專利名稱：喜樹內(nèi)生真菌的抗植物病原菌發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體涉及喜樹內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
在化學(xué)農(nóng)藥大量使用的今天，帶來了諸多弊端，如環(huán)境污染日益嚴(yán)峻、病害蟲抗性顯著提高、人畜安全受到威脅等，由此產(chǎn)生的生態(tài)問題層出不窮，且目前公眾對(duì)保障食品安全的呼聲越來越高。因此開發(fā)安全高效綠色環(huán)保的新型農(nóng)藥迫在眉睫。微生物農(nóng)藥由于發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、成本相對(duì)低廉、不易使病蟲害產(chǎn)生抗性、對(duì)人畜和環(huán)境溫和而成為開發(fā)新型生物農(nóng)藥中的熱點(diǎn)。而作為微生物之一的植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)在開發(fā)新型農(nóng)藥方面具有極為廣闊的前景而備受矚目。所謂植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指與宿主植物具有協(xié)同進(jìn)化作用且與宿主植物已經(jīng)形成互惠共生關(guān)系的一類真菌。植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)與宿主植物的互惠共生關(guān)系表現(xiàn)為:宿主植物產(chǎn)生的光合產(chǎn)物可為內(nèi)生真菌提供營(yíng)養(yǎng)；內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以刺激宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)可以提高植物的抗逆性。因此，植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物為發(fā)現(xiàn)新化合物、篩選新藥物等，提供豐富的原料和廣闊的空間，因此植物內(nèi)生真菌已成為多領(lǐng)域多學(xué)科的研究熱點(diǎn)。尊餓{Camptothecaac應(yīng)ZaaieO為拱桐科喜樹屬 iPamptotheca)，在我國(guó)分布較多，是中國(guó)特有樹種。喜樹因從體內(nèi)提取出具有抗癌的生物堿和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒而備受關(guān)注；在有關(guān)喜樹內(nèi)生真菌的報(bào)道也已見諸報(bào)端，但主要集中在生物堿和內(nèi)生真菌對(duì)抗癌和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗菌活性的研究。目前的研究表明在喜樹中存在具有較強(qiáng)的抗植物病原菌活性的內(nèi)生真菌。因此，研究喜樹內(nèi)生真菌對(duì)新時(shí)期農(nóng)藥的的研發(fā)和使用具有理論和實(shí)際上的參考價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的在于提供一種具有較強(qiáng)的抑制植物病原真菌活性的喜樹內(nèi)生真菌抗植物病原菌發(fā)酵液的制備方法。本發(fā)明所述的喜樹內(nèi)生真菌命名為球毛殼(Chaetomium globosum ),保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2013年3月08日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7291。本發(fā)明所述的喜樹內(nèi)生真菌系從中國(guó)安徽省安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的喜樹iCamptotheca acuminate、植物活體中分離得到的。本發(fā)明喜樹內(nèi)生真菌抗植物病原菌發(fā)酵液的具體發(fā)酵制備操作步驟如下:
(1)菌種活化
在無菌條件下，將喜樹內(nèi)生真菌G4的菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)溫度28°C ± I °C，恒溫培養(yǎng)7天，得到活化菌種；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)用無菌打孔器，將活化菌種打成直徑為6mm菌碟，接種3塊菌碟于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶?jī)?nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ± 1°C，培養(yǎng)7天，得到喜樹內(nèi)生真菌G4發(fā)酵液；過濾除去菌絲體，過0.22微米過濾器，即得到喜樹內(nèi)生真菌G4的抗植物病原菌發(fā)酵液；
發(fā)酵培養(yǎng)特征:培養(yǎng)第I天，菌體為少量白色的細(xì)絲和菌絲球，菌絲球體積較??；培養(yǎng)第3天，出現(xiàn)大量白色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，白色菌絲球繼續(xù)增多，并且體積變大；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量白色的菌絲球，體積也變大；
所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蒸餾水I
升;
所述液體培養(yǎng)基:麥芽浸粉25g、蒸餾水I升，pH自然。本發(fā)明通過對(duì)球毛殼菌G4的發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)蘋果腐爛植物病原真菌(fytospora mandshurica)等具有較為明顯的抑制菌絲生長(zhǎng)作用。本發(fā)明利用植物內(nèi)生真菌資源，以求獲得抗植物病原真菌病害的新型農(nóng)用抗生素。本發(fā)明所述喜樹內(nèi)生真菌抗植物病原菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌試驗(yàn)如下:
1.植物病原真菌:
蘋果腐爛病菌 ifytospora afltfeAtfrica)，葡萄灰霉病菌cinerea ),
褐紋病菌 iPhomopsis vexans ),率炭疽病菌{Gloelsporium fruc tigenum)，梨黑星病菌{Venturia，番爺才古萎病菌{Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)；
2.病原微生物的培養(yǎng)
用接種環(huán)挑取少量病原菌的斜面培養(yǎng)物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板活化，在(28± I) °C恒溫箱中培養(yǎng)5天；
3.G4菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制測(cè)定
在無菌條件下，取喜樹內(nèi)生真菌G4的抗植物病原菌發(fā)酵液10毫升，和滅過菌的處于融化狀態(tài)的90毫升的馬鈴薯葡萄糖瓊脂，按照1:9的比例混合均勻，分別各取15毫升倒在直徑為9厘米無菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，冷卻后在每個(gè)培養(yǎng)基平面放入I個(gè)供試病原菌菌餅(直徑為6毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養(yǎng)基表面，將平板置于28±1°C培養(yǎng)72小時(shí)。采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑，用下述公式計(jì)算抑制率:
權(quán)利要求
1.喜樹內(nèi)生真菌的抗植物病原菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述喜樹內(nèi)生真菌為喜樹內(nèi)生真菌G4，喜樹內(nèi)生真菌G4命名為球毛殼菌G4 (.Chaetomium globosum G4)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2013年3月8日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 7291 ； 具體發(fā)酵制備操作步驟如下 (1)菌種活化 在無菌條件下，將喜樹內(nèi)生真菌G4的菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)溫度28°C ± I °C，恒溫培養(yǎng)7天，得到活化菌種； (2)發(fā)酵培養(yǎng) 用無菌打孔器，將活化菌種打成直徑為6mm菌碟，接種3塊菌碟于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶?jī)?nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ± 1°C，培養(yǎng)7天，得到喜樹內(nèi)生真菌G4發(fā)酵液；過濾除去菌絲體，過O. 22微米過濾器，即得到喜樹內(nèi)生真菌G4的抗植物病原菌發(fā)酵液； 發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第I天，菌體為少量白色的細(xì)絲和菌絲球，菌絲球體積較?。慌囵B(yǎng)第3天，出現(xiàn)大量白色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，白色菌絲球繼續(xù)增多，并且體積變大；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量白色的菌絲球，體積也變大； 所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蒸餾水I升; 所述液體培養(yǎng)基麥芽浸粉25g、蒸餾水I升，pH自然。
全文摘要
本發(fā)明涉及喜樹內(nèi)生真菌的抗植物病原菌發(fā)酵液的制備方法。所述喜樹內(nèi)生真菌命名為球毛殼G4，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2013年3月8日，保藏編號(hào)為CGMCC No.7291；該方法包括以下操作步驟1.菌株活化，2.發(fā)酵培養(yǎng)，得到喜樹內(nèi)生真菌G4發(fā)酵液，發(fā)酵液為黑色；喜樹內(nèi)生真菌G4發(fā)酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，過0.22微米過濾器，即得到喜樹內(nèi)生真菌G4的抗植物病原菌發(fā)酵液。本發(fā)明明確了具有抗菌活性的球毛殼菌G4菌株的抗菌發(fā)酵液的制備方法，通過對(duì)球毛殼菌G4發(fā)酵液的抗菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液對(duì)蘋果腐爛病菌等植物病原菌具有較為顯著的抑制菌絲生長(zhǎng)作用。
文檔編號(hào)A01P3/00GK103255065SQ201310138658
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者花日茂, 曾現(xiàn)銀, 柏鈺, 徐慶慶, 操海群, 吳祥為 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)