用于氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因snp檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法，所述試劑盒包括檢測(cè)基因CYP2C19*2位點(diǎn)的兩條正向引物及一條反向引物，和檢測(cè)基因CYP2C19*3位點(diǎn)兩條正向引物和一條反向引物。本發(fā)明的試劑盒，可以對(duì)上述兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行高通量檢測(cè)，基因分型的結(jié)果可以通過(guò)軟件直觀的進(jìn)行分辨，從而達(dá)到對(duì)氯吡格雷計(jì)量量化的控制，最大程度的降低副作用的目的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于氯郵格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒及其檢 測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及多重基因檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法，尤其是用于氯化格雷個(gè)體化用 藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氯化格雷是一種新型的嚷吩并化晚類(lèi)衍生物，它通過(guò)選擇性的與血小板表面腺巧 酸環(huán)化酶偶聯(lián)的ADP受體結(jié)合而不可逆地抑制血小板聚集，目前廣泛應(yīng)用于急性冠脈綜合 征、缺血性腦血栓、閉塞性脈管炎和動(dòng)脈硬化及血栓栓塞引起的并發(fā)癥。屯、臟支架手術(shù)后的 患者需要長(zhǎng)期服用氯化格雷W防止支架內(nèi)再生梗。臨床研究表明氯化格雷療效存在明顯的 個(gè)體差異，4%~30%的患者服用常規(guī)劑量的氯化格雷不能有效抑制血小板聚集反應(yīng)。
[0003] 氯化格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應(yīng)，因此CYP2C19遺傳變異可 導(dǎo)致酶活性的個(gè)體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者(ultrarapid me1:abolize;r，UM)、快代謝者 (extensive metabolizer,EM)、中間代謝者（intermediate metabolizer, IM)和慢代謝者 (poor metabolizer，PM)4種表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G〉A(chǔ))和CYP2C19*3 (rs4986893，c.636G〉A(chǔ))是中國(guó)人群中存在的巧中導(dǎo)致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。 CYP2C19*2導(dǎo)致剪切缺失，CYP2C19*3為終止密碼子突變。EM個(gè)體只攜帶CYP2C19*1等位基 因；IM個(gè)體攜帶CYP2C19巧或CYP2C19*3雜合子基因型；PM個(gè)體包括CYP2C19*2/巧、CYP2C19* 2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。東方人群中75-85%的PM由CYP2C19巧所致，約20-25%的PM由 CYP2C19*3所致。美國(guó)抑A和美國(guó)屯、臟病學(xué)會(huì)建議，對(duì)于CYP2C19慢代謝基因型患者需要考慮 改變治療方案，具體意見(jiàn)為：CYP2C19*1/*1基因型個(gè)體應(yīng)用氯化格雷有效，可常規(guī)使用； CYP2C19*2或*3基因型個(gè)體對(duì)氯化格雷療效降低，建議更換成普拉格雷或替卡格雷； CYP2C19*2或CYP2C19*3突變型純合子個(gè)體應(yīng)用氯化格雷效果差，建議換用普拉格雷或替卡 格雷。
[0004] 目前常用的檢測(cè)基因多態(tài)性的方法有DNA直接測(cè)序法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分 析法(PCR-P化P)、高分辨率溶解曲線(xiàn)化RM)、基因忍片、液相忍片法、巧光定量PCR法等。測(cè)序 技術(shù)是公認(rèn)的檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但其設(shè)備成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)通量低、檢測(cè)靈 敏度低、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)操作要求高、結(jié)果判定步驟繁瑣等原因，較難形成商業(yè)化的診斷 產(chǎn)品；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法檢測(cè)靈敏度同樣不高、操作步驟繁瑣，檢測(cè)的結(jié)果仍需 要進(jìn)行一代測(cè)序法的再次驗(yàn)證，尤其當(dāng)樣本量多時(shí)極易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出 現(xiàn)酶切不充分或酶切過(guò)度而出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，因此也無(wú)法應(yīng)用到臨床上。忍片檢 測(cè)因其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，也不適于開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)試劑 盒。巧光定量PCR的檢測(cè)方法擁有成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)，結(jié)果的重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是 檢測(cè)SNP的非常好的一種檢測(cè)手段，但是常規(guī)的Taqman探針?lè)ㄌ结樣嗁?gòu)成本太高，多個(gè)位點(diǎn) 同時(shí)檢測(cè)時(shí)很難保證所有引物探針在同一擴(kuò)增條件下均達(dá)到非常好的擴(kuò)增效果。因此，急 需要找到一種簡(jiǎn)便易行的基因分型方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的用于氯化格雷 個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于氯化格雷個(gè)體化用 藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒，包括2X qPCR混合反應(yīng)液和檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引 物mix和檢測(cè)基因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的引物mix;所述的檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引物 mix含有檢測(cè)該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物，所述的檢測(cè)基因 CYP2C19* 3SNP位點(diǎn)的引物mix含有檢測(cè)該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物;所述檢測(cè) 基因 CYP2C19巧SNP位點(diǎn)的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID ^).5所示，所述檢測(cè)基因〔￥口2(：19*35肥位點(diǎn)的的兩條特異性正向引物及 一條反向引物序列如沈Q ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ IDN0.8所示。
[0007] 所述的2X qPCR混合反應(yīng)液中含PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、兩條 分別用FAM和肥X標(biāo)記的通用巧光探針，所述FAM標(biāo)記的通用巧光探針序列如SEQ ID NO. 1所 示，所述肥X標(biāo)記的通用巧光探針序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 具體說(shuō)，包括W下步驟:提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA,然后分成2個(gè)反應(yīng)管a、b進(jìn) 行檢測(cè)，首先在每個(gè)反應(yīng)管中分別加入2X qPCR混合反應(yīng)液，然后在第一反應(yīng)管a加入檢測(cè) 基因 CYP2C19巧SNP位點(diǎn)的引物mix;在第二反應(yīng)管b加入檢測(cè)基因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的引物 mix,最后在2個(gè)反應(yīng)管a、b中加入待檢測(cè)樣本的基因組DNA，進(jìn)行核酸樣本的巧光定量PCR擴(kuò) 增，在37 °C進(jìn)行巧光信號(hào)的掃描，使用LightCycler 480Sof twarerelease軟件中的 化化iont Genotyping模塊，根據(jù)兩種巧光信號(hào)的強(qiáng)度及比值對(duì)基因型進(jìn)行自動(dòng)判讀。
[0009] 所述PCR擴(kuò)增程序如下：
[0010]預(yù)變性的條件為:溫度為94°c，時(shí)間化5秒；
[0011] PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成；
[0012] 第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為：
[OOU]變性:溫度為94°C，時(shí)間為20秒；
[0014] 退火+延伸：起始溫度為6 rc，每一輪擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減0.5 °C，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié) 束，時(shí)間為60秒；
[0015] 第二階段由29輪循環(huán)構(gòu)成，其條件為：
[0016] 變性:溫度為94°C，時(shí)間為20秒；
[0017] 退火+延伸:溫度為55C，時(shí)間為60秒；
[0018] 信號(hào)掃描條件為:溫度為37°C，時(shí)間為60秒。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的試劑盒能快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的對(duì)基因分型，并 且通過(guò)與一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，結(jié)果符合度高達(dá)99% W上，有望在臨床快速基因分 型中得到廣泛應(yīng)用。解決現(xiàn)有其他檢測(cè)技術(shù)價(jià)格昂貴、效率低下及通量不高的問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測(cè)基因 CYP2C19*2位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和 一條反向引物對(duì)四個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0021] 圖2為圖1中所示的1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6六個(gè)待測(cè)樣本的一代測(cè)序(Sanger 測(cè)序)圖。
[0022] 圖3為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測(cè)基因 CYP2C19*3位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和 一條反向引物對(duì)四個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果圖。
[002；3] 圖4為圖3中所示的2-1、2-2、2-3、2-4四個(gè)待測(cè)樣本的一代測(cè)序(Sanger測(cè)序）圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：
[0025] 本發(fā)明用于氯化格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法，所述 試劑盒包括檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的的兩條特異性正向引物及一條反向引物，和檢測(cè) 基因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物。
[0026] 所述檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列 如下所示：
[0027] A等位基因正向引物:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA 沈Q ID NO.3
[0028] G等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG 沈Q ID NO.4
[00巧]反向引物：GCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTT 沈Q ID N0.5
[0030] 所述檢測(cè)基因 CYP2C19*3位點(diǎn)的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下 所示：
[0031] A等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA 沈Q ID NO.6
[0032] C等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGGATTGTAAGCACCCCCTGG SEQ ID NO. 7
[0033] 反向引物:GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGAT 沈Q ID N0.8
[0034] 其中，所述正向引物均由兩部分序列結(jié)合而成：突變型正向引物的5'端為通用序 列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO. 1)，3'端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特異序列；野生型正向 引物的5'端為通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID N0.2)，3'端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特 異序列。
[0035] 本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)方法，擴(kuò)增程序如下所示：
[0036] 預(yù)變性的條件為:溫度為94°C，時(shí)間為15秒；
[0037] PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成；
[0038] 第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為：
[0039] 變性:溫度為94°C，時(shí)間為20秒；
[0040] 退火+延伸：起始溫度為ere，每一輪擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減0.5 °c，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié) 束，時(shí)間為60秒；
[0041 ]第二階段由29輪循環(huán)構(gòu)成，其條件為：
[0042] 變性:溫度為94°C，時(shí)間為20秒；
[0043] 退火+延伸:溫度為55°C，時(shí)間為60秒；
[0044] 信號(hào)掃描條件為:溫度為37°C，時(shí)間為60秒。
[0045] 本發(fā)明的引物(primer)是PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)中的重要組成部分，它是一 小段單鏈DNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為每個(gè)多核巧酸鏈進(jìn)行延伸的 出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核巧酸鏈，在引物的3'-OH上，核巧酸W二醋鍵形式進(jìn)行合成，因此引 物的3'-OH必須是游離的。突變型正向引物的5'通用序列與2X PCR混合反應(yīng)液中用FAM巧光 染料標(biāo)記的通用序列一致;野生型正向引物的5'通用序列與2X PCR混合反應(yīng)液中用皿X巧 光染料標(biāo)記的通用序列一致;攜帶巧光染料標(biāo)記的通用序列用于為巧光定量PCR擴(kuò)增完成 后提供巧光信號(hào)。
[0046] 本發(fā)明的工作原理是:針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了兩條特異性正向引物和一條反向 引物。兩條特異性正向引物3'端最后一個(gè)核巧酸分別與突變位點(diǎn)所檢測(cè)的堿基互補(bǔ)配對(duì)， 在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增時(shí)聯(lián)合反向引物對(duì)待測(cè)DNA模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR前10個(gè) 循環(huán)的擴(kuò)增采用了Touchdown PCR，即降落PCR，是優(yōu)化和改良后的一種PCR方法，指每一個(gè) (或n個(gè))循環(huán)降低0.5°C (或n°C)退火溫度，直到達(dá)到一個(gè)較低的退火溫度(Touchdown退火 溫度），W此來(lái)保證不同Tm值的引物均可W與相應(yīng)的待測(cè)DNA模板結(jié)合并進(jìn)行特異性擴(kuò)增。 隨后進(jìn)行的29個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增過(guò)程中，2X PCR混合反應(yīng)液中的分別用FAM和皿X標(biāo)記的兩 條通用探針會(huì)W前10輪PCR擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為模板，配合反向引物產(chǎn)生出攜帶有不同 巧光染料標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。最后在37°C進(jìn)行巧光信號(hào)的掃描，由軟件根據(jù)兩種巧光信號(hào)的強(qiáng) 度及比值對(duì)基因型進(jìn)行自動(dòng)判別。
[0047] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下的優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0048] 1、本發(fā)明采用特殊設(shè)計(jì)的引物，巧光信號(hào)由PCR混合液中的兩種攜帶不同巧光染 料標(biāo)記的通用序列提供，無(wú)需單獨(dú)設(shè)計(jì)特異性探針，極大的減少了研發(fā)周期及檢測(cè)成本。
[0049] 2、本發(fā)明采用特殊的PCR程序，大大減少了由于Tm值太低而導(dǎo)致的引物與模板在 錯(cuò)誤位點(diǎn)的結(jié)合，從而提高了 PCR效率和靈敏度，為臨床氯化格雷用藥劑量調(diào)整提供可靠的 依據(jù)。
[0050] 3、本發(fā)明采用的SNP位點(diǎn)基因分型軟件，可W直觀的自動(dòng)判別每個(gè)待測(cè)位點(diǎn)的基 因型，無(wú)需通過(guò)Ct值的繁瑣計(jì)算，極大的降低了結(jié)果判讀時(shí)的人為失誤，并縮短了結(jié)果判讀 的時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
[0051] 4、本發(fā)明的試劑盒，可W根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量的多少，靈活的選用8連管、96孔板或 者384孔板進(jìn)行檢測(cè)，一次的檢測(cè)通量分別為1人份、28人份和124人份。
[0052] 5、本發(fā)明的試劑盒，可W實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度、高效率的對(duì)CYP2C19基因上的巧、*3兩個(gè) SNP位點(diǎn)檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)氯化格雷用藥劑量的量化控制，甚至對(duì)血栓性疾病的預(yù)防、抗凝 藥物的選擇、新抗凝藥的研發(fā)、血栓性的疾病預(yù)后也起到一定的作用。
[0化3]實(shí)施例1
[0054] -種用于指導(dǎo)氯化格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒包含：2X PCR混合 反應(yīng)液、檢測(cè)CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引物mix和檢測(cè)CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的引物mix。
[0055] 所述檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引物mix由兩條特異性正向引物及一條反向引 物組成，序列如下所示：
[0056] A等位基因正向引物:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA 沈Q ID NO.3
[0057] G等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG 沈Q ID NO.4
[0化引 反向引物：GCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTT 沈Q ID N0.5
[0059] 所述檢測(cè)基因 CYP2C19*3位點(diǎn)的引物mix由兩條特異性正向引物及一條反向引物 組成，序列如下所示：
[0060] A等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA 沈Q ID NO.6
[0061 ] C等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGGATTGTAAGCACCCCCTGG SEQ ID NO. 7
[0062] 反向引物:GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGAT 沈Q ID N0.8
[0063] 其中，所述正向引物均由兩部分序列結(jié)合而成：突變型正向引物的5'端為通用序 列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQ ID NO. 1)，3'端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特異序列；野生型正向 引物的5'端為通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQ ID N0.2)，3'端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特 異序列。
[0064] 實(shí)施例2
[0065] -種用于指導(dǎo)氯化格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒采用的PCR擴(kuò)增方 法包括W下步驟：
[0066] 第一步:待測(cè)樣本基因組DNA提取
[0067] (1)從患者抽取血液樣本。
[006引 （2)從血液中獲取DNA，采用天根生化（北京）有限公司生產(chǎn)的TGuide血液基因組 DNA提取試劑盒(0SR-M102)在其配套的TGuide M16核酸自動(dòng)提取儀上進(jìn)行提取。
[0069] 提取過(guò)程如下：
[0070] a.往樣品管中加入20化1/40化1的哺乳動(dòng)物全血樣本，并加入lOiU/2化1蛋白酶K 混勻。
[0071] b.放置樣品管于T型架的孔4位置。運(yùn)行編號(hào)102程序(全血基因組DNA提取程序）， 選擇相應(yīng)的樣本量體積和最終洗脫體積。
[0072] 第二步:對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增
[0073] 采用lOng/lOul反應(yīng)體系，具體操作為：
[0074] 1、將上述一系列引物分別與血液基因組DNA、2X PCR混合反應(yīng)液、去離子水按照一 定比例混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系，具體見(jiàn)下表：
[0075]
[0076] 2、對(duì)上述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)條件見(jiàn)下表：
[0077]
[0078] 第S步:觀測(cè)結(jié)果
[0079] 表1為采用試劑盒中的檢測(cè)基因 CYP2C9*2位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向 引物對(duì)四個(gè)樣品的基因型結(jié)果。
[0080] 表 1
[0081]
[0082] 如圖1所示，在CYP2C19*2位點(diǎn)的巧光定量PCR擴(kuò)增體系中，檢測(cè)A等位基因的特異 性正向引物5'端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中FAM巧光標(biāo)記的引物序列一致，檢巧化等位基因 的特異性正向引物5 '端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中肥X巧光標(biāo)記的引物序列一致。圖1中X 軸代表了 FAM巧光的強(qiáng)度，Y軸代表了皿X巧光的強(qiáng)度，兩個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果靠近X 軸，說(shuō)明僅有FAM巧光被檢出，因此基因型均為AA純合；1-3、1-4兩個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果靠近對(duì) 角線(xiàn)，說(shuō)明FAM和皿X兩種巧光同時(shí)被檢出，因此基因型為AG雜合；1-5、1-6兩個(gè)樣本的檢測(cè) 結(jié)果靠近Y軸，說(shuō)明僅有肥X巧光被檢出，因此基因型均為GG純合。
[0083] 如圖2所示，1-1、1-2兩個(gè)樣本在CYP2C19*2位點(diǎn)處僅檢測(cè)到A等位基因，說(shuō)明兩個(gè) 樣本在CYP2C19*2位點(diǎn)的基因型為AA純合；1-3、1-4兩個(gè)樣本在〔￥口2(：19*2位點(diǎn)處同時(shí)檢測(cè) 至1]八和6兩種等位基因，說(shuō)明兩個(gè)樣本在〔￥口2(：19巧位點(diǎn)的基因型為46雜合；1-5、1-6兩個(gè)樣 本在CYP2C19*2位點(diǎn)處僅檢測(cè)到G等位基因，說(shuō)明兩個(gè)樣本在CYP2C19*2位點(diǎn)的基因型為GG 純合。一代測(cè)序結(jié)果與試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。
[0084] 表2為采用試劑盒中的檢測(cè)基因 CYP2C19*3位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反 向引物對(duì)四個(gè)樣品的基因型結(jié)果。
[0085] 表 2
[0086]
[0087]如圖3所示，在CYP2C19*3位點(diǎn)的巧光定量PCR擴(kuò)增體系中，檢測(cè)A等位基因的特異 性正向引物5'端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中FAM巧光標(biāo)記的引物序列一致，檢巧化等位基因 特異性正向引物5 '端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中皿X巧光標(biāo)記的引物序列一致。圖3中X軸 代表了 FAM巧光的強(qiáng)度，Y軸代表了肥X巧光的強(qiáng)度，2-1和2-2兩個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果靠近對(duì)角線(xiàn) 的位置，說(shuō)明FAM和皿X兩種巧光均被檢出，因此基因型為AG雜合;2-3和2-4兩個(gè)樣本檢測(cè)結(jié) 果靠近Y軸，說(shuō)明只有肥X巧光被檢出，因此基因型為GG純合。
[008引如圖4所示，2-1和2-2兩個(gè)樣本在CYP2C19*3位點(diǎn)處同時(shí)檢測(cè)到A和G兩種等位基 因，所W2-1和2-2兩個(gè)樣本在CYP2C19*3位點(diǎn)的基因型為AG雜合；2-3和2-4兩個(gè)樣本在 CYP2C19*3位點(diǎn)處只檢測(cè)到G等位基因，所W2-3和2-4兩個(gè)樣本在CYP2C19*3位點(diǎn)的基因型 為GG純合。一代測(cè)序結(jié)果與試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。
[0089]綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之±可 W在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可W輕易提出其他的實(shí)施例，但運(yùn)種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，包括2XqPCR 混合反應(yīng)液和檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引物mix和檢測(cè)基因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的引物 mix;所述的檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引物mix含有檢測(cè)該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向 引物及一條反向引物，所述的檢測(cè)基因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的引物mix含有檢測(cè)該SNP位點(diǎn)的 兩條特異性正向引物及一條反向引物;所述檢測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的的兩條特異性正 向引物及一條反向引物序列如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5所示，所述檢測(cè)基 因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒，其特征 在于，所述的2X qPCR混合反應(yīng)液中含PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、兩條分別 用FAM和HEX標(biāo)記的通用熒光探針，所述FAM標(biāo)記的通用熒光探針序列如SEQ ID NO. 1所示， 所述HEX標(biāo)記的通用熒光探針序列如SEQ ID NO.2所示。3. 如權(quán)利要求1所述的用于氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè)方 法，其特征在于，包括以下步驟:提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA，然后分成2個(gè)反應(yīng)管(a、b)進(jìn) 行檢測(cè)，首先在每個(gè)反應(yīng)管中分別加入2X qPCR混合反應(yīng)液，然后在第一反應(yīng)管(a)加入檢 測(cè)基因 CYP2C19*2SNP位點(diǎn)的引物mix;在第二反應(yīng)管(b)加入檢測(cè)基因 CYP2C19*3SNP位點(diǎn)的 引物mix，最后在2個(gè)反應(yīng)管(a、b)中加入待檢測(cè)樣本的基因組DNA，進(jìn)行核酸樣本的熒光定 量PCR擴(kuò)增，在37°C進(jìn)行熒光信號(hào)的掃描，使用LightCycler 480Software release軟件中 的Endpiont Genotyping模塊，根據(jù)兩種焚光信號(hào)的強(qiáng)度及比值對(duì)基因型進(jìn)行自動(dòng)判讀。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因 SNP檢測(cè)的試劑盒的檢測(cè) 方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增程序如下： 預(yù)變性的條件為:溫度為94°C，時(shí)間為15秒； PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成； 第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性:溫度為94 °C，時(shí)間為20秒； 退火+延伸：起始溫度為61°C，每一輪擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減0.5 °C，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束，時(shí) 間為60秒； 第二階段由29輪循環(huán)構(gòu)成，其條件為： 變性:溫度為94 °C，時(shí)間為20秒； 退火+延伸:溫度為55°C，時(shí)間為60秒； 信號(hào)掃描條件為:溫度為3 7 °C，時(shí)間為6 0秒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048076SQ201610700306
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月19日
【發(fā)明人】李同恩, 劉志霈, 王建剛, 孫穎, 朱兵, 王秉孝, 陶然, 王晶晶
【申請(qǐng)人】中源協(xié)和基因科技有限公司