本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，涉及一種提取土壤微生物總DNA的方法及其在土壤微生態(tài)分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的土壤微生態(tài)分析大多是通過對土壤中的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察其生長性狀和生理生化性質(zhì)。然而，由于土壤中有高達(dá)99％-99.9％的微生物難以分離培養(yǎng)，這種傳統(tǒng)方法具有較大局限性。因此人們提出了微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，直接使用分子手段研究土壤的微生態(tài)。而微生物分子生態(tài)學(xué)應(yīng)用于土壤微生態(tài)研究的關(guān)鍵的一個步驟就是從土壤中提取微生物總DNA。土壤微生物總DNA的提取，主要的難題在于土壤顆粒可能緊密吸附微生物菌體或DNA，導(dǎo)致提取困難；同時土壤中含有大量腐殖酸、酚類、重金屬離子等雜質(zhì)，直接影響后續(xù)的PCR、酶切等操作。一般土壤微生物總DNA的提取包括物理法(如凍融、研磨、超聲破碎等)，化學(xué)法(如使用表面活性劑等)和生物法(如使用溶菌酶、蛋白酶等)。各種方法均具有不同的優(yōu)點和缺點，將其結(jié)合是目前主流的研究方向。目前，已經(jīng)有報道了高溫裂解法、SDS-CTAB裂解法、酶裂解法等方法進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，亦有商業(yè)化試劑盒上市。然而這些方法得到的DNA產(chǎn)量較小，且雜質(zhì)移除率不能滿足需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的方法提取得到的DNA產(chǎn)量較小、純度較低的缺陷，提供一種提取土壤微生物總DNA的方法及其在土壤微生 態(tài)分析中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法可以有效地提取土壤微生物的總DNA，且產(chǎn)物產(chǎn)量大、純度高，能夠滿足各類后續(xù)操作要求。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在提取土壤微生物總DNA時，通過采取在土壤微生物細(xì)胞破碎處理之前對土壤進(jìn)行包括用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤和用異丙醇洗滌土壤的預(yù)處理的方式，能夠顯著提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。因此，為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種提取土壤微生物總DNA的方法，所述方法包括土壤微生物細(xì)胞破碎處理、DNA純化處理和DNA溶解處理，其中，在土壤微生物細(xì)胞破碎處理之前對土壤進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤和用異丙醇洗滌土壤。第二方面，本發(fā)明提供了上述方法在土壤微生態(tài)分析中的應(yīng)用。本發(fā)明的提取土壤微生物總DNA的方法，可以有效地提取來自不同性質(zhì)土壤的微生物的總DNA，且產(chǎn)物產(chǎn)量大、純度高，能夠滿足包括PCR在內(nèi)的各類后續(xù)操作要求。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。具體實施方式以下對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。第一方面，本發(fā)明提供了一種提取土壤微生物總DNA的方法，該方法包括土壤微生物細(xì)胞破碎處理、DNA純化處理和DNA溶解處理，其中，在土壤微生物細(xì)胞破碎處理之前對土壤進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理包括用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤和用異丙醇洗滌土壤。本發(fā)明方法中，對于預(yù)處理中用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤和用異丙醇洗滌土壤的順序沒有特別的要求，可以為先用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤，然后再用 異丙醇洗滌土壤，也可以為先用異丙醇洗滌土壤，然后再用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤。為了進(jìn)一步提高提取得到的DNA的產(chǎn)量和純度，優(yōu)選情況下，預(yù)處理中先用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤，然后再用異丙醇洗滌土壤。本發(fā)明方法中，在用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤時，對于偏磷酸鈉溶液的濃度和pH沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種濃度和pH，優(yōu)選情況下，偏磷酸鈉溶液的濃度為15-25g/L，pH為8-9。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，本發(fā)明方法中所用的偏磷酸鈉溶液中溶質(zhì)僅為偏磷酸鈉，不包括其他成分，如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。本發(fā)明方法中，在用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤時，對于偏磷酸鈉溶液的用量沒有特別的限定，只要能夠利用偏磷酸鈉溶液對土壤進(jìn)行洗滌即可，優(yōu)選情況下，相對于每克土壤，偏磷酸鈉溶液的用量為2-6mL。本發(fā)明方法中，在用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤時，為了進(jìn)一步提高提取得到的DNA的產(chǎn)量和純度，優(yōu)選情況下，用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤的次數(shù)為2-4。本發(fā)明方法中，在用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤時，優(yōu)選情況下，用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤的方式包括：在土壤中加入偏磷酸鈉溶液，攪拌均勻后離心取沉淀。對于離心的條件沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種離心條件，例如可以為在10000-13000rpm下室溫離心8-12min。本發(fā)明方法中，在用異丙醇洗滌土壤時，對于異丙醇的用量沒有特別的限定，只要能夠利用異丙醇對土壤進(jìn)行洗滌即可，優(yōu)選情況下，相對于每克土壤，異丙醇的用量為1-3mL。本發(fā)明方法中，為了進(jìn)一步提高提取得到的DNA的產(chǎn)量和純度，優(yōu)選情況下，用異丙醇洗滌土壤的次數(shù)為2-4。本發(fā)明方法中，優(yōu)選情況下，用異丙醇洗滌土壤的方式包括：在土壤或沉淀(例如經(jīng)偏磷酸鈉溶液洗滌土壤后得到的沉淀)中加入異丙醇，攪拌均 勻后離心取沉淀。對于離心的條件沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種離心條件，例如可以為在10000-13000rpm下室溫離心8-12min。本發(fā)明方法中，為了進(jìn)一步提高提取得到的DNA的產(chǎn)量和純度，優(yōu)選情況下，所述預(yù)處理還包括用Crombach緩沖液洗滌土壤。本發(fā)明方法中，對于預(yù)處理中用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤、用Crombach緩沖液洗滌土壤和用異丙醇洗滌土壤的順序沒有特別的要求，可以以任何順序洗滌土壤。為了進(jìn)一步提高提取得到的DNA的產(chǎn)量和純度，優(yōu)選情況下，預(yù)處理包括依次用偏磷酸鈉溶液、Crombach緩沖液和異丙醇洗滌土壤。本發(fā)明方法中，在用Crombach緩沖液洗滌土壤時，對于Crombach緩沖液的pH、組分及濃度沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種pH、組分和濃度，優(yōu)選情況下，Crombach緩沖液包括Tris-HCl和EDTA-Na2，Tris-HCl的濃度為0.03-0.04mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.0005-0.0015mol/L，Crombach緩沖液的pH為7.5-8.5。本發(fā)明方法中，在用Crombach緩沖液洗滌土壤時，對于Crombach緩沖液的用量沒有特別的限定，只要能夠利用Crombach緩沖液對土壤進(jìn)行洗滌即可，優(yōu)選情況下，優(yōu)選地，相對于每克土壤，Crombach緩沖液的用量為2-6mL。本發(fā)明方法中，在用Crombach緩沖液洗滌土壤時，為了進(jìn)一步提高提取得到的DNA的產(chǎn)量和純度，優(yōu)選情況下，用Crombach緩沖液洗滌土壤的次數(shù)為2-4。本發(fā)明方法中，在用Crombach緩沖液洗滌土壤時，優(yōu)選情況下，用Crombach緩沖液洗滌土壤的方式包括：在土壤或沉淀中加入Crombach緩沖液，攪拌均勻后離心取沉淀。對于離心的條件沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種離心條件，例如可以為在10000-13000rpm下室溫離心8-12min。本發(fā)明方法中，對于土壤微生物細(xì)胞破碎處理的方法沒有特別的限定， 可以為本領(lǐng)域常用的各種土壤微生物細(xì)胞破碎處理方法，優(yōu)選情況下，土壤微生物細(xì)胞破碎處理包括：在預(yù)處理得到的樣品中依次加入DNA提取緩沖液、溶菌酶和蛋白酶K進(jìn)行處理。本發(fā)明方法中，對于DNA提取緩沖液的組分及其用量、溶菌酶的用量和蛋白酶K的用量沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種組分和用量，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。本發(fā)明方法中，對于用DNA提取緩沖液、溶菌酶和蛋白酶K進(jìn)行處理的方法沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種方法，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。本發(fā)明方法中，對于DNA純化處理的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種DNA純化處理的方法，優(yōu)選情況下，DNA純化處理包括：在蛋白酶K處理之后，離心取上清液，并依次用氯仿-異戊醇溶液、苯酚-氯仿-異戊醇溶液、異丙醇和乙醇進(jìn)行純化。本發(fā)明方法中，對于用氯仿-異戊醇溶液、苯酚-氯仿-異戊醇溶液、異丙醇和乙醇進(jìn)行純化的方法沒有特別的限定，可以分別為本領(lǐng)域常用的各種方法，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。本發(fā)明方法中，對于DNA溶解處理的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種DNA溶解處理的方法，優(yōu)選情況下，將DNA純化處理得到的DNA沉淀用TE或雙蒸水溶解。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在DNA溶解處理后，根據(jù)實際需要，可先將溶解的DNA置于-20℃保存。第二方面，本發(fā)明提供了上述方法在土壤微生態(tài)分析中的應(yīng)用。實施例以下將通過實施例和對比例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。如無特別說明，使用的各材料均可市售獲得，采用的各種方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。紫外熒光分光光度計購自SHIMADZU公司，型號為UV2450。土壤取自清華大學(xué)校園，采集土壤為黃黏土，采樣深度為5-10cm表土層，按5點法取樣，混勻后放入無菌袋中，4℃保存，24h內(nèi)完成土壤微生物總DNA的提取。土壤微生物總DNA提取試劑盒為PowerDNAIsolationKit，購自MOBIO公司，貨號為Catalog#12888-50。實施例1本實施例用于說明本發(fā)明的提取土壤微生物總DNA的方法。(1)取1g土壤樣品并加入到10mL室溫離心管中；(2)向離心管中加入4mL偏磷酸鈉溶液，攪拌均勻，然后在10000rpm下室溫離心10min，取沉淀，其中，偏磷酸鈉溶液的濃度為20g/L，pH為8.5；重復(fù)操作3次；(3)向步驟(2)得到的沉淀中加入3.5mLCrombach緩沖液，攪拌均勻，然后在10000rpm下室溫離心10min，取沉淀，其中，Crombach緩沖液包括Tris-HCl和EDTA-Na2，Tris-HCl的濃度為0.033mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.001mol/L，Crombach緩沖液的pH為8.0；重復(fù)操作3次；(4)向步驟(3)得到的沉淀中加入1.5mL異丙醇，攪拌均勻，靜置10min，然后在12000rpm下室溫離心10min，取沉淀；重復(fù)操作3次；(5)向步驟(4)得到的沉淀中加入2mLDNA提取緩沖液和0.5g玻璃珠，攪拌均勻，其中，DNA提取緩沖液包括Tris-HCl、EDTA-Na2、磷酸鈉、NaCl和CTAB，Tris-HCl的濃度為0.1mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.1mol/L，磷酸鈉的濃度為0.1mol/L，NaCl的濃度為1.5mol/L，CTAB的濃度為1質(zhì)量％，DNA提取緩沖液的pH為8.0；(6)加入40μL50g/L的溶菌酶溶液，在37℃、200rpm的搖床中振蕩 1h；(7)加入20μL蛋白酶K溶液，55℃水浴1h，其中，蛋白酶K溶液包括蛋白酶K、Tris-HCl和乙酸鈣，蛋白酶K的濃度為10g/L，Tris-HCl的濃度為0.05mol/L，乙酸鈣的濃度為1.5mol/L，蛋白酶K溶液的pH為8.0；(8)在10000rpm下室溫離心10min，取上清液并加入到5mL室溫離心管中；(9)加入2.5mL氯仿-異戊醇溶液，混合均勻，振蕩器振蕩5min，靜置分層，其中，氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為24:1；(10)小心吸取水相并加入到新的5mL室溫離心管中，加入2.5mL的苯酚-氯仿-異戊醇溶液，振蕩器振蕩5min，靜置分層，其中，苯酚-氯仿-異戊醇溶液中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為24:24:1；(11)小心吸取水相并加入到新的15mL室溫離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，置于4℃冰箱1h，等待白色絮狀沉淀出現(xiàn)；(12)在10000rpm下室溫離心20min，棄上清液，取沉淀；(13)加入2mL體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液，重懸，在10000rpm下室溫離心20min，棄上清液，取沉淀；(14)重復(fù)上步，靜置，使乙醇完全揮發(fā)；(15)加入150μLTE緩沖溶液溶解沉淀并轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL室溫離心管中，-20℃保存，其中，TE緩沖溶液中Tris-HCl的濃度為0.01mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.001M，TE緩沖溶液的pH為8.0。按照步驟(1)-(15)提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例2本實施例用于說明本發(fā)明的提取土壤微生物總DNA的方法。(1)取1g土壤樣品并加入到10mL室溫離心管中；(2)向離心管中加入2mL偏磷酸鈉溶液，攪拌均勻，然后在12000rpm下室溫離心8min，取沉淀，其中，偏磷酸鈉溶液的濃度為25g/L，pH為8；重復(fù)操作4次；(3)向步驟(2)得到的沉淀中加入6mLCrombach緩沖液，攪拌均勻，然后在10000rpm下室溫離心10min，取沉淀，其中，Crombach緩沖液包括Tris-HCl和EDTA-Na2，Tris-HCl的濃度為0.03mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.0005mol/L，Crombach緩沖液的pH為7.5；重復(fù)操作2次；(4)向步驟(3)得到的沉淀中加入3mL異丙醇，攪拌均勻，靜置10min，然后在12000rpm下室溫離心10min，取沉淀；重復(fù)操作2次；(5)向步驟(4)得到的沉淀中加入2mLDNA提取緩沖液和0.5g玻璃珠，攪拌均勻，其中，DNA提取緩沖液包括Tris-HCl、EDTA-Na2、磷酸鈉、NaCl和CTAB，Tris-HCl的濃度為0.1mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.1mol/L，磷酸鈉的濃度為0.1mol/L，NaCl的濃度為1.5mol/L，CTAB的濃度為1質(zhì)量％，DNA提取緩沖液的pH為8.0；(6)加入40μL50g/L的溶菌酶溶液，在37℃、200rpm的搖床中振蕩1h；(7)加入20μL蛋白酶K溶液，55℃水浴1h，其中，蛋白酶K溶液包括蛋白酶K、Tris-HCl和乙酸鈣，蛋白酶K的濃度為10g/L，Tris-HCl的濃度為0.05mol/L，乙酸鈣的濃度為1.5mol/L，蛋白酶K溶液的pH為8.0；(8)在10000rpm下室溫離心10min，取上清液并加入到5mL室溫離心管中；(9)加入2.5mL氯仿-異戊醇溶液，混合均勻，振蕩器振蕩5min，靜置分層，其中，氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為24:1；(10)小心吸取水相并加入到新的5mL室溫離心管中，加入2.5mL的苯酚-氯仿-異戊醇溶液，振蕩器振蕩5min，靜置分層，其中，苯酚-氯仿-異戊醇溶液中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為24:24:1；(11)小心吸取水相并加入到新的15mL室溫離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，置于4℃冰箱1h，等待白色絮狀沉淀出現(xiàn)；(12)在10000rpm下室溫離心20min，棄上清液，取沉淀；(13)加入2mL體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液，重懸，在10000rpm下室溫離心20min，棄上清液，取沉淀；(14)重復(fù)上步，靜置，使乙醇完全揮發(fā)；(15)加入150μLTE緩沖溶液溶解沉淀并轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL室溫離心管中，-20℃保存，其中，TE緩沖溶液中Tris-HCl的濃度為0.01mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.001M，TE緩沖溶液的pH為8.0。按照步驟(1)-(15)提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例3本實施例用于說明本發(fā)明的提取土壤微生物總DNA的方法。(1)取1g土壤樣品并加入到10mL室溫離心管中；(2)向離心管中加入6mL偏磷酸鈉溶液，攪拌均勻，然后在10000rpm下室溫離心10min，取沉淀，其中，偏磷酸鈉溶液的濃度為15g/L，pH為9；重復(fù)操作2次；(3)向步驟(2)得到的沉淀中加入2mLCrombach緩沖液，攪拌均勻，然后在10000rpm下室溫離心10min，取沉淀，其中，Crombach緩沖液包括Tris-HCl和EDTA-Na2，Tris-HCl的濃度為0.04mol/L，EDTA-Na2的濃度為 0.0015mol/L，Crombach緩沖液的pH為8.5；重復(fù)操作4次；(4)向步驟(3)得到的沉淀中加入1mL異丙醇，攪拌均勻，靜置10min，然后在12000rpm下室溫離心10min，取沉淀；重復(fù)操作4次；(5)向步驟(4)得到的沉淀中加入2mLDNA提取緩沖液和0.5g玻璃珠，攪拌均勻，其中，DNA提取緩沖液包括Tris-HCl、EDTA-Na2、磷酸鈉、NaCl和CTAB，Tris-HCl的濃度為0.1mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.1mol/L，磷酸鈉的濃度為0.1mol/L，NaCl的濃度為1.5mol/L，CTAB的濃度為1質(zhì)量％，DNA提取緩沖液的pH為8.0；(6)加入40μL50g/L的溶菌酶溶液，在37℃、200rpm的搖床中振蕩1h；(7)加入20μL蛋白酶K溶液，55℃水浴1h，其中，蛋白酶K溶液包括蛋白酶K、Tris-HCl和乙酸鈣，蛋白酶K的濃度為10g/L，Tris-HCl的濃度為0.05mol/L，乙酸鈣的濃度為1.5mol/L，蛋白酶K溶液的pH為8.0；(8)在10000rpm下室溫離心10min，取上清液并加入到5mL室溫離心管中；(9)加入2.5mL氯仿-異戊醇溶液，混合均勻，振蕩器振蕩5min，靜置分層，其中，氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為24:1；(10)小心吸取水相并加入到新的5mL室溫離心管中，加入2.5mL的苯酚-氯仿-異戊醇溶液，振蕩器振蕩5min，靜置分層，其中，苯酚-氯仿-異戊醇溶液中苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為24:24:1；(11)小心吸取水相并加入到新的15mL室溫離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，置于4℃冰箱1h，等待白色絮狀沉淀出現(xiàn)；(12)在10000rpm下室溫離心20min，棄上清液，取沉淀；(13)加入2mL體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液，重懸，在10000rpm下室溫離心20min，棄上清液，取沉淀；(14)重復(fù)上步，靜置，使乙醇完全揮發(fā)；(15)加入150μLTE緩沖溶液溶解沉淀并轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL室溫離心管中，-20℃保存，其中，TE緩沖溶液中Tris-HCl的濃度為0.01mol/L，EDTA-Na2的濃度為0.001M，TE緩沖溶液的pH為8.0。按照步驟(1)-(15)提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例4按照實施例1的方法，不同的是，不進(jìn)行步驟(3)。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例5按照實施例1的方法，不同的是，步驟(2)中只進(jìn)行1次操作。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例6按照實施例1的方法，不同的是，步驟(3)中只進(jìn)行1次操作。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例7按照實施例1的方法，不同的是，步驟(4)中只進(jìn)行1次操作。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。實施例8按照實施例1的方法，不同的是，先用Crombach緩沖液洗滌土壤，再用異丙醇洗滌土壤，最后用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤，即先進(jìn)行實施例1中的步驟(3)，再進(jìn)行步驟(4)，最后進(jìn)行步驟(2)。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。對比例1采用SDS-CTAB裂解法提取與實施例1相同土壤樣品中土壤微生物的總DNA，具體方法包括：稱取5g土壤樣品于研缽中，用20.0mL磷酸鹽提取緩沖液(0.25mol/LNaH2PO4，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.1mol/LEDTA(pH8.0)，1％CTAB(w/v)；高壓滅菌，使用前加入1％β-巰基乙醇(v/v))研磨后置于50mL無菌離心管中，加入4.0mL20％SDS(w/v)，渦旋2min，然后68℃水浴2h，并且每15min上下顛倒混勻數(shù)次。之后，13000rpm離心15min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一新管，加入500μL5mol/LKAc溶液和1.67mLPEG8000，在－20℃下放置15min，13000rpm離心15min，棄上清，用500μL2×CTAB重懸沉淀，68℃水浴1h，加入等體積氯仿/異戊醇(氯仿與異戊醇體積比為24：1)，振蕩混勻，靜置5min，在4℃、13000rpm下離心15min； 將上清液轉(zhuǎn)移至另一新管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫下放置15min，13000rpm離心15min，用70％酒精(v/v)洗滌2次，風(fēng)干，溶于50μLTE緩沖溶液(0.01mol/LTris-HCl，0.001MEDTA-Na2，pH為8.0)中，4℃下保存?zhèn)溆?。采用SDS-CTAB裂解法提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。對比例2采用土壤微生物總DNA提取試劑盒按照其說明書的操作步驟提取與實施例1相同土壤樣品中土壤微生物的總DNA。采用土壤微生物總DNA提取試劑盒提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。對比例3按照實施例1的方法，不同的是，步驟(2)中用含有PVP-K30的偏磷酸鈉溶液(即該偏磷酸鈉溶液含有偏磷酸鈉和PVP-K30，偏磷酸鈉的濃度為20g/L，PVP-K30的濃度為10g/L，該偏磷酸鈉溶液的pH為8.5)來代替實施例1中的偏磷酸鈉溶液，且不進(jìn)行步驟(3)和步驟(4)。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。對比例4按照實施例1的方法，不同的是，不進(jìn)行步驟(4)。按照上述步驟提取三份土壤樣品中微生物總DNA，使用紫外熒光分光光度計分別測定三份樣品的提取量及表征純度的A260/A280及A260/A230，求取平均值。結(jié)果如表1所示。表1提取量(μg/g)A260/A280A260/A230實施例178.61.681.75實施例277.41.651.70實施例377.91.661.72實施例469.41.451.56實施例576.21.511.51實施例676.61.561.68實施例776.91.601.65實施例877.01.641.70對比例16.41.621.46對比例24.41.690.44對比例362.41.411.40對比例460.21.401.33將表1中實施例與對比例的數(shù)據(jù)比較可知，本發(fā)明的提取土壤微生物總DNA的方法，能夠有效提取土壤微生物的總DNA，且能夠顯著提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。將表1中實施例1與實施例4的數(shù)據(jù)比較可知，在對土壤進(jìn)行預(yù)處理時，除了用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤和用異丙醇洗滌土壤外，同時用Crombach緩沖液洗滌土壤，能夠進(jìn)一步提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。將表1中實施例1與實施例5的數(shù)據(jù)比較可知，用偏磷酸鈉溶液洗滌土壤的次數(shù)為2-4時，能夠進(jìn)一步提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。將表1中實施例1與實施例6的數(shù)據(jù)比較可知，用Crombach緩沖液洗滌土壤的次數(shù)為2-4時，能夠進(jìn)一步提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。將表1中實施例1與實施例7的數(shù)據(jù)比較可知，用異丙醇洗滌土壤的次數(shù)為2-4時，能夠進(jìn)一步提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。將表1中實施例1與實施例8的數(shù)據(jù)比較可知，按照依次用偏磷酸鈉溶液、Crombach緩沖液和異丙醇洗滌土壤的方式對土壤進(jìn)行預(yù)處理時，能夠進(jìn)一步提高得到的DNA的產(chǎn)量和純度。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3