高山被孢霉突變株、利用其生產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法及花生四烯酸油脂的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高山被抱霉突變株、利用其生產(chǎn)花生四締酸油脂的方法及花生四締酸 油脂。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物油中存在多種不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸主要包括單不飽和脂肪酸和多 不飽和脂肪酸，它們均對(duì)人體健康有很大益處。多不飽和脂肪酸包括二十二碳六締酸 (DHA)、二十碳五締酸化PA)、花生四締酸(ARA)等，它們?cè)隗w內(nèi)具有降血脂、改善血液循環(huán)、 抑制血小板凝集、阻抑動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和血栓形成等功效，對(duì)屯、腦血管病也有良好的防 治效果。
[0003] 花生四締酸油脂目前已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段，但是，目前研究多只關(guān)注于油脂 中花生四締酸的含量，卻忽略了油脂中其他成分，特別是長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的含量。而長(zhǎng)鏈飽 和脂肪酸的含量對(duì)油脂的品質(zhì)影響非常大，如花生四締酸油脂中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸在體系中 所占的比例對(duì)油脂的凝固點(diǎn)起著決定作用，特別是二十碳W上的飽和脂肪酸，例如花生酸 (C20:0)，山齋酸(C22:0)，木蠟酸(C24:0)等，并且飽和脂肪酸的凝固點(diǎn)一般是隨烷基碳鏈 長(zhǎng)度(即碳原子數(shù))的增加而增加。目前，市售高山被抱霉所生產(chǎn)的花生四締酸油脂產(chǎn)品中， 二十碳W上的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的含量在20wt%左右。該油脂在12°C時(shí)即會(huì)析出飽和脂肪 酸、出現(xiàn)體系渾濁的現(xiàn)象，運(yùn)樣就影響了花生四締酸油脂的質(zhì)量。此外，長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸攝 入量過高是導(dǎo)致血膽固醇、Ξ酷甘油、低密度脂蛋白膽固醇化DL-C)升高的主要原因，繼發(fā) 引起動(dòng)脈管腔狹窄，形成動(dòng)脈粥樣硬化，增加患冠屯、病的風(fēng)險(xiǎn)，因此降低長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的 含量，同時(shí)提高油脂中花生四締酸的含量(可降低花生四締酸油脂的用量從而進(jìn)一步降低 長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的添加量)則成為花生四締酸油脂品質(zhì)提高另一個(gè)重要的課題。
[0004] 中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào)為CN1362522A的專利申請(qǐng)公開了一種W高山被抱霉為出發(fā) 菌株進(jìn)行粒子束誘變的方法得到一種花生四締酸產(chǎn)量較高的菌株。但是，本發(fā)明未提及如 何降低長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的含量。中國(guó)發(fā)明專利公布號(hào)為CN101709297的專利申請(qǐng)公開了一 種采用紫外的方法對(duì)高山被抱霉進(jìn)行誘變，從而能生產(chǎn)出較高產(chǎn)量的花生四締酸。但是，本 發(fā)明也未提及如何降低長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的含量。中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào)為CN1662642的專利 設(shè)及一種微生物油，含有至少90%的甘油Ξ醋，PUFA含量為至少40%，其過氧化值(P0V)低 于1.5(或1.0)，和/或其茵香胺值(AnV)低于15,可選地，低于12。本申請(qǐng)主要關(guān)注的也只是 微生物油脂中不飽和脂肪酸的含量、過氧化值及茵香胺值等，而并未提及長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸 的含量。
[0005] 中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào)為CN103571896A的專利申請(qǐng)公開了一種利用高山被抱霉突 變株生產(chǎn)花生四締酸油脂的方法及其生產(chǎn)的花生四締酸油脂，該專利利用高山被抱霉突變 株生產(chǎn)的花生四締酸油脂中，二十碳W上長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的總含量比較低（低于15wt%)， 但該專利所得到的花生四締酸含量最高為44.56%，二十碳W上長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的總含量 最低為7.5%。
[0006] 因此，有必要開發(fā)出新的高山被抱霉菌種，進(jìn)一步的提升花生四締酸的含量，并降 低長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的總含量。而有一點(diǎn)需要特別指出的是:花生四締酸含量每一個(gè)百分比 的提高都是很難的而且隨著花生四締酸含量越高，花生四締酸含量提高難度則越大。如果 要在對(duì)比文件1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高花生四締酸的含量(最高為44.56%)，更是難上加難。 本發(fā)明則在CN103571896A所提到的菌種基礎(chǔ)上通過大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)，進(jìn)行了大量的誘變 篩選，才獲得了目前本專利所請(qǐng)求保護(hù)的新菌種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種新的高山被抱霉突變株、利用其生產(chǎn)花生四締酸油脂的 方法及花生四締酸油脂。由該高山被抱霉突變株制得的花生四締酸油脂中，具有高花生四 締酸含量和低長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為；
[0009] 提供高山被抱霉突變株(高山被抱霉Y16，ModierellaalpineY16)，該菌株于2015 年7月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保 藏編號(hào)為CCTCC N0:M2015421。
[0010] 上述高山被抱霉突變株在生產(chǎn)具有高含量花生四締酸和低含量長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸 的花生四締酸油脂中的應(yīng)用。
[0011] 利用上述高山被抱霉突變株生產(chǎn)花生四締酸油脂的方法，其特征在于:將所述的 高山被抱霉突變株發(fā)酵，收集發(fā)酵產(chǎn)物，后處理即得花生四締酸油脂。
[0012] -種利用上述高山被抱霉突變株生產(chǎn)的花生四締酸油脂，其特征在于:所述花生 四締酸油脂含有至少92wt%的甘油Ξ醋，油脂中花生四締酸含量至少為48.4wt%，二十碳 W上長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量低于6.3wt%。所述的二十碳W上的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸包括花生酸、 山齋酸、木蠟酸。
[0013] 優(yōu)選地，所述花生四締酸油脂含有至少93.7wt%的甘油Ξ醋，油脂中花生四締酸 含量至少為52. Iwt%，二十碳W上長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量低于5.6wt%。
[0014] 優(yōu)選地，所述花生四締酸油脂含有至少94.9wt%的甘油Ξ醋，油脂中花生四締酸 含量至少為54.8wt%，二十碳W上長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量低于5.2wt%。
[0015] 本發(fā)明具有如下有益效果:利用該發(fā)明所述的高山被抱霉突變株生產(chǎn)花生四締酸 油脂的方法生產(chǎn)的花生四締酸油脂中，花生四締酸含量最高可達(dá)到54.8wt%，二十碳W上 長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量最低可低至5.2wt%。該油脂在較低溫度下也不會(huì)凝固結(jié)晶，可保持清 亮透明，具有較高的品質(zhì)。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明單菌落的顯色圖。 圖2為高山被抱霉菌株ModierellaalpineY16與相關(guān)種的口S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下實(shí)施例用來詳細(xì)說明本發(fā)明的具體內(nèi)容，但本發(fā)明并不限于W下實(shí)施例的內(nèi) 容。
[001引 實(shí)施例1
[0019] 高山被抱霉突變株的選育方法
[0020] (1)取CCTCC N0:M2013419菌種作為出發(fā)菌株，該菌株由嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有 限公司于2013年9月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏地址是，中國(guó)，武 漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013419。
[0021] (2)將菌種接種于馬鈴馨葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上在28Γ恒溫條件下培養(yǎng)8天至 抱子成熟。
[0022] (3)通過紗布或?yàn)V紙過濾得到純的抱子液，將抱子液注入到無菌培養(yǎng)皿上經(jīng)過紫 外燈照射，紫外燈照射距離為15厘米，照射時(shí)間為120秒，紫外燈的功率為30瓦。
[0023] (4)經(jīng)過紫外誘變后的抱子液經(jīng)無菌風(fēng)風(fēng)干，成為菌斑。將含菌斑的培養(yǎng)皿無菌移 入高能粒子束注入機(jī)中，經(jīng)過高能離子束注入誘變。
[0024] (5)將菌斑用無菌水洗脫，稀釋，涂于馬鈴馨葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板上進(jìn)行 培養(yǎng)，馬鈴馨葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板中添加75ppm濃度的2,3,5-氯化Ξ苯基四氮挫 (TTC)，由于TTC可作為脫氨酶活性指示劑，當(dāng)菌體內(nèi)有脫氨酶時(shí)，其可在TT巧旨示劑作用下 直接在平板上顯色，由此根據(jù)顯色深淺可判斷單菌落的脫氨酶活性的高低，而花生四締酸 的產(chǎn)生與脫氨酶活性的高低非常相關(guān)，進(jìn)而可找到花生四締酸含量較高的單菌落。單菌落 的顯色見圖1。
[0025] (6)在平板上挑取顏色較深的單菌落進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)各菌獲得的微生物 油醋的脂肪酸分布，選取甘油Ξ醋含量超過90wt %且花生四締酸中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸花生酸 (C20:0)、山齋酸(C22:0)、木蠟酸(C24:0)總含量最低(低于7wt % )的菌和花生四締酸含量 最高的菌(高于52wt%)的菌種作為下一次誘變的出發(fā)菌株。經(jīng)過反復(fù)200次誘變，得到本發(fā) 明的高山被抱霉突變株，該菌株于2015年7月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、(CCTCC)， 保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2015421。
[00%] 上述高山被抱霉菌株CCTCC N0:M2015421具有W下生理生化特性：
[0027] (1)生長(zhǎng)于PDA斜面培養(yǎng)基，在28 °C下生長(zhǎng)3天后，在培養(yǎng)基表面會(huì)形成白色菌落，4 天后生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，氣生菌絲顏色雪白，7天后，菌絲布滿整個(gè)斜面;部分菌落會(huì)形成 乳白色油脂堆積物，菌絲包藏于堆積物內(nèi)。10天后，部分菌絲生長(zhǎng)出黃色抱子。（2)最適宜培 養(yǎng)溫度為25~27°C;
[0028] (3)誘變菌株發(fā)育樹如圖2所示。從圖2可看出:誘變得到的菌株根據(jù)rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間 隔區(qū)口 SaTSrDNA)鑒定結(jié)果，可判斷誘變菌株為高山被抱霉。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 利用高山被抱霉突變株生產(chǎn)花生四締酸
[0031] a)抱子懸浮液準(zhǔn)備:分別取市售的高山被抱霉和本發(fā)明所使用的高山被抱霉(保 藏編號(hào):CCTCC M2015421)接種到馬鈴馨葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板上，25-27Γ培養(yǎng)10天 至抱子成熟，后將馬鈴馨葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板上的抱子和菌絲刮到裝有20毫升無 菌水，震蕩獲得抱子懸浮液。
[0032] b)搖瓶種子培養(yǎng):將步驟（1)的抱子懸浮液接種到放有培養(yǎng)基的種子瓶中，接種量 15%(體積比），置于27°C，220轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)72小時(shí)，所述培養(yǎng)基為:碳源薦糖35g/ 1;氮源酵母浸粉12g/l;pH 7。
[0033] c)種子擴(kuò)大培養(yǎng):最終發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50L的容積，因此種子罐選用lOL種子擴(kuò)大 發(fā)酵罐。將步驟(2)的搖瓶種子發(fā)酵液接種到種子罐中進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，其中的種子培養(yǎng) 基碳源薦糖35g/l;氮源酵母浸粉12g/l，控制pH 7，發(fā)酵溫度為28°C，攬拌速度220轉(zhuǎn)/分鐘， 通氣量lvvm(X/L.min)，罐壓0.1 Mpa，培養(yǎng)42h。
[0034] d)發(fā)酵培養(yǎng):種子罐中菌濃達(dá)到20 %后，通過移種管道接入到裝有30L發(fā)酵培養(yǎng)基 的50L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，接種量15% (體積比），發(fā)酵罐控制溫度28Γ，攬拌速度220轉(zhuǎn)/分 鐘，通氣量1 vvm化/L. min)，罐壓0.1 Mpa，培養(yǎng)17化。發(fā)酵過程中通過流加碳源來控制發(fā)酵液 中碳源濃度在lOg/L，所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基為:碳源薦糖35g/l;氮源酵母浸粉12g/l; pH 7。
[0035] e)后處理:將發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液分離，得到濕菌體，烘干得到干菌體40g。向干 菌體中加入萃取劑正己燒進(jìn)行萃取，萃取后分離得到的固相物轉(zhuǎn)入萃取容器中進(jìn)行重復(fù)