一種具有血小板聚集抑制功能的抗hiv白紋伊蚊蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白，該蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO：1所示的序列。本發(fā)明所述的抗HIV白紋伊蚊蛋白是由白紋伊蚊唾液腺總RNA經(jīng)純化、擴增出總cDNA，然后，再以總cDNA為模板擴增其基因克隆到原核表達載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、對表達的包涵體變性和復(fù)性折疊后凝膠過濾及離子交換色譜分離純化得到。本發(fā)明的抗HIV白紋伊蚊蛋白具有能抑制HIV在細胞內(nèi)的增殖和數(shù)種激動劑誘導(dǎo)的血小板聚集的活性，及無細胞毒性和抗HIV特異性強的優(yōu)點，可用于制備抗艾滋病及其相關(guān)疾病的藥物。
【專利說明】一種具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白及其 制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及具有多于20個氨基酸的肽，具體涉及一種從動物組織得到的蛋白，該 蛋白具有抗HIV的生物活性。

【背景技術(shù)】：
[0002] 艾滋?。ˋIDS)是以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重損害為特征的傳染性疾病，自其被發(fā)現(xiàn)以 來，已嚴(yán)重威脅人類的生存，對全球人口健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。伴隨著 多年來的研究，目前有許多抗AIDS藥物。據(jù)藥物作用于病毒靶點的不同，已上市的抗AIDS 藥物大致可分為苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、進入抑制 齊IJ、整合酶抑制劑等。這些藥物分別抑制HIV病毒增殖的進入、融合、逆轉(zhuǎn)錄、整合、轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)譯、組合并溢出等過程，使AIDS在治療上取得了很大的進展（Infect Dis R印.2013， 5(Suppll):e2)。目前AIDS發(fā)病率已迅速下降，人們不再談AIDS而色變。由于上述所有藥 物只是針對HIV病毒復(fù)制過程中的某個特定環(huán)節(jié)，容易誘導(dǎo)HIV病毒產(chǎn)生變異形成耐藥毒 株，導(dǎo)致某些藥物失去治療價值。HIV病毒的耐藥性問題成為困擾AIDS治療的世紀(jì)性難題。 研究高效、低毒的抗AIDS藥物和方法是目前國際研究的熱點。
[0003] 應(yīng)用多種藥物的聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（cART)能有效控制疾病進程，并部分解 決HIV病毒的耐藥性問題。但是運用該方法治療后，許多活得長的患者身上出現(xiàn)HIV相關(guān) 疾病，如，慢性炎癥性疾病和神經(jīng)認(rèn)知障礙等（J Pathol. 2008, 10:231-241)。此外，在HIV 感染者體內(nèi)血栓性疾病、心血管疾病的發(fā)表率顯著上升，尤其是血小板減少癥，其在HIV患 者的急性感染期和獲得性免疫缺陷綜合征期經(jīng)常出現(xiàn)（Circulation. 2008, 10:e36 - e40 ; Curr Cardiol Rev. 2008, 10:203-218)。因此在抑制HIV增殖的同時有必要研發(fā)有效的治 療手段控制這些疾病。
[0004] 血小板是炎癥系統(tǒng)的一部分，和HIV感染者的發(fā)病機制密切相關(guān)。在一方面，血小 板能結(jié)合、吞噬、內(nèi)化HIV，并在活化后能充作病毒的儲存器使病毒在其中繁殖和被傳播到 更遠的器官。在另一方面，被HIV感染活化的血小板被能釋放許多炎性物質(zhì)，如SCD40L和 血小板活化因子等進一步促進血小板活化和炎癥發(fā)生，加劇AIDS和相關(guān)疾病的進程（PLoS One. 2012, 10: e44454 ;Blood. 2012, 10:1334 - 1343)。因此，抑制血小板有助于治療 AIDS 和 其相關(guān)疾病。許多關(guān)于阿司匹林、ADP受體阻斷劑、GPIIb-IIIa整合素阻斷劑和statins 等抗血小板分子的研究報道了他們能降低HIV感染者心血管疾病、血栓性疾病和HIV相關(guān) 的炎性疾病的發(fā)生率。在他們之中，Statins能抑制炎癥，弱化血小板活化和因阻斷HIV 病毒顆粒與促感染的細胞組分間的結(jié)合而具有直接的抗HIV活性。許多HIV感染者接受 Statins后能控制聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療帶來的高脂血（Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2011，10:144-147 ;Viral Immunol. 2005, 10:474 - 489)。因此 Statins 被認(rèn)為是很有 前景的AIDS治療候選藥物。由于目前缺乏足夠的研究數(shù)據(jù)，該化合物在成為AIDS治療藥 物的道路上可能存在意想不到的障礙，因此有必要開發(fā)更多的抗HIV和血小板的候選藥物 用于治療AIDS及其相關(guān)疾病。
[0005] 大自然孕育萬物，在其中含有許多相生相克的物質(zhì)，目前已經(jīng)從中草藥和海洋生 物體中分離到了多種具有抑制HIV活性的生物堿類、蛋白類、萜類、黃酮類、木脂素類和香 豆素類等。盡管目前沒有從吸血節(jié)肢動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗HIV活性的活性物質(zhì)，但是HIV的膜 糖蛋白在軟蝶 Antricola delacruzi 和 Ornithodorus parkeri 唾液腺中被發(fā)現(xiàn)（Insect Biochem Mol Biol. 2012, 42(5):332-42 ；Insect Biochem Mol Biol.2008, 38(I):1-21)〇 因此，吸血節(jié)肢動物可能是天然抗HIV蛋白藥物的重要來源。
[0006] 我國對動物毒素的藥用研究有悠久的歷史，但對蚊子等吸血節(jié)肢動物體內(nèi)藥理活 性組分研究不多。白紋伊蚊（Aedes albopictus)是中國重要的媒介昆蟲，在全國各地均有 分布。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有血小板聚集抑制 功能的抗HIV的白紋伊蚊蛋白，該蛋白具有特異性強，活性好和廉價易得的優(yōu)點。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下：
[0009] -種具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白，該蛋白的氨基酸序列 為 MAPIWNAKNPEQIQYLAARCMEEWSPKAKDPKAAIKNWMEWKIQPSNEEATQCYTKCMIENIGYYEPGEKRI KGVRVMQQWETFNRYQSADRNKVHDITDTFDFIKPLKSSSCSDVFNAYKDVHAKHLETIKAILFCDGKSAEKYY KDKGKNVKQKGE SIFVHCEEIHYPVGSPQRNELCKVRKYELGTGKPFENLMECIFKGVRYFNDKNELNIDEIAR DFTQVGKKPDAVKAAMENCKSKTKETDPGKKAVEYYKCLLADSKVKKDFMEAFDYRELRSKDYYAQLTGKIKPY SASDVRKEVNDLDSNKCV(SEQ ID NO ：1)
[0010] 上述白紋伊蚊蛋白為白紋伊蚊唾液腺基因重組表達的一種單鏈蛋白，其分子量為 36656. 83道爾頓，等電點為8. 501。
[0011] 本發(fā)明所述的具有血小板聚集抑制功能抗HIV白紋伊蚊蛋白是利用從吸血的白 紋伊蚊唾液腺基因重組表達得到，其具體制備方法由以下步驟組成：
[0012] (1)提取白紋伊蚊唾液腺總RNA后用PR0MEGA公司的PoiyATtracfmRNA Isolation Systems 試劑盒分離純化 mRNA 和利用 CL0NTECH 公司 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒擴增出白紋伊蚊唾液腺總cDNA，然后采用 SEQ ID NO :2所示的上游引物和SEQ ID NO :3所示的下游引物擴增編碼SEQ ID NO :4所 示的抗HIV白紋伊蚊蛋白的基因，然后先將該基因克隆到pET-17b表達載體中，再轉(zhuǎn)化到 BL21 (DE3)pLysS大腸桿菌中重組表達，并收集目的條帶在28-37kDa間的包涵體蛋白；
[0013] (2)將所收集的包涵體鹽酸胍溶解和折疊后依次上S印hadex SR-100凝膠過濾 柱、Hiprep SP陽離子交換色譜柱、Sephadex G75凝膠過濾柱和Sephadex G75凝膠過濾柱 層析，得到如SEQ ID NO :1所示序列的白紋伊蚊唾液腺基因重組表達蛋白。
[0014] 本發(fā)明所述的抗HIV的白紋伊蚊蛋白對HIV不同毒株具有特異性抑制作用，IC5tl 介于10-35nM間且無毒副作用，能抑制ADP、U46619和collagen誘導(dǎo)的血小板聚集。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0015] 圖1為本發(fā)明抗HIV白紋伊蚊蛋白大腸桿菌表達電泳圖，圖中，箭頭所示為目的峰 位置，帶1為不加陰性菌對照，帶2為陽性菌誘導(dǎo)結(jié)果，帶3為陽性菌非誘導(dǎo)結(jié)果，帶4為蛋 白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。
[0016] 圖2為本發(fā)明抗HIV白紋伊蚊蛋白純化色譜圖，圖中箭頭所示為目的峰，A、B、C、D 圖分別是Sephadex SR-100凝膠過濾柱層析、Hiprep SP陽離子交換色譜柱層析、Sephadex G75凝膠過濾柱層析、Sephadex G75凝膠過濾柱層析結(jié)果圖，圖2D中電泳圖是最后一步 Sephadex SR-100凝膠過濾柱層析的活性峰的電泳結(jié)果，圖示條帶為目的蛋白。
[0017] 圖3為本發(fā)明抗HIV白紋伊蚊蛋白抑制血小板聚集圖，圖中，a為陰性對照；b為 1. 85 ii M蛋白對Convuxlin、U46619和Collengen誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用；c為9 ii M蛋白 Convuxlin誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用。

【具體實施方式】：
[0018] 具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白的制備和鑒定：
[0019] 一）具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白基因的克?。?br> [0020] I、白紋伊蚊唾液腺總RNA提?。?br> [0021] A.活體白紋伊蚊放在冰上30-60分鐘冰凍麻醉，在顯微鏡下解剖50只白紋伊蚊得 到唾液腺，加入Iml總RNA提取緩沖液（Trizol溶液，美國GIBC0BRL公司產(chǎn)品），于5ml玻 璃勻漿器中勻漿1分鐘。
[0022] B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置1分鐘，4°C，12000rpm離心10 分鐘，棄除沉淀。
[0023] C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置4分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘，沉淀 用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為印鼠客蚤唾液腺總RNA。
[0024] II、白紋伊蚊唾液腺mRNA的純化：
[0025] 白紋伊蚊唾液腺mRNA分離純化采用美國PR0MEGA公司的PolyATtract? mRNA Isolation Systems 試劑盒。
[0026] A.取白紋伊蚊唾液腺總RNA 500 ii g溶于500 ill DEPC水中，放入65°C水浴10分 鐘，加人3 ill的Oligo (dT)探針和13 ill 20X SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
[0027] B?磁珠（SA-PMP)的洗滌：將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，力口 0. 5 X SSCO. 3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0. Iml 0. 5 X SSC懸浮，稱之為B液。
[0028] C?將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0? I X SSC 洗滌4次，最后棄上清，加0. I ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試 管，再加入0. 15mlDEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純 化的白紋伊蚊唾液腺mRNA。
[0029] D?加入1/10體積3M乙酸鈉，pH 5. 2,等體積異丙醇，于-70°C放置30分鐘，4°C， 12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10 ill DEPC水中。
[0030] III、白紋伊蚊唾液腺總cDNA擴增：
[0031] 米用 CL0NTECH 公司 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit 質(zhì)粒 cDNA文庫構(gòu)建試劑盒擴增。
[0032] A. cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄）：
[0033] 1.在0. 5ml無菌的離心管加入I ill白紋伊蚊唾液腺mRNA、l ill SMART IV寡聚核 苷酸、I ill⑶S 111/3'PCR引物，加2 ill去離子水使總體積達到5 ill。
[0034] 2.混勻離心管中的試劑并以12000rpm離心15秒，72°C保溫2分鐘。
[0035] 3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
[0036] 4?在離心管中加入2. Oiil 5X第一鏈緩沖、I. Oiil 20mM二硫蘇糖醇、I. Oiil IOmMdNTP 混合物、I. 0 u I PowerScript 反轉(zhuǎn)錄酶。
[0037] 5.混合離心管中試劑并以12000rpm離心15秒，在42°C保溫1小時。
[0038] 6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
[0039] 7.從離心管取2 ill所合成的cDNA第一鏈備用。
[0040] B.采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR)方法擴增第二鏈
[0041] L 95 °C 預(yù)熱 PCR 儀。
[0042] 2?將 2 U I cDNA 第一鏈（mRNA 反轉(zhuǎn)錄）、80 U 1 去離子水、10 U 1 10 X Advantage 2PCR 緩沖、2 ill 50XdNTP 混合物、2 ill 5'PCR 引物、2 ill CDS 111/3'PCR 引物以及 2 ill 大腸桿菌聚合酶離心管進行反應(yīng)。
[0043] 3.在PCR儀中按以下程序擴增：①95°C，20秒鐘；②22個循環(huán)：95°C，5秒鐘； 68°C，6分鐘
[0044] 4.循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。
[0045] C. PCR 產(chǎn)物用 PR0MEGA 公司的 WizarcT SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒 進行抽提回收，步驟如下：
[0046] 1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液 轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30秒，倒 掉收集管中的廢液。
[0047] 2?加入700 ill的洗脫液（含乙醇）于離心純化柱中，以12000rpm離心30秒，倒 掉收集管中的廢液。
[0048] 3?重復(fù)步驟2,12000rpm離心5分鐘。
[0049] 4.將離心純化柱置于新的離心管中，加入30 ill超純水，在室溫下靜置5分鐘，以 12000rpm離心30秒，管底溶液即為所純化過的白紋伊蚊唾液腺總cDNA。
[0050] IV、具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白基因的克?。?br> [0051] 依據(jù)報道的白紋伊蚊唾液腺核苷酸序列（GenBank :AY826093. 1)為參考設(shè)計引物 D7F:5' TGCATATGGCACCTCTGTGGAATGCAAAGAATCC' 3 (SEQ ID NO :2)和 D7R: 5' CCCTCGAGTTA AACACACTTGTTGCTGTCGATATC'3(SEQ ID N0:3)。以100倍稀釋純化過的白紋伊蚊唾液腺總 cDNA為模板擴增具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白基因。PCR反應(yīng)程序為： ①95°C，4分鐘；②35個循環(huán)：94°C，30秒鐘；56°C，30秒鐘；72°C，45秒鐘；③72°C，10分 鐘。將擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，用DNA純化試劑盒進行純化。將純 化的目的片段連接到PMD19-T載體中，即得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進Takara公司的大 腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞。取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含Amp的LB平板上，經(jīng)37°C培養(yǎng)16h形 成的單菌落即為含目的片段的陽性克隆。挑取單菌落用M13引物檢測插入片段的大小。挑 選含目的片段的陽性質(zhì)粒送公司進行測序。測序結(jié)果顯示基因自5'端至3'端序列為（SEQ ID NO ：4)：
[0052] catatggcacctatctggaatgcaaagaatcccgagcaaatccagtacctagctgcccgttgtatggaa

【權(quán)利要求】
1. 一種具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白，該蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :1所示的序列。
2. -種權(quán)利要求1所述具有血小板聚集抑制功能的抗HIV白紋伊蚊蛋白的制備方法， 該方法由以下步驟組成： (1) 提取白紋伊蚊唾液腺總RNA后用PR0MEGA公司的PoIyATtractk mRNA Isolation Systems 試劑盒分離純化 mRNA 和利用 CL0NTECH 公司 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒擴增出白紋伊蚊唾液腺總cDNA，然后采用 SEQ ID NO :2所示的上游引物和SEQ ID NO :3所示的下游引物擴增編碼SEQ ID NO :4所 示的抗HIV白紋伊蚊蛋白的基因，然后先將該基因克隆到pET-17b表達載體中，再轉(zhuǎn)化到 BL21 (DE3)pLysS大腸桿菌中重組表達，并收集目的條帶在28-37kDa間的包涵體； (2) 將所收集的包涵體鹽酸胍溶解、復(fù)性折疊后依次上Sephadex SR-100凝膠過濾柱、 Hiprep SP陽離子交換色譜柱、Sephadex G75凝膠過濾柱和Sephadex G75凝膠過濾柱層 析,得到如SEQ ID NO :1所示序列的白紋伊蚊唾液腺基因重組表達蛋白。
【文檔編號】C07K14/435GK104356220SQ201410636317
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】徐學(xué)清, 李琳, 劉叔文 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)