抗B抗體的系數(shù)接近于7(B3)??梢苑奖愕貙嵤┝硗庖环N測定抗A抗體和抗B抗體含量的方法,包括為本領域技術人員所公知的補體體外溶解,但已經(jīng)被特定設計以滿足本發(fā)明的需要。所述測定方法包括下列步驟a)用合適的放射性標記物放射性標記預先計算的選自A、B、AB和O血型番木瓜酶治療的紅細胞懸浮液,b)用預定用量IgG濃縮物的樣品接觸放射性標記的紅細胞,c)加入與步驟b)相同體積的血型AB的正常血清,d)培養(yǎng)在步驟c)獲得混合物一段預定時間,和e)測定因此獲得的培養(yǎng)溶液的放射性。用A、B、AB或0型血制備用番木瓜酶處理的紅細胞的1。/0(v/v)懸液,然后在Malassez細胞中得到了106個紅細胞。加入含"Cr(l體積/l紅細胞體積)的100pCi。全部溶液培養(yǎng)l-2個小時,然后沖洗》欠射性標記過的血紅細胞4-6次。放射性標記過的血紅細胞然后和IgG濃縮物的樣品接觸,該IgG濃縮物濃度優(yōu)選為1-3mg/ml,例如特別是在100yl體積中為1.2mg/ml每4-6.106個放射性標記過的血紅細萬包。對于在前的體積是相等的體積的,例如100(il的AB血型的常規(guī)血清然后被加到在前的混合物中以提供不同的補體因子。然后培養(yǎng)得到的反應混合物,優(yōu)選時間包括3-5小時之間,特別是在4小時,溫度通常包括30-40。C之間,優(yōu)選37。C。然后反應混合物優(yōu)選離心,可以用合適的市售設備來測定培養(yǎng)溶液的放射性。所測溶液的放射性與被處理過的紅血球的溶血程度成正比,也和抗體A和抗體B的含量成正比。舉例來說,考慮到本發(fā)明的IgG濃縮物(B3)和所有市售濃縮物中溶血水平最低的現(xiàn)有技術的IgG濃縮物(Cl),則所獲得的A型血,B型血和AB型血的紅血球的溶血程度如以下表2所示。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>具體實施例方式以下的實施例闡明了本發(fā)明的實施方案,但是并沒有限定其范圍。實施例l按照WO02/092632所述的方法得到40g/l的IgG濃縮物(B2)的樣品。長度為50cm、直徑為44mm的色i普柱裝載了50/50(v/v)的GLYCOSORBABO介質混合物,該介質被移植入了相當于A型血和B型血表位的三糖,然后要預先用1200ml的水將其沖洗。用泵按照0.21/ml介質的比例注入B2IgG濃縮物。一旦內(nèi)容物滲透過所述圓柱體,圓柱體就會用最小體積的可注射備用水(IP)沖洗,以收集柱死體積中存在的IgG。除去抗體A和抗體B以及多反應性IgG,從中收集到約40g/l的B3IgG濃縮物,然后使用超濾得到60g/l的濃縮物,在三臺系列過濾器上通過納米過濾除去病毒,并獲得IOO、50和20nm不斷降低的存留性極限。穩(wěn)定賦形劑由甘氨酸(7g/1)、甘露醇(30g/l)和20ppm的吐溫80(Tween80)的混合物組成,其溶入60g/l的IgG濃縮物,并且使用PI水設備將IgG濃縮物調(diào)節(jié)為50g/1,然后濃縮物被過濾除菌,并被分裝到瓶子中。實施例2:在lglVs中抗A/Bs的定量分析1)試驗原理將ARhesus+、BRhesus+或0Rhesus+血型的人紅血球懸浮液規(guī)格化為40x1()6紅血球/mlpH=7.4的?88緩沖劑+1%BSA的濃度。雀備羊^i麿Z)在傳老厲準備單克隆D抗體(稱為R297)用于檢測在280nm相對于pH值為7.4的PBS緩沖液的吸光度(OD)。相對于在不同氨基酸中組合物,計算蛋白的摩爾消光系數(shù)(s),并通過下式來得到單克隆抗D的濃度C=0D/E1,其中1等于用于0D測定容器的寬度。一個從O到200ng/ml范圍的單克隆抗D抗體可以在12個點上產(chǎn)生(200;150;100;75;50;25;12.5;6.25;3.13;1.56;0.78和0ng/ml)。,備^;fc經(jīng)絲濕檢測市售的不同的靜脈免疫球蛋白,這些免疫球蛋白的主要特性詳見下表<table>complextableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*按照\¥002/092632所描述的方法,根據(jù)實施例l描述的免疫親合性步驟來獲得。"按照WO02/092632里所描述的方法,無實施例l描述的免疫親合性步驟來獲得。使用pH二7.4、PBS+ly。BSA緩沖液,將不同的免疫球蛋白配制調(diào)整為lmg/ml的濃度。下列物體堆積在圓底的微孔微孔板上。-50filARhesus+、BRhesus+或0Rhesus+紅血J求細I包的懸浮液,其濃度為40x106紅血J求/毫升,-待測50ji1抗-D或50jilIglV樣品。將要測定的樣品分三份放置。然后,在37。C、攪拌下將微孔板培養(yǎng)兩小時。遂濕將微孔板在770g時離心1分鐘。通過翻轉除去上清液,然后在各自孔中加入200pl的PBS+1%BSA。該才喿作重復3遍。7-6」》p入4乾參/口遂濕將帶有藻紅蛋白(PE)(BeckmannCoulter,Ref:PNIM0550)的羊抗人IgGF(ab'2)(Fcspecific)在PBS+1%BSA緩沖劑中稀釋為1/20*,pH7.4,在每孔內(nèi)存放50pl溶液。然后,將微孔板置于無光室溫狀態(tài)下反應20到30分鐘。按照l-5)描述的三個連續(xù)步驟清洗。/-7」^4'勿/《#諒/義irA碌^蕃孕濕諒凝i冉^適^覆淨^C5悉4'勿應^fBeckmannCoulterFC500)上讀取的。在50000events上進行讀取,該裝置自動計算各個點或樣本的熒光強度平均值(MFI)。得到的MFI值和單克隆抗-D抗體濃度有關,利用Excel軟件可以得到直線回歸方程。然后,通過直線回歸方程得到各個樣品的當量抗-D抗體的濃度。因為將樣本分成三份進行化驗,那么,利用Excel軟件就可以測定出其平均濃度,計算出其變異系數(shù)(CV)。2)結果2國"^敘贈產(chǎn)<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>3)結論親和性步驟確實有助于去除抗-A和抗-B抗體。對市售的眾多不同種類的免疫球蛋白檢測中,產(chǎn)品lgNG2是測驗出含有最少數(shù)目抗-A和抗-B抗體的產(chǎn)品。實施例3在含有l(wèi)wt.0/0的牛血清蛋白(BSA)、pH7.4的PBS緩沖劑中制備A血型中P/。(v/v)的紅細胞懸浮液。取出50pl的紅細胞懸浮液,加入流式細胞管(Beckmann-CoulterEpicsXL))和50jul的內(nèi)標溶液測量流量。該懸浮液刻度校準為40.106紅細胞/毫升。用從實例1中得到的lgG濃縮物(v/v)(B3)因子2連續(xù)稀釋的方式來制備八份IgG溶液,濃度最大的一份為30g/1,稀釋度最大的為0.234g/1。然后,將50pl體積的懸浮液放入96孔(well)微孔板的每個孔中,然后加入50pi不同稀度的IgG溶液。在溫度為37。C下,攪拌下讓全部溶液培養(yǎng)2小時。用200iil包括前述BSA的PBS緩沖劑清洗每個孔,孩i孔^反在2000rpm下離心l分鐘。清除上清液后,通過加入PBS-BSA將羊抗人IgGF(ab'2)抗體稀釋至1/20,由藻紅蛋白焚光色素(BeckmannCoulter)進行標記。將全部溶液置于無光處培養(yǎng)3O分鐘。然后如前所述沖洗懸浮液。將每個孔中的殘留物溶解在IOOjil的PBS-BSA中,將包含在微孔板各孔的內(nèi)容物轉移至一個試管中,向其加入(Coulter)500(ilIsoflow鞘液,然后用Coulter-BeckmannEpicsXL儀器上的流式細胞計分析,該儀器本身包含數(shù)據(jù)采集和結果分析軟件。用熒光測定法測定每個樣液。采取相同程序分析B型血的紅細胞。該操作模式針對IgG(B3)三個不同批次溶液,也應用于根據(jù)Cohn法(以上所引用)(B1)乙醇分餾制備的三個不同批次IgG。得到的結果如下表3所示:表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例4制備番木瓜酶處理A、B、AB或O型血紅細胞的1M(v/v)懸浮液,以馬氏細胞計數(shù)得到106個紅細胞。加入100pCi的"Cr的(l體積/l體積紅細胞)。得到的溶液培養(yǎng)l小時,然后將具有放射性標記的紅細胞沖洗5次。然后將放射性標記的紅細胞與實施例1中所得的IgG濃縮物樣品(B2)接觸,濃度為1.2mg/ml5.106個放射性標記紅細胞,在100111體積下。然后將上述同樣容量的100ulAB型血正常血清加入前述混合液中,以提供不同的補體因子。得到的反應混合液在37。C下培養(yǎng)4小時。然后以2000rpm離心處理混合液1分鐘,用市售的合適儀器檢測培養(yǎng)上清液的放射性。所得放射性強度與紅細胞溶血程度成正比例,因而與抗A抗體和抗B抗體的含量成正比例。采用相同的步驟分析Rh陽性的B、AB和O型血的紅細胞,并分析0+型血清的樣品。這個操作模式應用于三個不同批次的IgG(B2)此外,該程序應用于三批次IgG濃縮液的商業(yè)樣品,表示為C2-C4,以及包括作為陰性對照的0+型血清樣品表示為C5。溶液測量的放射性與紅細胞的溶血度成正比,因此與結合到紅血球上的抗A抗體和抗B抗體的lt量成正比。溶血結果如下表4所示<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>所得結果顯示IgG濃縮物B3,根據(jù)該發(fā)明使用了親和層析法,包含極低數(shù)量的抗A抗體和抗B抗體,因為該液體造成的各血型的紅細胞溶血比例最低。在作為陰性對照的表型0+型血中,沒有發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象。實施例5:實施例1中已描述了對IgG濃縮物B2(使用免疫親和層析法前)和B3(免疫親和層析法后)多反應性的檢測。根據(jù)專利EP1059088的方法,使用與多反應性的IgG^反應的兩種抗原對這些IgG濃縮物進行多反應性的檢測。該兩種抗原是二硝基苯基修飾的肌凝蛋白和白蛋白(DNP白蛋白)。表5顯示了實施例3樣品B2、B3和B4中多反應性IgG的富集因子,其IgG含量任意設定為l作為參考。這些檢測是針對所考慮的三個不同批次IgG濃縮物。<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>結果表明本發(fā)明的B3IgG濃縮物包含的多反應IgGS比現(xiàn)有技術濃縮物C4要少5到8倍。實施例6本實施例用于比較B1IgG濃縮物以及除去抗A抗體和抗B抗體和多反應性IgG的BlIgG濃縮物的效果。為了評價本發(fā)明IgG濃縮物的免疫增強活性,試驗包括處理缺失FcyRI和FcYRIII受體的小鼠。這些動物被用作血小板減少性紫癥研究的模板。根據(jù)Cohn乙醇分餾法獲得的IgG濃縮物(Bl)用于作為對照物。實驗規(guī)程是TeelingJ丄等描述過的規(guī)程(Blood,15/08/2001,vol.98,number4,pp.1095-1099)。通過注射9.10Vml-2.10Vml的抗血小板單克隆IgG破壞了這些動物體內(nèi)的血小板,在通過劑量為lg/kg的Bl和B3治療后又提高到7.10"ml。根據(jù)本發(fā)明B3IgG濃縮物的免疫調(diào)節(jié)活性不會被免疫親和層析改性。權利要求1.治療用免疫球蛋白G(IgG)濃縮物,其特征在于抗A和抗B抗體的各自含量符合體外間接Coombs測試的陰性結果。2.根據(jù)權利要求l的免疫球蛋白G(IgG)濃縮物,其具有抗A抗體的含量不超過23ng/mgIgG,抗B抗體的含量不超過20ng/mgIgG。3.根據(jù)權利要求1或2任一項的免疫球蛋白G濃縮物,其多反應性IgG的剩余含量相對于總IgG含量為0.01%和0.1%之間,特別為0.07%和0.1%之間。4.根據(jù)權利要求]-3任一項的濃縮物,包含使得所述濃縮物可以貯存的穩(wěn)定劑。5.根據(jù)權利要求l-4任一項的濃縮物,其中穩(wěn)定劑是糖醇,優(yōu)選甘露糖醇或山梨糖醇,甘氨酸和非離子型去污劑的混合物。6.根據(jù)權利要求1-5任一項的濃縮物,可經(jīng)由靜脈途徑注射。7.獲得根據(jù)權利要求l-6任一項IgG濃縮物的方法,包括以下步驟a)通過乙醇分餾法和/或層析分離聯(lián)合病毒滅活步驟制備IgG濃縮物,b)通過將所述IgG濃縮物在介質混合物上進行滲流以對其進行免疫親和層析,該介質混合物由具有類似A和B血型抗原的低聚糖組接枝過,并c)過濾以除去病毒和/或超過20nm大小的顆粒。8.根據(jù)權利要求7的方法,其中步驟a)包含通過沉淀來自血漿或來自血漿富含IgG成分的脂質污染物的預純化過程,在堿性pH下進行單個陰離子交換樹脂色譜分析,并且在一個步驟中使用pH值為4-7的緩沖液選擇性洗脫IgG。9.根據(jù)權利要求7或8的方法,其中低聚糖組是相應于A和B血型表位的三糖。10.根據(jù)權利要求9的方法,其中相應于血型A的表位的三糖,其結構為N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-巖藻糖(Fuc),相應于血型B的表位的三糖具有半乳糖-半乳糖-巖藻糖結構。11.根據(jù)權利要求7-10任一項的方法,其中使用溶劑去污劑進行病毒滅活步驟。12.根據(jù)權利要求7-1l任一項的方法,其中介質載體混合物由與A血型和B血型類似抗原的組分進行接枝,其比例各自為25/75和75/25(v/v)之間,優(yōu)選50/50(v/v)的各自介質載體。13.根據(jù)權利要求7-12任一項的方法,其包含通過超濾和滅菌過濾的濃縮步驟。14.根據(jù)權利要求7-13任一項的方法,其中過濾除去病毒為采用納濾。15.根據(jù)權利要求7-14任一項的方法,在步驟c)后包含加入穩(wěn)定劑以便于所述IgG濃縮物貯存的步驟。16.如權利要求1-6任一項定義的免疫球蛋白G的濃縮物中抗A和抗B抗體的測定法,包含步驟如下a)制備并標定A型血和B型血的紅細胞懸浮液,b)用稀釋過的IgG溶液樣品接觸所述紅細胞,并將獲得的混合物培養(yǎng)一段預定的時間,c)在經(jīng)熒光劑標記過的抗IgG抗體存在下培養(yǎng)所述紅細胞,和d)用流式細胞計測定在步驟c)中獲得的紅細胞懸浮液。17.在如權利要求1-6任一項定義的免疫球蛋白G的濃縮物中抗A和抗B抗體的測定法,包含步驟如下a)用適宜的放射性標記物^L射性標記預先計算的選自A、B、AB和O血型番木瓜酶處理的紅細胞懸浮液,b)用預定體積的IgG濃縮物的樣品接觸放射性標記的紅細胞,c)加入與步驟b)相同體積的血型AB的正常血清,d)培養(yǎng)在步驟c)獲得的混合物一段預定時間,和e)測定因此獲得的培養(yǎng)溶液的放射性。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于治療的免疫球蛋白濃縮物,其中在體外間接Coombs實驗中抗-A和抗B抗體的各自含量為陰性結果。該IgG濃縮物的多反應性IgG含量相對于IgG總量為在0.01%-0.1%之間,尤其是在0.07-0.1%。文檔編號A61K39/395GK101346153SQ200680049448公開日2009年1月14日申請日期2006年12月26日優(yōu)先權日2005年12月26日發(fā)明者弗雷德里克·戴諾,菲利普·保蘭托納奇,阿布德薩塔·什圖魯申請人:分餾和生物工藝法國實驗室公司
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