本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種酶的固定化方法，尤其涉及一種雙酶共固定化方法及由該方法制備得到的固定化酶。

背景技術(shù)：

酶制劑作為生物工程研究的碩果之一，在啤酒行業(yè)得到了普及。通過使用酶制劑，可以彌補(bǔ)麥芽中酶活力的不足，改善麥汁成分，提高啤酒發(fā)酵度，縮短發(fā)酵周期，增加產(chǎn)量等。在生產(chǎn)過程中補(bǔ)充外加酶，始終貫穿于啤酒生產(chǎn)的全過程之中，它可使操作簡便，效益提高。如發(fā)酵液中添加脯氨酸內(nèi)切酶，可以增強(qiáng)啤酒的非生物穩(wěn)定性；向發(fā)酵液中添加α-乙酰乳酸脫羧酶，可以方便快捷的降低雙乙酰含量等。

酶制劑一般是以液態(tài)形式加入到糖化或發(fā)酵罐等罐體中，這種外源酶一旦加入就難以分離并再利用，由于酶制劑價(jià)格一般比較高，單次利用對(duì)成本不利。另外，添加到發(fā)酵罐內(nèi)的酶制劑不會(huì)經(jīng)過蒸煮過程變性析出，一般在成品酒經(jīng)巴氏滅菌后仍存在一定的酶活力，在啤酒存放過程中，會(huì)受到殘余酶的作用，使得啤酒口味會(huì)變甜、寡淡。酶制劑的這些限制因素導(dǎo)致了其應(yīng)用受到一定影響。

將酶細(xì)胞固定化是改善上述酶制劑問題有效手段之一。固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，克服了游離酶的上述不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此酶或細(xì)胞的固定化受到研究者日益重視。

隨著科技不斷發(fā)展，人們根據(jù)傳統(tǒng)酶固定化技術(shù)存在的問題，不斷探索改進(jìn)、完善和發(fā)展新的酶固定化方法。過去幾十年里，固定化酶技術(shù)的研究主要集中在單酶固定化。近年來，多酶共固定化由于具有可增加反應(yīng)的局部濃度、提高反應(yīng)收率等優(yōu)點(diǎn)而得到研究者的廣泛關(guān)注。固定化酶與游離酶相比更適于多酶體系的使用，不僅可利用多酶體系中的協(xié)同效應(yīng)使酶催化反應(yīng)速率大大提高，而且還可以控制反應(yīng)按一定順序進(jìn)行，因此將會(huì)在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮巨大的作用。但目前由于固定化多酶成本較高，在工業(yè)上的應(yīng)用還很少，因此如何提供一種多酶的固定化方法，以獲得高催化效率、低成本的固定化多酶，將是本領(lǐng)域所研究的重要課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種雙酶共固定化方法及由該方法制備得到的固定化酶，能夠獲得高催化效率、低成本的固定化多酶。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種雙酶共固定化方法，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脫羧酶和脯氨酸內(nèi)切酶的緩沖溶液中加入氯化鈣溶液，在設(shè)定溫度下充分反應(yīng)，離心分離，洗滌，得到形成具有納米花結(jié)構(gòu)的固定化酶。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述固定化酶的結(jié)構(gòu)為α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶，其中磷酸鈣為載體，每毫克載磷酸鈣可固定化酶的含量為0.92-47.68mg。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為4mmol/L，在所述磷酸鹽緩沖溶液中，α-乙酰乳酸脫羧酶和脯氨酸內(nèi)切酶的總濃度為0.1-4.8mg/ml，優(yōu)選為2.4mg/ml。

作為可選技術(shù)方案，所述氯化鈣溶液的濃度為0.1-0.5mol/L，優(yōu)選為0.1-0.3mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2mol/L。

作為可選技術(shù)方案，所述緩沖溶液與所述氯化鈣溶液的體積比為1:1-200:1，優(yōu)選為30:1-80:1，進(jìn)一步優(yōu)選為50:1。

作為可選技術(shù)方案，所述設(shè)定溫度為0-60℃，優(yōu)選為0-40℃；反應(yīng)時(shí)間為1-24小時(shí)，優(yōu)選為4-18小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為12小時(shí)。

本發(fā)明的另一方面提供了一種如上述任一項(xiàng)技術(shù)方案所述的雙酶共固定化方法制備得到的固定化酶。

本發(fā)明的再一方面提供了一種如上述技術(shù)方案所述的固定化酶在啤酒生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。

作為可選技術(shù)方案，所述固定化酶在啤酒生產(chǎn)過程中的清酒的最后過濾階段添加。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于：

1、由本發(fā)明實(shí)施例提供的共固定化方法制備得到的固定化酶可大大拓寬了雙酶在同時(shí)工作時(shí)對(duì)pH以及溫度的耐受性，從而有利于滿足后續(xù)工序的操作條件；

2、α-乙酰乳酸脫羧酶的底物為α-乙酰乳酸，產(chǎn)物為乙偶姻，而脯氨酸內(nèi)切酶作用于富含脯氨酸片段的特殊多肽，產(chǎn)物為多肽水解后的小肽，因此兩種酶各自的底物和產(chǎn)物均不會(huì)對(duì)彼此的酶活性產(chǎn)生影響，從而有利于提高固定化酶的催化效率；

3、在同一載體上同時(shí)固定兩種酶可節(jié)約固定化酶的生產(chǎn)成本以及使用過程中的操作成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明對(duì)比例所提供的固定化酶在總酶濃度為0mg/ml時(shí)的電鏡照片；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例所提供的固定化酶在總酶濃度為0.1mg/ml時(shí)的電鏡照片；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所提供的固定化酶在總酶濃度為2.4mg/ml時(shí)的電鏡照片；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例所提供的固定化酶在總酶濃度為4.8mg/ml時(shí)的電鏡照片。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明一方面的實(shí)施例提供了一種雙酶共固定化方法，向含有待固定化的α-乙酰乳酸脫羧酶和脯氨酸內(nèi)切酶的緩沖溶液中加入氯化鈣溶液，在設(shè)定溫度下充分反應(yīng)，離心分離，洗滌，得到形成具有納米花結(jié)構(gòu)的固定化酶。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述固定化酶的結(jié)構(gòu)為α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶，其中磷酸鈣為載體，每毫克載磷酸鈣可固定化酶的含量為0.92-47.68mg。在本實(shí)施例中，所得到的固定化酶為α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶中，磷酸鈣由上述方法中的氯化鈣反應(yīng)得到。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為4mmol/L，在所述磷酸鹽緩沖溶液中，α-乙酰乳酸脫羧酶和脯氨酸內(nèi)切酶的總濃度為0.1-4.8mg/ml，優(yōu)選為2.4mg/ml。在本實(shí)施例中，具體限定了磷酸鹽緩沖溶液的濃度以及α-乙酰乳酸脫羧酶和脯氨酸內(nèi)切酶的總濃度，這主要是因?yàn)槿绻傅目倽舛然蚓彌_溶液的濃度太大或太小，均會(huì)導(dǎo)致生成的固定化酶的結(jié)構(gòu)不具備納米花結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致比表面積變小，催化活性變低?？梢岳斫獾氖?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況在上述范圍內(nèi)進(jìn)行合理選擇，例如α-乙酰乳酸脫羧酶和脯氨酸內(nèi)切酶的總濃度還可以為0.6mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2.4mg/ml、3.0mg/ml、3.6mg/ml、4.2mg/ml、4.8mg/ml，當(dāng)然也可以為上述范圍內(nèi)的其它任一值。

在一可選實(shí)施例中，所述氯化鈣溶液的濃度為0.1-0.5mol/L，優(yōu)選為0.1-0.3mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2mol/L。在本實(shí)施例中，限定了氯化鈣溶液的濃度，這主要是考慮到氯化鈣濃度的偏低或過高也均會(huì)最終得到的固定化酶產(chǎn)生影響，例如偏低則無沉淀產(chǎn)生，過高則影響固定化酶的納米結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致比表面積變小，催化活性變低?？梢岳斫獾氖牵绢I(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況在上述范圍內(nèi)進(jìn)行合理選擇，例如，氯化鈣溶液的濃度還可以為0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L、0.4mol/L、0.45mol/L、0.5mol/L，當(dāng)然也可以為上述范圍內(nèi)的其它任一值。

在一可選實(shí)施例中，所述緩沖溶液與所述氯化鈣溶液的體積比為1:1-200:1，優(yōu)選為30:1-80:1，進(jìn)一步優(yōu)選為50:1。在本實(shí)施例中，進(jìn)一步限定了緩沖溶液與氯化鈣溶液的體積比，這樣有利于在加入到氯化鈣溶液中反應(yīng)生成符合要求的具有納米花結(jié)構(gòu)的固定化酶?？梢岳斫獾氖?，緩沖溶液與氯化鈣溶液的體積比還可以為20:1、40:1、60:1、80:1、100:1、120:1、140:1、160:1、180:1、200:1，當(dāng)然也可以為上述范圍內(nèi)的其它任一值。

在一可選實(shí)施例中，所述設(shè)定溫度為0-60℃，優(yōu)選為0-40℃；反應(yīng)時(shí)間為1-24小時(shí)，優(yōu)選為4-18小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為12小時(shí)。在本實(shí)施例中，為了有利于上述方法的進(jìn)行，生成符合要求的具有納米花結(jié)構(gòu)的固定化酶，還對(duì)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)選，可以理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇，例如，設(shè)定溫度還可以為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，反應(yīng)時(shí)間還可以為2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)等，當(dāng)然也可以為上述范圍內(nèi)的其它任一值。

本發(fā)明另一方面的實(shí)施例提供了一種如上述任一實(shí)施例所述的雙酶共固定化方法制備得到的固定化酶。由本發(fā)明實(shí)施例提供的固定化酶大大拓寬了雙酶在同時(shí)工作時(shí)對(duì)pH以及溫度的耐受性，從而有利于滿足后續(xù)工序的操作條件。

本發(fā)明再一方面的實(shí)施例提供了一種如上述實(shí)施例所述的固定化酶在啤酒生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。在本實(shí)施例中，由上述實(shí)施例制備得到的固定化酶可主要應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中。在一可選實(shí)施例中，尤其適用于添加到啤酒生產(chǎn)過程中的清酒的最后過濾階段中。這樣在同一載體上同時(shí)固定兩種酶，不僅有利于提高固定化酶的催化效率，而且還可節(jié)約固定化酶的生產(chǎn)成本以及使用過程中的操作成本?？梢岳斫獾氖?，本實(shí)施例提供的固定化酶不僅可應(yīng)用到啤酒生產(chǎn)過程中，還可根據(jù)需要應(yīng)用到其它應(yīng)用中，例如飲料食品中。

為了更清楚詳細(xì)地介紹本發(fā)明實(shí)施例所提供的雙酶共固定化方法及由該方法制備得到的固定化酶，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行描述。其中，在下述實(shí)施例中主要對(duì)比了初始酶濃度對(duì)最終產(chǎn)物形態(tài)的影響，因此保持了氯化鈣濃度一致。

實(shí)施例1

向含有25ml濃度為0.00mg/ml的α-乙酰乳酸脫羧酶和25ml濃度為0.00mg/ml的脯氨酸內(nèi)切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)緩沖溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化鈣溶液，于25℃反應(yīng)12小時(shí)，12000rpm離心10min，并且用蒸餾水離心洗滌三次，得到不含α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶(PSEP-Ca₃(PO₄)₂–ALDC)的固定化載體，其電鏡照片如圖1所示。圖中可見，當(dāng)不含有初始酶時(shí)，形成的載體主要為堆積的片層狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)偏致密，比表面積不高。

實(shí)施例2

向含有25ml濃度為0.05mg/ml的α-乙酰乳酸脫羧酶和25ml濃度為0.05mg/ml的脯氨酸內(nèi)切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)緩沖溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化鈣溶液，于25℃反應(yīng)12小時(shí)，12000rpm離心10min，并且用蒸餾水離心洗滌三次，得到α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶(PSEP-Ca₃(PO₄)₂–ALDC)固定化酶，所制備得到的固定化酶中，每毫克載磷酸鈣可固定化酶的含量為13.38mg，其電鏡照片如圖2所示。圖中可見，在該初始酶濃度下，相比于不含酶的結(jié)構(gòu)，片層結(jié)構(gòu)疏松，比表面積增大。此時(shí)，已經(jīng)固載部分的兩種酶活約為游離酶活性的30％。

實(shí)施例3

向含有25ml濃度為1.2mg/ml的α-乙酰乳酸脫羧酶和25ml濃度為1.2mg/ml的脯氨酸內(nèi)切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)緩沖溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化鈣溶液，于25℃反應(yīng)12小時(shí)，12000rpm離心10min，并且用蒸餾水離心洗滌三次，得到α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶(PSEP-Ca₃(PO₄)₂–ALDC)固定化酶，所制備得到的固定化酶中，每毫克載磷酸鈣可固定化酶的含量為28.84mg，其電鏡照片如圖3所示。圖中可見，在該初始酶濃度下，片層結(jié)構(gòu)進(jìn)一步疏松，形成蜂窩狀，具備較好的納米花結(jié)構(gòu)，比表面積進(jìn)一步增大。此時(shí)，已經(jīng)固載部分的兩種酶活約與游離酶活性基本一致，甚至比游離酶活性更高。

實(shí)施例4

向含有25ml濃度為2.4mg/ml的α-乙酰乳酸脫羧酶和25ml濃度為2.4mg/ml的脯氨酸內(nèi)切酶的PBS(4mmol/L,pH＝7.4)緩沖溶液中加入0.9ml、0.2mol/L的氯化鈣溶液，于25℃反應(yīng)12小時(shí)，12000rpm離心10min，并且用蒸餾水離心洗滌三次，得到α-乙酰乳酸脫羧酶-磷酸鈣-脯氨酸內(nèi)切酶(PSEP-Ca₃(PO₄)₂–ALDC)固定化酶，所制備得到的固定化酶中，每毫克載磷酸鈣可固定化酶的含量為41.75mg，其電鏡照片如圖4所示。圖中可見，在該初始酶濃度下，片層結(jié)構(gòu)又偏向致密堆積形態(tài)。此時(shí)，已經(jīng)固載部分的兩種酶活為游離酶活性的80％左右。