專利名稱：：產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物源蛋白，尤其是涉及一種產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法。
背景技術(shù)：
：真菌在地球上的分布極為廣闊，種類亦十分豐富多樣。其中對人類和其他哺乳動物具有致病作用的真菌種類約有200多種，另加上一些可以引起過敏癥狀的真菌，影響人類健康的致病真菌約有300多種，煙曲霉、新型隱球菌及白色假絲酵母被認(rèn)為是造成人類疾病的主要真菌。相對于細菌、病毒和原生動物引起的感染而言，真菌性感染疾病的病例要少的多，但是，真菌性疾病儼然已成為一個嚴(yán)重的國際性問題，許多病人因真菌感染沒有有效的藥物治療而死亡。真菌不僅是人和其他動物致病的重要因素，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上作物病害和食品污染的重要根源。污染了真菌的食品通常都會含有真菌毒素，是人類健康生活中的一個重要安全隱患。許多農(nóng)作物在田間的時候就已經(jīng)污染了真菌及其所產(chǎn)生的毒素，不僅直接造成田間作物生長不良，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量，而且收獲的糧食等也會因污染毒素而降低了產(chǎn)品品質(zhì)，甚至威脅健康，造成巨大的經(jīng)濟損失?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長期使用對環(huán)境和農(nóng)藥施用者的健康威脅較大，破壞農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，影響農(nóng)業(yè)資源的可持續(xù)利用。從自然環(huán)境中尋找新的抗真菌藥物用以解決嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的霉菌病成為了研究熱點。針對以前使用藥物或者化學(xué)試劑的局限性，對未來發(fā)展的新藥提出了一些新的要求藥物在體內(nèi)保持一定的穩(wěn)定性，能夠廉價可持續(xù)生產(chǎn)，抗菌效果好且對人體無毒副作用。曲霉科中的青霉和曲霉是目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)抗真菌蛋白的兩個屬，也是絲狀真菌中僅有的兩個產(chǎn)抗真菌蛋白的兩個屬。曲霉屬中的巨大曲霉、黑曲霉和棒曲霉分別能夠產(chǎn)生AFP、AnAFP以及AcAFP等抗菌蛋白([2]GunLeeD，ShinSY,MaengCY，etal.(1999).IsolationandcharacterizationofanovelantifungalpeptidefromAspergillusniger.Biochem.Biophys.Res.Commun.263:646-651；[5]Skouri-GargouriH，GargouriA(2008).FirstisolationofanovelthermostableantifungalpeptidesecretedbyAspergillusclavatus.Peptides29:1871-1877；[6]WnendtS,UlbrichN，StahlU(1994).Molecularcloning，sequenceanalysisandexpressionofthegeneencodinganantifungal-proteinfromAspergillusgiganteus.CurrentGenetics25:519-523.)，青霉屬中的產(chǎn)黃青霉、納地青霉能夠分泌PAF、NAF、PgAFP等抗真菌蛋白([l]GeisenR(2000).P.nalgiovensecarriesagenewhichishomologoustothepafgeneofP.chrysogenumwhichcodesforanantifungalpeptide.InternationalJournalofFoodMicrobiology62:95-101；[3]MarxF，HaasH，ReindlM，etal.(1995).Cloning,structuralorganizationandregulationofexpressionofthePenicilliumchrysogenumpafgeneencodinganabundantlysecretedproteinwithantifungalactivity.Gene167:167-171；[4]Rodriguez-MamnA，AcostaR，LiddellS，etal.(2010).CharacterizationofthenovelantifungalproteinPgAFPandtheencodinggeneofPenicilliumchrysogenum.Peptides31:541-547.)。這一類真菌蛋白與來自其他生物具相同功能的蛋白在氨基酸序列上沒有很高的同源性，因此可能代表著一類新的抗真菌蛋白家族，但是它們與植物、無脊椎動物和兩棲類生物功能相似的蛋白具有一些共同的特征，它們都是一類小分子量(5158個氨基酸，5.86.6kDa)、富含半胱氨酸殘基的抗真菌蛋白，由于分子內(nèi)含有大量的賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸殘基而使整個分子呈現(xiàn)堿性。在PAF、NAF、PgAFP以及AnAFP分子中，6個半胱氨酸殘基的位置是穩(wěn)定保守的，并且它們之間的氨基酸序列相似度較高，推測這些蛋白也會有相似的高級結(jié)構(gòu)。AcAFP和AFP分子中不僅8個半胱氨酸殘基的位置一致，甚至整個分子全部氨基酸序列僅在第4位和第32位的氨基酸有差別，因此預(yù)測的AcAFP和NMR解析的AFP三級結(jié)構(gòu)也是相似的。AFP分子中第32位的賴氨酸被AcAFP中的纈氨酸所替代，減低了AcAFP分子中所帶的正電荷，提高了蛋白質(zhì)分子的疏水性質(zhì)，這兩個位置氨基酸的差異可能導(dǎo)致AcAFP比AFP具有更高的熱穩(wěn)定性，并且可能與AcAFP和AFP抗菌方面的種特異性有關(guān)。分子內(nèi)的68個半胱氨酸殘基形成二硫鍵，使整個分子形成緊致的結(jié)構(gòu)，對熱和蛋白酶具有一定的抗性。這些絲狀真菌來源的抗菌蛋白對一系列動物和植物致病真菌具有明顯的抑制作用，對敏感真菌的最低抑制濃度低至微摩爾水平，與一些常用的抗真菌類藥物的藥效不相上下，比如兩性霉素B、卡泊芬凈、伊曲康唑以及伏立康唑等。已報道對這類絲狀真菌來源的抗真菌蛋白敏感的真菌主要有鐮刀菌屬、犁頭霉屬、被孢霉屬、根毛霉屬、根霉菌屬、曲霉屬、青霉屬、毛霉菌屬、地絲菌屬、絲衣霉屬、葡萄孢屬、鏈格孢屬以、木霉屬、稻瘟病菌以及馬鈴薯晚疫病菌等不同種屬的真菌。該絲狀真菌產(chǎn)生的抗真菌蛋白還具備新時期藥物發(fā)展方向的特征，比如其毒理作用的特異性、可持續(xù)生產(chǎn)以及環(huán)境友好型等特點。由于抗真菌蛋白與當(dāng)前臨床使用藥物不一樣且獨特的作用機制而備受青睞，基于抗菌肽(蛋白)的治療比之于目前廣泛使用的抗生素治療方法具有一些特有的優(yōu)點所在，因此是未來臨床醫(yī)學(xué)的候補藥品。利用基因工程技術(shù)在植物體表達各種不同來源的抗菌肽(蛋白)使轉(zhuǎn)基因作物獲得對致病菌的拮抗作用已取得一定的成就。然而，盡管抗真菌蛋白在自然界廣泛存在并具有一些優(yōu)良的特性，卻基本未見直接應(yīng)用這類抗真菌蛋白于食品保藏和臨床治療相關(guān)真菌疾病。這是由于在臨床醫(yī)療上使用這些抗菌肽(蛋白)還面臨著一些挑戰(zhàn)。但是，顯而易見的是，來自絲狀真菌青霉和曲霉的抗真菌蛋白符合未來藥物發(fā)展方向的許多必備特征，在未來抗真菌藥物研究領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展空間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種產(chǎn)黃青霉A096(PenicilliumchrysogenumA096)。本發(fā)明的目的之二在于提供一種產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過MALDI-T0F-T0F鑒定產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的部分肽段氨基酸序列，并根據(jù)此序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中資料的比較鑒定了該蛋白的性質(zhì)。本發(fā)明所述產(chǎn)黃青霉A096(PenicilliumchrysogenumA096)已于2010年10月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0:M2010270，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。本發(fā)明所述產(chǎn)黃青霉A096(PenicilliumchrysogenumA096)是從中國第三次北極科學(xué)考察獲得的樣品中分離純化而得到。本發(fā)明所述產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的3個肽段氨基酸序列均在假定蛋白Pc21gl2970序列中，具體如下序列中劃線標(biāo)記序列所示MKVTALLFTLMAATAVSASVLDTRDTCGGGYGVDQRRTNSPCQASNGDRHFCGCDRTGIVECKGGKWTEIQDCGGASCRGVSQGGARC本發(fā)明所述產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法包括以下步驟1)從平板上挑取產(chǎn)黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，所得菌體培養(yǎng)液取上清；2)在步驟1)所得的上清中加入飽和硫酸銨，得混合溶液；3)將混合溶液離心，獲得的沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；4)將步驟3)獲得的粗蛋白溶液透析，離心，以除去不溶性雜質(zhì)，分裝保存；5)將步驟4)所得的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱上分離純化，按紫外吸收峰出現(xiàn)的先后順序依次收集各洗脫組分，各組分利用超濾濃縮管離心超濾濃縮后，利用對該粗蛋白溶液敏感的受試真菌為指示菌跟蹤活性組分，抗真菌活性檢測方法為紙片法；6)將步驟幻濃縮后具有活性的非吸附組分繼續(xù)在羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱上分離純化，同樣按紫外吸收峰出現(xiàn)的先后順序依次收集各洗脫組分，各組分利用超濾濃縮管離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，采用紙片法予追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分根據(jù)SDS-PAGE電泳圖判斷獲得蛋白的純度；7)割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，并經(jīng)滅菌去離子水洗滌后，進行MALDI-TOF-TOF鑒定。在步驟1)中，所述SGY液體培養(yǎng)基的組成成分及按質(zhì)量百分比含量為每IOOmL液體培養(yǎng)基中含1%葡萄糖，黃豆粉，0.5%酵母提取物及0.25%NaCl，其余為去離子水；所述搖瓶培養(yǎng)的條件可為^°C，ISOrpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5d；所述上清可將所得菌體培養(yǎng)液通過抽濾的方法獲得。在步驟2、中，所得混合溶液可于4°C條件下靜置過夜。在步驟3)中，所述離心，可將混合溶液于4°C，14000g下離心30min。在步驟4)中，所述透析可在4°C條件下透析；所述離心，可于4°C，8000g條件下離心20min。在步驟5)中，所述離心，可于4°C，5000g條件下離心；所述受試真菌可選自宛氏擬青霉等；所述抗真菌活性檢測方法的具體步驟如下在距受試真菌菌絲邊緣約0.8cm處放置直徑為0.65cm無菌紙片，并在各紙片上分別加上40μL的以上各濃縮組分和空白對照(洗脫緩沖液)，將受試菌平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至可觀察到對菌絲明顯抑制作用的現(xiàn)象為止。在步驟6)中，所述離心，可于4°C，5000g條件下離心。在步驟7)中，所述進行MALDI-T0F-T0F鑒定，可寄送至中科院上海生命科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究分析中心進行MALDI-T0F-T0F鑒定。本發(fā)明采用鹽析、透析、陰離子交換色譜、陽離子交換色譜、超濾濃縮等方法從產(chǎn)黃青霉A096培養(yǎng)上清中分離純化到對若干株植物致病真菌綠色木霉、長柄鏈格孢以及宛氏擬青霉具有明顯可見抑制作用的蛋白，命名為Pc-Arctin。通過MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜鑒定了該蛋白的3個肽段序列，發(fā)現(xiàn)此3個肽段序列均在假定蛋白Pc21gU970序列中，而該假定蛋白的功能尚未闡述。本發(fā)明分離純化并鑒定的Pc-Arctin蛋白與通過產(chǎn)黃青霉基因序列預(yù)測的假定蛋白Pc21gl四70相近，但對該預(yù)測蛋白的功能尚無描述。Pc21gl四70蛋白與由短密青霉分泌產(chǎn)生的biAble蛋白序列相似性很高，關(guān)于后者的具體功能，也僅僅處于推測水平，biAble蛋白被認(rèn)為起著與酵母嗜殺毒素一樣的功能。本發(fā)明首次證實了與假定蛋白Pc21gU970相近的Pc-Arctin具有一定的抗真菌作用，對于研究確認(rèn)假定蛋白Pc21gU970和biAble蛋白功能具有積極的提示意義，同時在生產(chǎn)上具有深入開發(fā)研究的價值。圖1為產(chǎn)黃青霉A096蛋白成分在DEAE-s印haroseFastFlow柱上的色譜分離。在圖1中，橫坐標(biāo)為時間(min)，縱坐標(biāo)為紫外吸收值(mAU)；標(biāo)記A表示非吸附組分，B表示吸附組分。圖2為非吸附組分A在CM-s印haroseFastFlow柱分離效果圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為時間(min)，縱坐標(biāo)為紫外吸收值(mAU)；標(biāo)記C表示非吸附組分，D表示吸附組分。圖3為純化產(chǎn)物Pc-Arctin的SDS-PAGE電泳圖譜。在圖3中，左邊泳道M表示為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)MARKER，右邊泳道P表示為純化產(chǎn)物Pc-Arctin。圖4為純化產(chǎn)物Pc-Arctin對敏感真菌長柄鏈格孢的抑制作用效果圖。在圖4中，1為Pc-Arctin，2為溶解Pc-Arctin的緩沖液作為空白對照。圖5為純化產(chǎn)物Pc-Arctin對敏感真菌宛氏擬青霉的抑制作用效果圖。在圖5中，1為Pc-Arctin，2為溶解Pc-Arctin的緩沖液作為空白對照。圖6為二倍稀釋法檢測Pc-Arctin對綠色木霉的最低抑制濃度。在圖6中，15依次分別表示為3.04μg/紙片、1.52μg/紙片、0.76μg/紙片、0.38μg/紙片以及0.19μg/紙片，6則表示為溶解Pc-Arctin的緩沖液(pH8.10,20mMTris)。圖7為二倍稀釋法分別檢測Pc-Arctin對宛氏擬青霉的最低抑制濃度。在圖7中，15依次分別表示為0.4208μg/紙片、0.2104μg/紙片、0.1052μg/紙片、0.0526μg/紙片以及0.0263μg/紙片，c則表示為溶解Pc-Arctin的緩沖液(pH8.10,20mMTris)。圖8為二倍稀釋法分別檢測Pc-Arctin對長柄鏈格孢的最低抑制濃度。在圖8中，16依次分別表示為1.^yg/紙片、0.64μg/紙片、0.32μg/紙片、0.Wyg/紙片、0.OSyg/紙片以及O.CMyg/紙片，7則表示為溶解Pc-Arctin的緩沖液(pH8.10,20mMTris)ο圖9表示為0.05%SDS對Pc-Arctin抗真菌活性的影響效果。1表示未經(jīng)SDS處理的Pc-Arctin，2表示為未加0.05%SDS的緩沖液(pH8.10,20mMTris)作為空白對照，3表示為經(jīng)SDS處理的Pc-Arctin，4表示為加入0.05%SDS的緩沖液(PH8.10,20mMTris)作為空白對照。具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細的說明。1.菌種本發(fā)明涉及菌株產(chǎn)黃青霉A096來源于本申請人從中國第三次北極科學(xué)考察期間采集樣品中所分離獲得，是一株培養(yǎng)上清對宛氏擬青霉、長柄鏈格孢以及綠色木霉具有明顯菌絲生長抑制活性的絲狀真菌。2.培養(yǎng)基SGY(黃豆粉葡萄糖)液體培養(yǎng)基葡萄糖，黃豆粉，0.5%酵母提取物及0.25%NaCl，配制培養(yǎng)基時加去離子水定容至100mL。實施例1產(chǎn)黃青霉A096蛋白成分在DEAE-sepharoseFastFlow柱上的色譜分離用起始緩沖液(PH8.10，20mMTris)平衡DEAE-s印haroseFastFlow柱，把產(chǎn)黃青霉A096粗蛋白成分在DEAE-s印haroseFastFlow柱上樣后，繼續(xù)用兩個柱體積的起始緩沖液起始緩沖液(PH8.10,20mMTris)沖洗柱子，洗脫獲得低鹽濃度條件下在DEAE-sepharoseFastFlow柱非吸附成分A，繼而用洗滌緩沖液(PH8.10，20mMTris,IMNaCl)繼續(xù)沖洗DEAE-s印haroseFastFlow柱，獲得吸附組分B(圖1)。實施例2非吸附組分A在CM-s印haroseFastFlow柱色譜分離同樣使用起始緩沖液(PH8.10，20mMTris)平衡CM_s印haroseFastFlow柱，把在DEAE柱上的非吸附組分A在CM-s印haroseFastFlow柱上樣，使用兩個柱體積的起始緩沖液(PH8.10,20mMTris)沖洗柱子，獲得非吸附組分C；繼而在十個柱體積內(nèi)使起始緩沖液(PH8.10,20mMTris)完全轉(zhuǎn)換為洗滌緩沖液(PH8.10,20mMTris,IMNaCl)，并獲得在CM-s印haroseFastFlow柱上的吸附組分D(圖2)。實施例3純化產(chǎn)物Pc-Arctin的SDS-PAGE電泳圖譜純化的組分D在電壓180V，常溫條件下跑15%SDS-PAGE電泳，經(jīng)硝酸銀快速染色檢測組分D的純度，電泳染色圖譜顯示，純化獲得的組分D在銀染條件下只有一條單一的條帶被顯色出來，該蛋白被命名為Pc-Arctin。實施例4純化產(chǎn)物Pc-Arctin對敏感真菌長柄鏈格孢的抑制效果將長柄鏈格孢菌塊接種至PDA(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)，200g馬鈴薯煮沸30min，用八層紗布過濾后得濾液，濾液中加入20g葡萄糖和15g瓊脂，加去離子水定容至1L)平板上，于條件下培養(yǎng)至菌絲充分伸展，在離菌絲約0.8cm處放置無菌紙片，并在紙片上滴加40微升純化的Pc-Arctin，在另一紙片上滴加溶解Pc-Arctin的緩沖液作為空白對照(圖4)。實施例5純化產(chǎn)物Pc-Arctin對敏感真菌宛氏擬青霉的抑制效果將宛氏擬青霉菌塊接種至PDA(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)，200g馬鈴薯煮沸30min，用八層紗布過濾后得濾液，濾液中加入20g葡萄糖和15g瓊脂，加去離子水定容至1L)平板上，于條件下培養(yǎng)至菌絲充分伸展，在離菌絲約0.8cm處放置無菌紙片，并在紙片上滴加40微升純化的Pc-Arctin，在另一紙片上滴加溶解Pc-Arctin的緩沖液作為空白對照(圖5)。實施例6=Pc-Arctin對三種敏感真菌的最低抑制濃度的測定用滅菌打孔器將受試霉菌制成菌塊，每個菌塊直徑約0.65mm,用牙簽挑取菌塊于PDA平板上，280C的條件下培養(yǎng)，等待霉菌菌絲體擴散生長后，在每個菌塊旁放置滅菌的直徑0.65mm的雙層濾紙片，紙片距離菌絲邊緣相等距離。利用二倍稀釋法將最高濃度的蛋白溶液用緩沖液A(PH8.10，20mMTris)依次稀釋并過濾除菌，在每個紙片上加40μL的各個濃度的蛋白質(zhì)溶液，并以緩沖液A為陰性對照，PDA平板置于25條件下培養(yǎng)若干天(依不同受試菌株生長速度而異)。最低抑制濃度(MIC，minimalinhibitionconcentration)定義為隨著各個紙片上蛋白質(zhì)含量的降低，紙片周圍出現(xiàn)的對霉菌菌絲的抑制程度逐漸減弱，最終與陰性對照無差別，即能夠觀察到對霉菌菌絲抑制現(xiàn)象的最低蛋白含量，記為Pg/紙片。采用二倍稀釋法，我們測定Pc-Arctin對綠色木霉、宛氏擬青霉以及長柄鏈格孢的最低抑制濃度分別為0.19μg/紙片、0.0263μg/紙片和0.04μg/紙片(圖68)。從獲得的數(shù)據(jù)可知，Pc-Arctin在低濃度范圍內(nèi)對以上三種真菌具有良好的生長抑制作用，在進一步研究開發(fā)抗真菌藥物方面具有可參考的重要價值。實施例7表面活性劑對Pc-Arctin活性的影響本實驗選用宛氏擬青霉做為活性蛋白性質(zhì)研究的受試菌；采用打孔接種法制備受試霉菌平板；表面活性劑tween20、tritonX-100、SDS和尿素等配制于緩沖液A溶液中；表面活性劑溶液和活性蛋白溶液混勻后于37°C條件下，放置lh，再加到無菌濾紙片上，以不加表面活性劑的活性蛋白質(zhì)溶液為陽性對照，緩沖液A和表面活性劑溶液分別作為陰性對照。實驗結(jié)果表明，0.05%SDS對Pc-Arctin的抗真菌活性有微弱的抑制作用(圖9)，而0.05%TritonX-100以及濃度的尿素和Tween20對Pc-Arctin活性均無明顯的抑制作用(資料圖片未展示)。該實驗證明了本發(fā)明涉及的蛋白不僅具有抗真菌的活性功能，同時對特定的表面活性劑還具有一定的耐受能力。權(quán)利要求1.產(chǎn)黃青霉A096(PenicilliumchrysogenumA096)，所述產(chǎn)黃青霉A096(PenicilliumchrysogenumA096)已于2010年10月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2010270，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。2.產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin，其特征在于所述產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的3個肽段氨基酸序列均在假定蛋白Pc21gU970序列中，具體如下序列中劃線標(biāo)記序列所示MKVTALLFTLMAATAVSASVLDTRDTCGGGYGVDQRRTNSPCQASNGDRHFCGCDRTGIVECKGGKWTEIQDCGGASCRGVSQGGARC。3.如權(quán)利要求2所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)從平板上挑取產(chǎn)黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，所得菌體培養(yǎng)液取上清；2)在步驟1)所得的上清中加入飽和硫酸銨，得混合溶液；3)將混合溶液離心，獲得的沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；4)將步驟3)獲得的粗蛋白溶液透析，離心，以除去不溶性雜質(zhì)，分裝保存；5)將步驟4)所得的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜柱上分離純化，按紫外吸收峰出現(xiàn)的先后順序依次收集各洗脫組分，各組分利用超濾濃縮管離心超濾濃縮后，利用對該粗蛋白溶液敏感的受試真菌為指示菌跟蹤活性組分，抗真菌活性檢測方法為紙片法；6)將步驟幻濃縮后具有活性的非吸附組分繼續(xù)在羧甲基(CM)陽離子交換色譜柱上分離純化，同樣按紫外吸收峰出現(xiàn)的先后順序依次收集各洗脫組分，各組分利用超濾濃縮管離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，采用紙片法予追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分根據(jù)SDS-PAGE電泳圖判斷獲得蛋白的純度；7)割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，并經(jīng)滅菌去離子水洗滌后，進行MALDI-T0F-T0F鑒定。4.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述SGY液體培養(yǎng)基的組成成分及按質(zhì)量百分比含量為每IOOmL液體培養(yǎng)基中含葡萄糖，黃豆粉，0.5%酵母提取物及0.25%NaCl，其余為去離子水。5.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述搖瓶培養(yǎng)的條件為^°C，ISOrpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5d；所述上清是將所得菌體培養(yǎng)液通過抽濾的方法獲得。6.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所得混合溶液于4°C條件下靜置過夜。7.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述離心，是將混合溶液于4°C，14000g下離心30min。8.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述透析是在4°C條件下透析；所述離心，是于4°C，SOOOg條件下離心20min。9.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述離心，是于4°C，5000g條件下離心；所述受試真菌選自宛氏擬青霉；所述抗真菌活性檢測方法的具體步驟如下在距受試真菌菌絲邊緣約0.8cm處放置直徑為0.65cm無菌紙片，并在各紙片上分別加上40μL的以上各濃縮組分和空白對照，將受試菌平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至觀察到對菌絲明顯抑制作用的現(xiàn)象為止。10.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述離心，是于40C，5000g條件下離心。全文摘要產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法，涉及一種微生物源蛋白。從平板上挑取產(chǎn)黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取上清，加入飽和硫酸銨得混合溶液，離心，沉淀物重溶于水中得粗蛋白溶液，經(jīng)透析，離心；將所得的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基陰離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，離心超濾濃縮后，跟蹤活性組分；將濃縮后具有活性的非吸附組分繼續(xù)在羧甲基陽離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，各組分離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分判斷獲得蛋白的純度；割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，進行MALDI-TOF-TOF鑒定。文檔編號C07K1/18GK102337223SQ20111030904公開日2012年2月1日申請日期2011年10月13日優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日發(fā)明者敖敬群,陳志騰,陳新華申請人:國家海洋局第三海洋研究所