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一種對關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用的藥物及驗證方法與流程

文檔序號:11838482閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種對關(guān)節(jié)軟骨退變調(diào)控作用的藥物,其特征在于,該對關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用及機制的藥物為miRNA-140。

2.一種驗證權(quán)利要求1所述的對關(guān)節(jié)軟骨退變調(diào)控作用的藥物miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法,其特征在于,驗證在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法為:

首先驗證miRNA-140在人正常及骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律;

其次篩選miRNA-140轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞的最佳條件;

最后驗證miRNA-140表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對人OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及機制。

3.如權(quán)利要求2所述的驗證在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法,其特征在于,驗證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法具體為:

(1)根據(jù)Kellgren and Lawrence OA影像學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn),收集人正常及輕、中、重度OA新鮮軟骨標(biāo)本,體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行鑒定;

(2)采用熒光定量PCR法檢測正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)水平,分析其表達(dá)變化規(guī)律;

(3)采用不同濃度的miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后不同時間點通過PCR和Western blotting法檢測細(xì)胞Collagen Ⅱ及MMP13基因和蛋白表達(dá)水平,篩選miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的最佳濃度及效果檢測最佳時間,所述不同濃度為0、25、50、100及200nM;

(4)采用最佳濃度的miRNA-140mimic或miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染正常及OA軟骨細(xì)胞,在最佳時間檢測細(xì)胞Collagen Ⅱ、MMP13、ADAMTS-5、Sox9及Runx2基因及蛋白表達(dá)水平,比較miRNA-140上調(diào)或下調(diào)后各組軟骨細(xì)胞中上述基因及蛋白表達(dá)差異,分析miRNA-140對OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機制。

4.一種驗證權(quán)利要求1所述的對關(guān)節(jié)軟骨退變調(diào)控作用的藥物miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法,其特征在于,驗證miRNA-140在在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法為:

檢測人正常及OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140的表達(dá)規(guī)律,并驗證miRNA-140表達(dá)水平與OA嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

5.如權(quán)利要求4所述的驗證miRNA-140在在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法,其特征在于,驗證miRNA-140在在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法具體為:

根據(jù)KL影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn),收集正常及輕、中、重度OA患者膝關(guān)節(jié)液標(biāo)本各10例;

采用實時熒光定量PCR法檢測各組關(guān)節(jié)液中miRNA-140的表達(dá)水平,采用單因素ANOVA方差分析比較正常及不同程度OA患者關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)差異;

通過Spearman等級相關(guān)秩和檢驗驗證關(guān)節(jié)液中miRNA-140相對表達(dá)量與KL分級之間的相關(guān)性。

6.一種驗證權(quán)利要求1所述的對關(guān)節(jié)軟骨退變調(diào)控作用的藥物關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用方法,其特征在于,該驗證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用方法為:通過構(gòu)建大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型并進(jìn)行鑒定。

7.如權(quán)利要求6所述的驗證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用方法,其特征在于,該驗證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用方法具體為:

以3月齡發(fā)育成熟的SPF級SD大鼠為對象,取大鼠12只,其中3只作為正常對照,其余9只采用手術(shù)切除內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶的方法建立大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型,在術(shù)后第4、8及12周各處死3只,通過大體觀察、組織切片染色及Mankin’s評分對OA模型進(jìn)行鑒定;

取大鼠42只,其中6只作為正常對照,不做任何處理;其余36只隨機分為實驗組和對照組,每組各18只,在建模術(shù)后1周時通過關(guān)節(jié)腔穿刺向?qū)嶒灲M大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射5nmol/100μl miRNA-140agomir,對照組注射相同劑量的miRNA-140control,觀察兩組大鼠關(guān)節(jié)腔注射后有無并發(fā)癥;

在建模術(shù)后第4、8及12周每組各處死6只大鼠,通過大體觀察、組織化學(xué)染色及Mankin’s評分方法比較兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變程度;

通過免疫組織化學(xué)染色及蛋白表達(dá)平均光密度值比較兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況,驗證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用及分子機制。

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