本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化乳酸菌制備春黃菊提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對天然動植物的提取、化學合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟、高效的途徑，開發(fā)一些傳統(tǒng)方法無法生產(chǎn)的新型煙用香原料。
微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點。因此，近年來，微生物固定化技術(shù)的研究非?；钴S，發(fā)展較快，已應用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護，新能源開發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護中用于環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)廢水的處理；在新能源開發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡單化、安全自動化、無污染等方向發(fā)展，在能源危機、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴重的情況下，由此將推動其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應用，具有更加深遠的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用春黃菊提取物卻未見報道。
春黃菊(學名：Anthemis tinctoria L.)，又名洋甘菊，為菊科春黃菊屬多年生草本植物，原產(chǎn)于歐亞大陸。春黃菊也是一種常用的煙用添加劑，以春黃菊為原料的春黃菊浸膏、春黃菊提取物在卷煙中應用廣泛，具有提升卷煙香氣質(zhì)量、柔和細膩煙氣、增加煙氣甜潤感和改善余味的作用。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。該菌在發(fā)酵過程中不僅能產(chǎn)生減少卷煙刺激性的和柔和細膩煙氣作用的乳酸，還能產(chǎn)生賦予卷煙特有風格的風味物質(zhì)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種煙用春黃菊糖提取物的制備方法，采用固定化乳酸菌發(fā)酵技術(shù)，開發(fā)了一種新型的春黃菊提取物，該提取物可以在卷煙中使用，能夠豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣，改善余味。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案：所述一種春黃菊提取物的制備方法，包括以下步驟：
(1)取春黃菊花，加入其重量5～10倍的水，在95～100℃下回流提取2～3次，每次提取時間為2～4小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到春黃菊提取物A；
(2)乳酸菌菌懸液配制：將乳酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)乳酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2～5％的步驟(2)中制備的乳酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到CaCl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1～3h得PVA-SA固定化乳酸菌小球，然后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1～3％CaCl2的硼酸飽和溶液的量并無特殊要求，只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足乳酸菌的固定化要求即可；
(4)將春黃菊提取物A與步驟(3)中制備的PVA-SA固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比5～10:1混合，在溫度為25～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5～10rpm的條件下發(fā)酵3～5d；
(5)將步驟(3)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時，過濾取上清液在0.1MPa，45℃下濃縮至相對密度為1.15～1.20，得春黃菊提取物。
本發(fā)明中采用的乳酸菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)PJH05，于2012年1月5日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC NO：M2012002。
本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強等優(yōu)點，能夠彌補傳統(tǒng)生物工藝的不足。
本發(fā)明以春黃菊為原料，利用固定化乳酸菌發(fā)酵春黃菊提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用春黃菊提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣，改善余味等作用，還能賦予卷煙特色的酸香風格。與現(xiàn)有春黃菊浸膏和春黃菊提取物相比，該春黃菊提取物在卷煙中降低激性和柔和細膩煙氣的效果較明顯，同時還賦予卷煙特色的酸香風格；與懸浮乳酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的春黃菊提取物有機酸含量增加了5.15％～15.24％，卷煙效果評價中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。該方法替代了春黃菊提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對煙用春黃菊提取物的制備提供了一條新途徑。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步詳細的描述。
本發(fā)明中采用的乳酸菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)PJH05，于2012年1月5日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC NO：M2012002。
本發(fā)明以下實施例中的PVA-SA固定化乳酸菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉(SA)對乳酸菌進行固定化得到的：
(1)乳酸菌菌懸液配制：將乳酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中肉湯培養(yǎng)基為常用的普通肉湯培養(yǎng)基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終pH7.3±0.1；
(2)乳酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2～5％的步驟(2)中制備的乳酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到CaCl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1～3h得PVA-SA固定化乳酸菌小球，然后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1～3％CaCl2的硼酸飽和溶液的量并無特殊要求，只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足乳酸菌的固定化要求即可；硼酸飽和溶液為飽和水溶液。
實施例1，一種煙用春黃菊提取物的制備方法，包括以下步驟：
(1)向春黃菊花中按重量加入5倍的水，在100℃下回流提取2次，每次提取時間為3小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并兩次提取液，得到春黃菊提取物A，兩次提取的條件完全相同；
(2)將春黃菊提取物A與上述方法制備的PVA-SA固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵4d；
(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量3倍的95％酒精溶液，沉淀24小時，過濾取上清液在壓力為0.1MPa，溫度為45℃下濃縮至相對密度為1.15，得春黃菊提取物。
實施例1中制備的春黃菊提取物添加到卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙透發(fā)性，掩蓋雜氣，柔和細膩煙氣，降低刺激性，口腔余味變得舒適，賦予卷煙特色酸香風格。
實施例2，一種煙用春黃菊提取物的制備方法，包括以下步驟：
(1)取春黃菊花，加入其重量8倍的水，在98℃下回流提取3次，每次提取時間為2小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到春黃菊提取物A；三次提取的條件完全相同；
(2)將春黃菊提取物A與制備的固定上述方法中制備的PVA-SA固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比8:1混合，在溫度為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為8rpm的條件下發(fā)酵3d；
(3)將步驟(3)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量4倍的80％酒精溶液，沉淀48小時，過濾取上清液在0.1MPa，45℃下濃縮至相對密度為1.20，得春黃菊提取物。
實施例2中制備的春黃菊提取物添加到卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙透發(fā)性，掩蓋雜氣，柔和細膩煙氣，降低刺激性，口腔余味變得舒適，賦予卷煙特色酸香風格。
實施例3，一種煙用春黃菊提取物的制備方法，包括以下步驟：
(1)取春黃菊花，加入其重量5倍的水，在95℃下回流提取3次，每次提取時間為4小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到春黃菊提取物A；三次提取條件完全相同；
(2)將春黃菊提取物A與上述方法制備的PVA-SA固定化乳酸菌小球按照質(zhì)量比10:1混合，在溫度為25℃，攪拌轉(zhuǎn)速為10rpm的條件下發(fā)酵5d；
(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的95％酒精溶液，沉淀48小時，過濾取上清液在0.1MPa，45℃下濃縮至相對密度為1.15，得春黃菊提取物。
實施例3中制備的春黃菊提取物添加到卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙透發(fā)性，掩蓋雜氣，柔和細膩煙氣，降低刺激性，
口腔余味變得舒適，賦予卷煙特色酸香風格。
對比實驗，申請人將本發(fā)明制備的春黃菊提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的春黃菊提取物、采用懸浮乳酸菌發(fā)酵制備的春黃菊提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進行評吸，其評吸效果如下：
三種不同工藝制備的春黃菊提取在卷煙中的感官評價效果比較
從上述對比實驗可以看出來，本發(fā)明中制備的春黃菊提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實驗分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮乳酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的春黃菊提取物有機酸含量增加了5.15％～15.24％，卷煙效果評價中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。