專(zhuān)利名稱(chēng)：一種降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
一種降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，尤其涉及一種降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株及應(yīng)用其制備辛硫磷的降解菌劑。
背景技術(shù)：
隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，病蟲(chóng)害增多，農(nóng)藥用量增大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年通過(guò)植物保護(hù)方法增加的產(chǎn)量有80%依靠農(nóng)藥。有機(jī)磷農(nóng)藥一直是中國(guó)用量最大的農(nóng)藥種類(lèi)，每年都在十萬(wàn)噸以上。但是農(nóng)藥在提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，提高人們生活質(zhì)量的同時(shí)，也給人類(lèi)和動(dòng)物帶來(lái)了巨大的危害，同時(shí)還帶來(lái)了很大的環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題。辛硫磷是一種常用的有機(jī)磷農(nóng)藥，主要用于防治地下害蟲(chóng)，在土壤中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，長(zhǎng)期累積易造成環(huán)境污染。
生物修復(fù)法是利用微生物或植物或動(dòng)物將土壤、地下水或海洋中的污染物降解、吸收或富集的生物工程技術(shù)。它主要可分為三種類(lèi)型植物修復(fù)技術(shù)、微生物修復(fù)技術(shù)和菌根修復(fù)技術(shù)。其中微生物修復(fù)技術(shù)是從污染土壤、水體中篩選出能降解污染物的真菌、細(xì)菌、放線菌、固氮菌、酵母菌和霉菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室馴化、修飾來(lái)提高其降解能力，制成菌劑再放入被污染領(lǐng)域中，是目前研究較多的領(lǐng)域。目前據(jù)公開(kāi)資料報(bào)道過(guò)的辛硫磷的降解菌主要有鄰單胞菌屬(Plesiomonassp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、玫瑰單胞菌屬(Rosemonas sp·)、戴爾福特菌屬(Delftia sp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopesudomonasplaustris)、芽抱桿菌屬(Bacillus spp.)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.),大部分處于理論研究階段,還不足以進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用。將淡紫擬青霉用于對(duì)辛硫磷的降解為發(fā)明人首次報(bào)道并制備成菌劑應(yīng)用于田間。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種能夠降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株，該菌株為淡紫擬青霉菌株FJAT-9041 (Paecilomyces Iilacinus),且該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041于2012年05月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC NO 6110，并利用該囷株制備羊硫憐的降解囷劑。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的本申請(qǐng)人從福建省福州市閩侯縣的番茄根際土壤中分離得到的菌株，通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行病原形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，最終鑒定其為淡紫擬青霉的一個(gè)菌株。進(jìn)一步地，利用該菌株制備辛硫磷的降解菌劑，其制備方法的具體步驟如下(I)所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的活化用接種環(huán)將所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30 0C ；(2)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)所獲得的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度設(shè)定為30°C，振蕩培養(yǎng)24h后即得種子液；(3)降解菌劑的制備將步驟(2)獲得的種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，通氣量I : I. 2，溫度設(shè)定為30°C ;在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中每隔一段時(shí)間取適量的發(fā)酵液測(cè)定其孢子濃度，當(dāng)測(cè)定的孢子濃度值達(dá)到2. OX 108CFU/mL時(shí)則發(fā)酵完成；然后將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液直接以包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附劑吸附后用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。其中，所述步驟(I)中PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g,水 IOOOmL ； 所述步驟(2)中種子培養(yǎng)基與步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水余量；且該培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比。本發(fā)明的有益效果在于提供一種淡紫擬青霉菌株FJAT-9041 (Paecilomyceslilacinus),并利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備辛硫磷的降解菌劑,該降解菌劑對(duì)辛硫磷的降解效率很高，使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生產(chǎn)過(guò)程中正常使用有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷進(jìn)行病蟲(chóng)害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量符合人體健康要求，另外，該降解菌劑的制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉、且對(duì)環(huán)境及人體無(wú)害，可進(jìn)行無(wú)害化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式本發(fā)明中淡紫擬青霉菌株FJAT-9041 (Paecilomyces IiIacinus)是從福建省福州市閩侯縣的番茄根際土壤中分離得到的菌株，并揭露了利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備降解菌劑的方法。一、該菌株FJAT-9041的分離(I)樣品的采集取番茄根際土壤約IOOOg裝入采集袋中，采集袋中裝入標(biāo)簽并在標(biāo)簽上注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、寄主等，同時(shí)在采樣記錄本上詳細(xì)記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)、寄主、土壤類(lèi)型等樣品采集后，低溫保存，在一個(gè)月內(nèi)分離真菌，備用；(2)分離菌株(采用選擇性培養(yǎng)基法)配置Czapek培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基；取上述備用的土樣5g并加至裝有IOOmLCzapek培養(yǎng)基的三角瓶中，且往該三角瓶?jī)?nèi)添加辛硫磷至濃度為40μ g/mL ;然后將三角瓶置于28°C、110r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5天；接著取ImL培養(yǎng)獲得的菌液并轉(zhuǎn)至新鮮的Czapek培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并添加辛硫磷至該培養(yǎng)基中辛硫磷濃度為400μ g/mL ;之后取繼續(xù)培養(yǎng)獲得的菌液按10倍梯度稀釋至10_7，將稀釋液涂布于辛硫磷濃度為800 μ g/mL的PDA平板培養(yǎng)基上，并28 °C恒溫培養(yǎng)，待PDA平板培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落上的菌絲體通過(guò)連續(xù)劃線分離，得到純化的菌株，并將該菌株保存于PDA培養(yǎng)基斜面。其中，Czapek培養(yǎng)基的組分為=KCl O. 5g，K2HPO4Ig, NaN033g，MgSO4 · 7H20 O. 5g，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 O.Olg，蔗糖30g，水1000mL;PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂 20g，水 IOOOmL0二、該菌株FJAT-9041的鑒定I.初步鑒定-病原形態(tài)學(xué)鑒定病原形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)Booth (1971)的鑒定方法進(jìn)行初步鑒定測(cè)定上述保存于PDA培養(yǎng)基斜面上的菌株的單孢菌落的生長(zhǎng)速度、孢子形態(tài)及產(chǎn)孢細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌落在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，直徑可達(dá)約3. 5cm，正面顏色呈淡紫色，突起，表面粉質(zhì)，輪紋明顯，背面無(wú)色或紫紅色；菌絲無(wú)色，有隔膜；分生孢子梗直立，輪狀分枝，2 4個(gè)瓶梗輪狀排列在孢子梗上；瓶?；颗虼?，頂端稍細(xì)長(zhǎng)，約I μ m長(zhǎng)，瓶梗大小為7. 5^12. 5 X 2. 5^3. O μ m ;分生孢子橢圓形至紡錘形，表面光滑，大小為2. 5^4. 0X2. 0 2· 5μ m。依據(jù)Booth (1971)的鑒定結(jié)果，初步確定該菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。2.進(jìn)一步鑒定一分子生物學(xué)鑒定(I)菌株菌絲體的培養(yǎng)和收集供試菌株(即上述保存于PDA培養(yǎng)基斜面上的菌株)經(jīng)單孢培養(yǎng)后，采用玻璃紙平板培養(yǎng)法收集菌絲。具體地，在直徑為9cm培養(yǎng)皿中倒入PDA培養(yǎng)基約12mL，待凝固后，放入與培養(yǎng)皿等大的滅菌玻璃紙，該玻璃紙上接種3飛塊直徑為6mm的菌餅，28°C下培養(yǎng)72h，刮取菌絲，經(jīng)真空冷凍干燥后置于_80°C冰箱保存?zhèn)溆茫?
(2)基因組DNA的提取稱(chēng)取(I)中獲得的干菌絲O. 05g于預(yù)冷的無(wú)菌研缽中，并加入液氮研磨至細(xì)粉狀，之后迅速轉(zhuǎn)入I. 5mL離心管中，參照Invitrogen公司的TRIzol Reagent (Cat. No. 15596-018)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取菌株的基因組DNA ；(3)菌株 FJAT-9041 的鑒定采用引物ITS4和ITS5 (White, 1990)進(jìn)行rDNA-ITS序列的擴(kuò)增。引物ITS4和ITS5委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成儀合成引物序列分別為 ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ；ITS5 :5， -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，；以提取所獲得的菌株的基因組DNA為模板，上述引物(ITS4/ITS5)為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μ I 體系):DNA 模板 10_20ng，Ex Taq(5U/y L)0. 125mL, 10XPCR 緩沖液 2· 5 μ L，Dntp (2. 5mM) 2mL，引物(10 μ M)各 I μ L，加無(wú)菌水至 25 μ L ；擴(kuò)增條件94°C5min;接著 94°C lmin,54°C lmin,72°C Imin 共 35 個(gè)循環(huán)；最后72°C IOmin。PCR產(chǎn)物的測(cè)序與分析將rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序(測(cè)得的序列如SEQ ID NO. I所示)。序列分析的結(jié)果通過(guò)國(guó)際互連網(wǎng)進(jìn)行核酸同源性檢索，得到相似性最高的均為淡紫擬青霉，其中與基因庫(kù)編碼為AB124670的淡紫擬青霉ITS序列同源性最高，達(dá)到99%。通過(guò)上述的鑒定,可確定該菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。三、辛硫磷降解菌劑的制備步驟(I)淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的活化用接種環(huán)將淡紫擬青霉菌株FJAT-9041劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上,并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,培養(yǎng)溫度設(shè)定為30°C ；(2)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)所獲得的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度設(shè)定為30°C，振蕩培養(yǎng)24h后即得種子液；(3)降解菌劑的制備將步驟(2)獲得的種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，通氣量I : I. 2，溫度設(shè)定為30°C ;在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中每隔一段時(shí)間取適量的發(fā)酵液測(cè)定其孢子濃度，當(dāng)測(cè)定的孢子濃度值大袋2. OX 108CFU/mL時(shí)則發(fā)酵完成；然后將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液直接以包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附劑吸附后用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。其中，步驟(I)中PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水IOOOmL ;步驟(2)中種子培養(yǎng)基與步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水余量；且該培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比。四、降解菌劑對(duì)辛硫磷的降解試驗(yàn) 試驗(yàn)I降解菌劑對(duì)辛硫磷的室內(nèi) 降解試驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，以上述所制備的降解菌劑作為處理組，以不接種淡紫擬青霉的空白液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，其余處理步驟完全相同；在實(shí)驗(yàn)組的樣品中加入4%的辛硫憐乳液Iml,使羊硫憐在樣品中的添加濃度達(dá)到400 μ g/ml,并于恒溫?fù)u床繼續(xù)振湯培養(yǎng)5天，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度設(shè)定為30°C ;且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均設(shè)三個(gè)重復(fù)。取樣檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的辛硫磷殘留量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表I。由表I可知，經(jīng)降解菌劑處理5天后，辛硫磷的降解率均達(dá)到97%以上；而對(duì)照的自然降解率只有5. 46%。表I降解菌劑對(duì)辛硫磷的降解效果
權(quán)利要求
1.一種降解羊硫憐的淡紫擬青霉囷株，其特征在于所述囷株為淡紫擬青霉囷株FJAT-9041 (Paecilomyces Iilacinus),于2012年05月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0. 6110。
2.一種辛硫磷的降解菌劑，其特征在于其制備方法的具體步驟如下 (1)權(quán)利要求I中所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的活化用接種環(huán)將權(quán)利要求I中所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30°C ； (2)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)所獲得的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm,溫度設(shè)定為30°C,振蕩培養(yǎng)24h后即得種子液； (3)降解菌劑的制備將步驟(2)獲得的種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，通氣量I : I. 2，溫度設(shè)定為30°C;在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中每隔一段時(shí)間取適量的發(fā)酵液測(cè)定其孢子濃度，當(dāng)測(cè)定的孢子濃度值達(dá)到2. OX 108CFU/mL時(shí)則發(fā)酵完成；然后將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液直接以包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附劑吸附后用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種辛硫磷的降解菌劑，其特征在于所述步驟(I)中PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水IOOOmL ； 所述步驟(2)中種子培養(yǎng)基與步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水余量；且該培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比。
全文摘要
本發(fā)明從福建省福州市閩侯縣的番茄根際土壤中分離得到菌株，該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041(Paecilomyces lilacinus)，于2012年05月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO．6110，并揭露了利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041(Paecilomyces lilacinus)制備辛硫磷的降解菌劑的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供一種淡紫擬青霉菌株FJAT-9041(Paecilomyces lilacinus)，并利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備辛硫磷的降解菌劑，獲得的降解菌劑對(duì)辛硫磷的降解效率很高。
文檔編號(hào)A62D101/28GK102796671SQ20121027640
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者劉波, 黃素芳, 史懷, 李芳 , 朱育菁, 唐建陽(yáng) 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所