專利名稱：一種分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，所述真菌為米曲霉。
背景技術(shù)：
米曲霉可以產(chǎn)復(fù)合酶，如:蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，不產(chǎn)毒素，是食品工業(yè)中安全的工業(yè)菌株。這些復(fù)合酶分解后的原料易被人體吸收，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大大提高，多種發(fā)酵食品中都用米曲霉來(lái)分解原料。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是基于基因組測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù)而出現(xiàn)的一種研究方法，它的研究包括了一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)微生物的全套蛋白質(zhì)，也是后基因組計(jì)劃中一個(gè)很重要的內(nèi)容。研究蛋白質(zhì)組學(xué)最經(jīng)典的方法是先通過(guò)雙向凝膠電泳分離蛋白再運(yùn)用質(zhì)譜鑒定確定蛋白序列。米曲霉蛋白質(zhì)組學(xué)的研究相對(duì)較少，早些時(shí)候有研究者就通過(guò)二維電泳凝膠分離技術(shù)對(duì)米曲霉細(xì)胞內(nèi)部蛋白進(jìn)行了分離，但是后期鑒定蛋白功能的工作沒有進(jìn)行下去。直到2006年，日本的研究工作者利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法探討了米曲霉在固體和液體培養(yǎng)條件下胞外蛋白酶的分泌情況，通過(guò)質(zhì)譜鑒定總共確定了 29個(gè)蛋白，開辟了運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白分泌的先河。目前，還沒有采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析米曲霉發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，本發(fā)明為了探尋功能基因指導(dǎo)的蛋白表達(dá)分泌 情況，通過(guò)繪制蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜，分析其發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)，尋找對(duì)其發(fā)酵起重要作用的蛋白及其調(diào)控基因，本發(fā)明以米曲霉為例本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，步驟如下:⑴等電聚焦:收集發(fā)酵過(guò)程中菌絲體，PBS緩沖液洗滌3次，加入液氮研磨至粉末狀，加入適量裂解液和50 μ g/ml DNase Ι、50 μ g/ml RNase，混勻，冰浴15分鐘，冰浴超聲2分鐘，14000 rpm, 4度離心30分鐘取上清，從冰箱中取出美國(guó)Bio-Rad公司的pH 4-7的IPG預(yù)制膠條，用溶脹緩沖液將膠條泡脹12小時(shí)；將膠條取出放入聚焦槽內(nèi)，加入礦物油至沒過(guò)上樣杯，并用上樣緩沖液稀釋至170μ 1，對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子，MultiphorII電泳系統(tǒng)進(jìn)行等電聚焦；⑵平衡:聚焦結(jié)束的膠條先將膠條放入平衡緩沖液I水平振蕩15分鐘，再將膠條轉(zhuǎn)入平衡緩沖液II水平振蕩15分鐘；⑶第二向SDS-PAGE電泳:第二次平衡結(jié)束后，將膠條從樣品盤中移出，放到已配好的12%的SDS-PAGE凝膠上端，并將marker放到凝膠的一端，再用0.5%的瓊脂糖將膠條和marker封嚴(yán),不能產(chǎn)生氣泡,并將膠板固定于電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液，接通電源，15mA/膠恒流電泳15分鐘，然后250v恒壓電泳，待溴酚藍(lán)達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，電泳結(jié)束后，撬開兩層玻璃，取出凝膠，將凝膠放入裝有染色液的水平盤內(nèi)振蕩過(guò)夜進(jìn)行染色，染色后，將凝膠浸于脫色液中，水平搖床振蕩脫色；⑷蛋白點(diǎn)的膠內(nèi)酶解:①凝膠平鋪于染色盤上，切下用于質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白點(diǎn)，用50 去離子水將其吹入96孔PCR板的小孔中，吸出去離子水后加入50 μ 脫色液；②在50°C條件下振蕩15分鐘，將脫色液吸出，重復(fù)一次，直至膠塊完全呈無(wú)色狀；③加50 μ 去離子水，50°C振蕩15分鐘，洗去殘留的脫色液和膠塊中的離子；④加30 KL乙腈,靜置5-10分鐘,膠塊變?yōu)榘咨笪鲆译?室溫靜置20分鐘，使乙腈揮發(fā)；⑤在膠塊上面加6-12 μ 的酶解液，使酶解液沒過(guò)膠塊，封好PCR板，37°C振蕩過(guò)夜酶解；(5) MALD1-T0F 4700 Proteome Analyser 質(zhì)譜儀鑒定蛋白①把質(zhì)譜樣品板洗干凈拋光，然后用異丙醇去極性后晾干，備用；②在質(zhì)譜樣品板四周邊緣六個(gè)孔上都點(diǎn)上ABI公司校準(zhǔn)液，在中間點(diǎn)樣孔處點(diǎn)上
0.3 PL酶解液后再點(diǎn)上0.3 PL質(zhì)譜自帶基質(zhì)溶液自然混合，晾干；③冷風(fēng)吹去樣品板上的灰塵雜質(zhì)，放入質(zhì)譜儀測(cè)定；④美國(guó)ABI公司的GPS 3.5軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，米曲霉蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。而且，所述裂解液成分為:8Μ尿素，2Μ硫脲，0.5% g/%ml, CHAPS, 2% g/%ml美國(guó)Bio-Rad 公司 pH4_7 兩性電解質(zhì)，lwt%DTT, ImM PMSF。而且，所述溶脹緩沖液的成分為wt%:8M尿素，2M硫脲，0.5% CHAPS70.52%美國(guó)Bio-Rad公司pH4-7兩性電解質(zhì)，0.02%溴酚藍(lán)，1%DTT。而且，所述的等點(diǎn)聚焦程序?yàn)?
權(quán)利要求
1.一種分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴等電聚焦:收集發(fā)酵過(guò)程中菌絲體，PBS緩沖液洗滌3次，加入液氮研磨至粉末狀，力口入適量裂解液和50 μ g/ml DNase 1、50 μ g/ml RNase，混勻，冰浴15分鐘，冰浴超聲2分鐘，14000 rpm，4度離心30分鐘取上清，從冰箱中取出美國(guó)Bio-Rad公司的pH 4-7的IPG預(yù)制膠條，用溶脹緩沖液將膠條泡脹12小時(shí)；將膠條取出放入聚焦槽內(nèi)，加入礦物油至沒過(guò)上樣杯，并用上樣緩沖液稀釋至170μ 1，對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子，MultiphorII電泳系統(tǒng)進(jìn)行等電聚焦； ⑵平衡:聚焦結(jié)束的膠條先將膠條放入平衡緩沖液I水平振蕩15分鐘，再將膠條轉(zhuǎn)入平衡緩沖液II水平振蕩15分鐘； ⑶第二向SDS-PAGE電泳:第二次平衡結(jié)束后，將膠條從樣品盤中移出，放到已配好的12%的SDS-PAGE凝膠上端，并將marker放到凝膠的一端，再用0.5%的瓊脂糖將膠條和marker封嚴(yán),不能產(chǎn)生氣泡,并將膠板固定于電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液，接通電源，15mA/膠恒流電泳15分鐘，然后250v恒壓電泳，待溴酚藍(lán)達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，電泳結(jié)束后，撬開兩層玻璃，取出凝膠，將凝膠放入裝有染色液的水平盤內(nèi)振蕩過(guò)夜進(jìn)行染色，染色后，將凝膠浸于脫色液中，水平搖床振蕩脫色； ⑷蛋白點(diǎn)的膠內(nèi)酶解:①凝膠平鋪于染色盤上，切下用于質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白點(diǎn)，用50 μ 去離子水將其吹入96孔PCR板的小孔中，吸出去離子水后加入50 μ 脫色液； ②在50°C條件下振蕩15分鐘，將脫色液吸出，重復(fù)一次，直至膠塊完全呈無(wú)色狀； ③加50μ 去離子水，50°C振蕩15分鐘，洗去殘留的脫色液和膠塊中的離子； ④加30PL乙腈，靜置5-10分 鐘，膠塊變?yōu)榘咨笪鲆译?，室溫靜置20分鐘，使乙腈揮發(fā)； ⑤在膠塊上面加6-12μ 的酶解液，使酶解液沒過(guò)膠塊，封好PCR板，37°C振蕩過(guò)夜酶解； (5)MALD1-T0F 4700 Proteome Analyser 質(zhì)譜儀鑒定蛋白 ①把質(zhì)譜樣品板洗干凈拋光，然后用異丙醇去極性后晾干，備用； ②在質(zhì)譜樣品板四周邊緣六個(gè)孔上都點(diǎn)上ABI公司校準(zhǔn)液，在中間點(diǎn)樣孔處點(diǎn)上0.3μ 酶解液后再點(diǎn)上0.3 μ 質(zhì)譜自帶基質(zhì)溶液自然混合，晾干； ③冷風(fēng)吹去樣品板上的灰塵雜質(zhì),放入質(zhì)譜儀測(cè)定； ④美國(guó)ABI公司的GPS3.5軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，米曲霉蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述裂解液成分為:8Μ尿素，2Μ硫脲，0.5% g/%ml，CHAPS，2% g/%ml美國(guó)Bio-Rad公司pH4_7兩性電解質(zhì)，lwt%DTT，ImM PMSF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述溶脹緩沖液的成分為wt%:8M尿素，2M硫脲，0.5% CHAPS70.52%美國(guó)Bio-Rad公司pH4_7兩性電解質(zhì)，0.02%溴酚藍(lán)，1%DTT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述的等點(diǎn)聚焦程序?yàn)?
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述的上樣緩沖液成分為 wt%:8 mL 0.5 M Tris pH 6.8,6.4 mL 甘油，12.8 mL 10% SDS, 3.2 mL巰基乙醇，L 6 mL 0.05%溴酚藍(lán)，超純水32 mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述平衡緩沖液 I 成分為 wt%:50mM Tris-HCl pH6.8，6M 尿素，30% 甘油，2% SDS，2%DTT，0.02% 溴酚藍(lán)；所述平衡緩沖液II成分為wt%:50mM Tris-HCl pH6.8，6M尿素，30%甘油，2% SDS,2.5%IAA,0.02% 溴酚藍(lán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述染色液成分為wt%:10%硫酸銨，10%磷酸，0.12%G250，20%甲醇；所述脫色液配置方法為:3%冰醋酸溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述酶解液成分為wt%:25 mM碳酸氫銨，0.005 μδ/μ 測(cè)序級(jí)胰蛋白酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述質(zhì)譜儀檢測(cè)模式為:校正儀器使誤差低于10 ppm，測(cè)試時(shí)采用正離子采集模式，采集范圍為700-4 000 Da，激光強(qiáng)度調(diào)整為1000。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，其特征在于:所述米曲霉蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件為:肽段和片段質(zhì)量誤差分別為± 0.1 Da和± 0.3 Da，允許有最多一個(gè)斷裂位點(diǎn)的缺失，考慮甲硫氨酸的氧化和半硫氨酸的氨基甲酰胺變化修飾，MS或MS/MS的MASCOT報(bào)告中，定義統(tǒng)計(jì)顯著性得分在95分以上的蛋白點(diǎn)認(rèn)為可信。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，包括以下步驟首先進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程中米曲霉菌體蛋白的二維電泳；質(zhì)譜鑒定分析蛋白；構(gòu)建了米曲霉的蛋白表達(dá)圖譜。本發(fā)明的技術(shù)方案建立了米曲霉菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，從蛋白質(zhì)水平提出了分析真菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白表達(dá)的方法，提供了可能導(dǎo)致米曲霉發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生不同的原因。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK103233060SQ20131015006
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者王春玲, 趙國(guó)忠, 王聰, 侯麗華 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)