本發(fā)明涉及一株魚腥藻來源的苯丙氨酸脫氨酶的突變體，屬于蛋白質(zhì)工程。

背景技術(shù)：

苯丙氨酸脫氨酶(PAL)可用于有效并長期式地治療苯丙酮尿癥(PKU)。因為其的方便有效，用該酶的口服方式越來越受關(guān)注。但是，由于腸道里的極端環(huán)境，使得該酶的應(yīng)用受到一定的限制。一株魚腥藻Anabaena variabilis來源的PAL(Av-PAL)的突變體可以提高該酶在這方面的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種耐酸性能與耐熱性能都有改善的苯丙氨酸脫氨酶突變體，由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列編碼。

本發(fā)明還提供一種重組表達所述苯丙氨酸脫氨酶突變體的方法，是以大腸桿菌BL21為宿主，以pET28a為表達載體，將重組菌種子液接種于含卡那霉素的2YT表達培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀至0.8-1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0.1mM，20℃誘導(dǎo)16-18h苯丙氨酸脫氨酶突變體的表達；2YT表達培養(yǎng)基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)

在本發(fā)明的一種實施方式中，還包括將重組菌體破碎后，收集上清，上清膜過濾后，用His Trap HF柱分離得到苯丙氨酸脫氨酶突變體。

本發(fā)明提供的苯丙氨酸脫氨酶突變體E75L的最適pH為7.5，相比野生酶的最適pH下降1，同時具備了更好的pH穩(wěn)定性；E75L在70℃下的半衰期由野生酶的130min延長至190min；在極端pH 3.5的USP緩沖液中，游離野生酶在30分鐘內(nèi)幾乎失活，而游離E75L在3h后保留55％的酶活；在0.3mg/mL的胰蛋白酶溶液中，游離野生酶在45min左右失去50％的酶活，游離E75L在3h后保留72％的酶活。因此，本發(fā)明提供的苯丙氨酸脫氨酶突變體E75L將更適應(yīng)口服，能更好的應(yīng)對腸胃的極端環(huán)境。

附圖說明

圖1野生酶(WT)和E75L的pH-酶活曲線。

圖2野生酶(WT)和E75L的pH穩(wěn)定性曲線。

圖3野生酶(WT)和E75L的熱穩(wěn)定性曲線。70℃下保存，適時取樣，測定殘留酶活。

圖4野生酶(WT)和E75L在pH 3.5USP緩沖液中的穩(wěn)定性。

圖5野生酶(WT)和E75L在胰蛋白酶溶液中的穩(wěn)定性。

具體實施方式

酶活的定義：每分鐘每毫克PAL轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的量(μmols)。

酶活測定方法：在相應(yīng)100mM緩沖液(pH 6.0-7.0、100mM KH₂CO₃-K₂HCO₃緩沖液；pH 7.0-9.5、100mM Tris-HCl緩沖液)中，以10mM L-苯丙氨酸為底物，在37℃下反應(yīng)20min，根據(jù)290nm的吸收值測定生成的肉桂酸濃度確定酶活。

最適反應(yīng)pH的確定:分別在不同pH緩沖液中測定野生酶和E75L的酶活，確定最適反應(yīng)pH。

pH穩(wěn)定性的確定：將野生酶和E75L在不同pH緩沖液中保留12h后測定殘留酶活，得到pH穩(wěn)定性曲線。

熱穩(wěn)定性確定：將野生酶和E75L保存于70℃金屬浴中，適時取樣，測定其的殘留酶活。

極端條件穩(wěn)定性測定：將野生酶和E75L保存于pH 3.5的USP(United States Pharmacopeia)緩沖液以及0.3mg/mL的胰蛋白酶溶液中，適時取樣，測定其的殘留酶活。

實施例1

(1)突變體E75L的構(gòu)建：

以pET28a-PAL為模版，以表1所示引物在表2所示條件下，PCR得到攜帶編碼突變體的基因的重組載體pET28a-PAL/E75L。pET28a-PAL的構(gòu)建方法參見Moffitt,M.C.,Louie,G.V.,Bowman,M.E.,Pence,J.,Noel,J.P.and Moore,B.S.(2007)Discovery of two cyanobacterial phenylalanine ammonia lyases:Kinetic and structural characterization.Biochemistry-Us,46,1004-1012.

表1引物

表2全質(zhì)粒PCR擴增反應(yīng)體系

PCR擴增反應(yīng)條件為：

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定。然后將PCR產(chǎn)物純化、消化后轉(zhuǎn)入BL21宿主。

(2)將重組大腸桿菌BL21/pET28a-PAL/E75L接種于4mL卡那霉素濃度為100μg/mL的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。

將上述過夜培養(yǎng)物按1％的接種量接種于含卡那霉素濃度為100μg/mL的100mL 2YT表達培養(yǎng)基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀至0.8-1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0.1mM，20℃誘導(dǎo)16-18h得到菌體，5000g的轉(zhuǎn)速離心收菌。

(3)將重組菌體溶于20mL結(jié)合緩沖溶液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超聲破碎，13000g離心25min，上清用0.22μm濾膜過濾。用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液平衡1mL的His Trap HF柱，用15倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白，分別用8倍柱體積的150、300和500mmol/L咪唑的緩沖液洗脫蛋白，收集樣品并用SDS-PAGE分析鑒定。

(4)最適反應(yīng)pH的測定：在400μl不同pH的緩沖反應(yīng)體系中加入3μg純化后的突變酶E75L，加底物L(fēng)-苯丙氨酸至10mM，在37℃下反應(yīng)20min，確定相應(yīng)酶活。如圖1所示，作出pH-酶活曲線，得到最適pH。野生酶最適pH為8.5，E75L最適pH為7.5。不同pH緩沖溶液分別是：pH 6.0-7.0,100mM KH₂CO₃-K₂HCO₃緩沖液；pH 7.0-9.5、100mM Tris-HCl緩沖液。

(5)pH穩(wěn)定性的確定：將野生酶和E75L在不同pH緩沖溶液中、37℃下保存12h后，在pH 8下測定殘留酶活。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，E75L的穩(wěn)定性較野生酶有所提高。

(6)熱穩(wěn)定性的確定：將野生酶(SEQ ID NO.2)和E75L保存于70℃金屬浴中，適時取樣，測定殘留酶活。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)E75L在70℃下的半衰期由野生酶的130min延伸至190min。

(7)測定野生酶和E75L在極端條件穩(wěn)定性：如圖4、5所示，在pH 3.5的USP緩沖液中，游離野生酶在30分鐘內(nèi)幾乎失活，游離E75L在3h后保留55％的酶活；在0.3mg/mL的胰蛋白酶溶液中，游離野生酶在45min左右失去50％的酶活，游離E75L在3h后保留72％的酶活。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一株魚腥藻來源的苯丙氨酸脫氨酶的突變體

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1704

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagacac tatctcaagc acaaagcaaa acctcatctc aacaattttc ttttactgga 60

aattcttctg ccaatgtaat tattggtaat cagaaactca caatcaatga tgttgcaagg 120

gtagcgcgta atggcacctt agtgtcttta accaataaca ctgatatttt gcagggtatt 180

caggcatctt gtgattacat taataatgct gttgaatctg ggctcccaat ttatggagtg 240

acatctggtt ttggcggtat ggccaatgtt gccatatccc gtgaacaagc atctgaactc 300

caaaccaact tagtttggtt cctgaaaaca ggtgcaggga acaaattacc cttggcggat 360

gtgcgcgcag ctatgctctt gcgtgcaaac tctcatatgc gcggtgcatc tggcatcaga 420

ttagaactta tcaagcgtat ggagattttc cttaacgctg gtgtcacacc atatgtgtat 480

gagtttggtt caattggtgc aagtggtgat ttagtgccac tatcctacat tactggttca 540

ctgataggct tagatcccag ttttaaggtt gacttcaacg gtaaagaaat ggatgcgcca 600

acagctctac gtcaactgaa tttgtcaccc ttgacattgt tgccgaagga aggcttggcg 660

atgatgaacg gcacttcagt catgacaggt attgcagcaa actgcgtcta cgatactcaa 720

attttaactg cgatcgctat gggcgttcac gctctagata tccaagcttt aaacggaacc 780

aatcaatcat tccatccatt tatccataat tccaaaccac atcctggtca attatgggca 840

gcagatcaga tgatttcttt gttagccaat tcccagttag ttcgtgatga gttagatggt 900

aaacacgatt atcgtgatca cgagttgatt caagatcgtt actcactccg atgccttccc 960

cagtatttgg ggccaatcgt tgatggaatt tcccagattg ccaaacaaat tgaaatcgaa 1020

atcaactcag tcaccgataa cccactaatt gatgttgata accaagctag ctatcatgga 1080

ggaaatttcc tcggacagta cgtgggtatg ggaatggatc acctgcgtta ctatattggg 1140

ttattggcta aacacctaga tgtgcagatt gccctcctcg cctcaccaga gtttagcaat 1200

ggactaccac catctttatt aggcaaccga gaacgtaaag tcaatatggg actcaaaggt 1260

ctgcaaatat gcggtaactc aattatgcca ctgttgacct tctatggaaa ttccatcgcc 1320

gatcgctttc ctacccatgc agaacaattt aatcagaaca tcaacagtca aggatacact 1380

tcagcgactc tagcccgccg ttctgtggat atcttccaga attatgtggc gatcgctctg 1440

atgtttggag tccaagctgt tgacctccgc acatataaaa agactggtca ttacgatgca 1500

cgcgcctgtc tatcacctgc aactgagcgc ttatattcag cagtccgcca cgtagttgga 1560

caaaaaccaa cttcagatcg cccatatatt tggaatgata atgagcaagg actggatgag 1620

catattgccc ggatttctgc tgatatcgct gctggtggtg tgattgtgca agcagttcaa 1680

gatatcttac cctgcttgca ttaa 1704

<210> 2

<211> 1704

<212> DNA

<213> 魚腥藻

<400> 2

atgaagacac tatctcaagc acaaagcaaa acctcatctc aacaattttc ttttactgga 60

aattcttctg ccaatgtaat tattggtaat cagaaactca caatcaatga tgttgcaagg 120

gtagcgcgta atggcacctt agtgtcttta accaataaca ctgatatttt gcagggtatt 180

caggcatctt gtgattacat taataatgct gttgaatctg gggaaccaat ttatggagtg 240

acatctggtt ttggcggtat ggccaatgtt gccatatccc gtgaacaagc atctgaactc 300

caaaccaact tagtttggtt cctgaaaaca ggtgcaggga acaaattacc cttggcggat 360

gtgcgcgcag ctatgctctt gcgtgcaaac tctcatatgc gcggtgcatc tggcatcaga 420

ttagaactta tcaagcgtat ggagattttc cttaacgctg gtgtcacacc atatgtgtat 480

gagtttggtt caattggtgc aagtggtgat ttagtgccac tatcctacat tactggttca 540

ctgataggct tagatcccag ttttaaggtt gacttcaacg gtaaagaaat ggatgcgcca 600

acagctctac gtcaactgaa tttgtcaccc ttgacattgt tgccgaagga aggcttggcg 660

atgatgaacg gcacttcagt catgacaggt attgcagcaa actgcgtcta cgatactcaa 720

attttaactg cgatcgctat gggcgttcac gctctagata tccaagcttt aaacggaacc 780

aatcaatcat tccatccatt tatccataat tccaaaccac atcctggtca attatgggca 840

gcagatcaga tgatttcttt gttagccaat tcccagttag ttcgtgatga gttagatggt 900

aaacacgatt atcgtgatca cgagttgatt caagatcgtt actcactccg atgccttccc 960

cagtatttgg ggccaatcgt tgatggaatt tcccagattg ccaaacaaat tgaaatcgaa 1020

atcaactcag tcaccgataa cccactaatt gatgttgata accaagctag ctatcatgga 1080

ggaaatttcc tcggacagta cgtgggtatg ggaatggatc acctgcgtta ctatattggg 1140

ttattggcta aacacctaga tgtgcagatt gccctcctcg cctcaccaga gtttagcaat 1200

ggactaccac catctttatt aggcaaccga gaacgtaaag tcaatatggg actcaaaggt 1260

ctgcaaatat gcggtaactc aattatgcca ctgttgacct tctatggaaa ttccatcgcc 1320

gatcgctttc ctacccatgc agaacaattt aatcagaaca tcaacagtca aggatacact 1380

tcagcgactc tagcccgccg ttctgtggat atcttccaga attatgtggc gatcgctctg 1440

atgtttggag tccaagctgt tgacctccgc acatataaaa agactggtca ttacgatgca 1500

cgcgcctgtc tatcacctgc aactgagcgc ttatattcag cagtccgcca cgtagttgga 1560

caaaaaccaa cttcagatcg cccatatatt tggaatgata atgagcaagg actggatgag 1620

catattgccc ggatttctgc tgatatcgct gctggtggtg tgattgtgca agcagttcaa 1680

gatatcttac cctgcttgca ttaa 1704

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aataatgctg ttgaatctgg gctcccaatt tatgga 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agatgtcact ccataaattg ggagcccaga ttcaac 36