一種掃頻超聲處理對數(shù)中期熱帶假絲酵母促進增殖的方法與流程

文檔序號：12108728閱讀：620來源：國知局

本發(fā)明涉及生物工程領域，具體涉及工業(yè)發(fā)酵的微生物種子液培養(yǎng)技術，特指以低強度脈沖掃頻超聲波輻射處理對數(shù)生長中期的熱帶假絲酵母、從而大幅度提高生長細胞數(shù)量的技術方法。

背景技術：
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熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）可高效利用農副產品廢棄物中各種糖類物質，轉化為蛋白質或者多肽類物質，因此被廣泛應用于發(fā)酵飼料、發(fā)酵食品等固態(tài)發(fā)酵生產中。近年來，傳統(tǒng)的微生物固態(tài)發(fā)酵技術引起人們普遍關注，這種方法成本低、節(jié)水、節(jié)能、排放少，符合當前食品產業(yè)綠色、節(jié)能、高效的發(fā)展方向。但是在發(fā)酵工業(yè)生產過程中普遍存在種子液接種量大，導致生產成本高的問題。通常情況下液態(tài)發(fā)酵需要接種發(fā)酵醪體積2%~ 5%的種子液，固態(tài)發(fā)酵接種量更高，一般為發(fā)酵基質質量的5%~10%、甚至15%以上，可見種子液成本在發(fā)酵總成本中居高不下。

目前國內外主要是通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件以降低成本，工藝條件的優(yōu)化只能在有限的范圍內使產量提高，因而這些方法并未從根本上解決熱帶假絲酵母種子液接種量大的問題，不能大幅度減少接種量的投入從而降低成本。近年來，人們發(fā)現(xiàn)外界超聲場加載于微生物培養(yǎng)液時可刺激微生物菌種生長，因此通過篩選超聲作用條件可提高菌種生長數(shù)量，從而可節(jié)約接種成本。但是由于同一種微生物在生長繁殖過程中其結構也會存在微小的差異，因此使用固定頻率超聲波難以對所有微生物細胞進行有效刺激。掃頻模式超聲波輻射時可圍繞中心頻率在一定頻率范圍內進行周期性掃頻變化，可對細胞具有微小差異進行共振，從而獲得更好的處理效果。

由此可見，通過采用適度掃頻超聲輔助輻射處理促進微生物菌種培養(yǎng)，有望顯著降低固態(tài)發(fā)酵菌種的成本、提高生產效率，將具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種利用低強度脈沖掃頻超聲波處理對數(shù)生長中期熱帶假絲酵母促進其增殖的方法，該方法可提高培養(yǎng)液菌種密度，降低發(fā)酵菌種生產成本、提高發(fā)酵效率。

本發(fā)明的技術方案：一種掃頻超聲處理對數(shù)中期熱帶假絲酵母促進增殖的方法，按照下述步驟進行：以熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）為出發(fā)菌種，（1）配制基礎培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和平板計數(shù)培養(yǎng)基；（2）將熱帶假絲酵母接種于基礎培養(yǎng)基進行菌種活化，測定其生長曲線；（3）將活化后熱帶假絲酵母菌液接種于種子培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，將擴大培養(yǎng)液在一定條件下進行適度的脈沖掃頻超聲波處理，再將處理后的擴大培養(yǎng)液在適宜條件下繼續(xù)培養(yǎng)得到熱帶假絲酵母菌種培養(yǎng)液產品。

所述基礎培養(yǎng)基的成分及配制方法為：麥芽汁培養(yǎng)基。稱取市售麥芽汁培養(yǎng)基130.1 g，加入1 L蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，115℃高壓滅菌15 min，備用。

所述種子培養(yǎng)基的成分及配制方法為：酵母膏胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖）。溶解10 g酵母提取物，20 g胰蛋白胨于900 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌20 min。溶解20 g葡萄糖于100 mL蒸餾水中，115℃高壓滅菌15 min后加入，備用。

所述平板計數(shù)培養(yǎng)基的成分及配制方法為：孟加拉紅培養(yǎng)基。稱取市售孟加拉紅培養(yǎng)基31.6 g，加入1 L蒸餾水，121℃高壓滅菌20 min，備用。

所述熱帶假絲酵母活化步驟及條件為：將購買的熱帶假絲酵母凍干菌種按照中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）對該菌種活化要求進行打管復活，于麥芽汁培養(yǎng)基在28℃的生化培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2天并轉接3代。

所述熱帶假絲酵母生長曲線的測定方法為：取2環(huán)菌體至100 mL YPD培養(yǎng)基，在搖床中培養(yǎng)24 h。將上述培養(yǎng)好的菌液按照10%的比例接入另外16瓶裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，并標號1-16，28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，前4 h每隔1 h取出一瓶培養(yǎng)液，之后每隔2 h取出一瓶培養(yǎng)液，并取出1 mL菌液，加入9 mL蒸餾水進行稀釋，以YPD培養(yǎng)基為空白，620 nm下比濁。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線。

所述熱帶假絲酵母擴大培養(yǎng)步驟及條件為：挑取1環(huán)活化培養(yǎng)后的菌體接入100 mL滅過菌的裝有YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，放在搖床中進行擴大培養(yǎng)，溫度為28℃，轉速160 r/min。

所述熱帶假絲酵母擴大培養(yǎng)過程脈沖掃頻超聲波處理方法及條件為：根據(jù)生長曲線的測定結果，在擴大培養(yǎng)液中的熱帶假絲酵母生長的對數(shù)中期（約培養(yǎng)10~12h）進行超聲波處理，超聲處理條件為采用頻率為15~100 kHz超聲波處理，掃頻范圍±0.5~±2kHz，超聲波功率密度20~150 W/L培養(yǎng)液，處理溫度20~40℃，處理時間為0.5~2.5h，超聲波脈沖發(fā)聲條件為連續(xù)超聲100~300 s、間歇5~20s。

所述超聲處理后的擴大培養(yǎng)液的繼續(xù)培養(yǎng)方法及條件為：將脈沖掃頻超聲處理和未處理的樣品瓶均放入28℃搖床培養(yǎng)至24 h，對其菌體生物量進行計數(shù)。

通過對比試驗（種子液培養(yǎng)不施加超聲，其他條件相同），經(jīng)檢測，本發(fā)明采用脈沖掃頻超聲的熱帶假絲酵母菌，在同等條件下與無超聲處理相比，種子液中活菌數(shù)提高45.7~148.5%，顯著提高了種子液的菌種數(shù)量。

利用本發(fā)明所得到的熱帶假絲酵母超聲波促進增殖技術可用于各類發(fā)酵生產的種子液培養(yǎng)。

與熱帶假絲酵母傳統(tǒng)種子液發(fā)酵工藝相比，本發(fā)明如下特點和有益效果：

1、本發(fā)明采用脈沖掃頻超聲波技術，可促進增殖大幅提高活菌量；

2、利用該技術進行發(fā)酵生產，可顯著降低成本，有著巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明使用的脈沖掃頻超聲處理裝置的示意圖。其中1.加熱管 2.控制面板 3. 超聲波換能器 4.樣品 5.水 6.電腦 7.超聲波發(fā)生器。

圖2是本發(fā)明中采用脈沖掃頻超聲處理不同生長時期對菌體生物量增加量的影響。其中在熱帶假絲酵母對數(shù)生長中期處理的增殖效果最好。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。

本發(fā)明使用脈沖掃頻超聲處理裝置是由反應池（圖1左）和控制系統(tǒng)（圖1右）組成。本發(fā)明使用脈沖多頻掃描超聲設備將電腦、控制器、超聲波發(fā)生器相連接，接通電源后，在電腦控制系統(tǒng)界面上設置好超聲波頻率、掃頻范圍、脈沖工作/間歇周期、超聲作用時間、功率等參數(shù)，執(zhí)行下達命令后指定超聲波發(fā)生器開始工作，將電流轉換成與超聲波換能器相匹配的高頻交流電信號，從而驅使反應池中超聲板產生振動，并以超音頻縱波的形式在反應池液體中輻射。

實施例1

將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）購買的熱帶假絲酵母（Candida tropicalis，CICC編號：1254）凍干菌種按照CICC要求進行打管復活，于麥芽汁培養(yǎng)基在28℃的生化培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2天并轉接3代。測定活化的熱帶假絲酵母的生長曲線，生長曲線的測定方法為：取2環(huán)菌體至100 mL YPD培養(yǎng)基，在搖床中培養(yǎng)24 h。將上述培養(yǎng)好的菌液按照10%的比例接入另外16瓶裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，并標號1-16，28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，前4 h每隔1 h取出一瓶培養(yǎng)液，之后每隔2 h取出一瓶培養(yǎng)液，并取出1 mL菌液，加入9 mL蒸餾水進行稀釋，以YPD培養(yǎng)基為空白，620 nm下比濁。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線。