用于純化重組因子Xa衍生物的方法
【專利摘要】本文中公開了用于純化絲氨酸蛋白酶的方法和試劑盒。所述方法需要將所述絲氨酸蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的親和力色譜儀，并且利用包含能破壞所述STI與所述絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑的洗脫緩沖液來洗脫所述絲氨酸蛋白酶。
【專利說明】用于純化重組因子Xa衍生物的方法
[0001] 相關申請的交叉參考 本申請根據35 U.S.C. § 119(e)要求2012年6月14日提交的美國臨時申請序列號 61/659,821的權益，該臨時申請的內容以全文引用的方式并入本公開中。
[0002] 背景 抗凝血劑滿足了市場上在治療或預防傾向于形成血液凝塊的患者（舉例來說，諸如具 有凝血障礙、長期不能移動或正進行醫(yī)療手術的那些患者）的不希望有的血栓形成時的需 求。然而，抗凝療法的主要局限性之一是與治療相關的出血風險，而且在用藥過量的情況下 或在需要進行緊急手術程序時在快速逆轉抗凝血劑活性的能力方面存在諸多局限性。因 而，針對所有抗凝療法形式的特效解毒劑是非常合乎需要的。出于安全考慮，在新型抗凝血 藥的開發(fā)中得到抗凝血劑-解毒劑配對也是有利的。
[0003] 先前報告的因子Xa (fXa)蛋白的經修飾衍生物可用作靶向fXa的抗凝血劑的解 毒劑，諸如美國專利號8, 153, 390和8, 268, 783中所描述的那些。fXa蛋白的經修飾衍生 物能結合和/或基本上中和抗凝血劑。然而，引入至這些fXa衍生物中的某些修飾對純化 提出了若干項挑戰(zhàn)，這是因為用于純化凝結因子的常規(guī)方法不能有效地用于這些經修飾的 fXa蛋白。
[0004] 概要 本文中公開了用于純化絲氨酸蛋白酶的方法和試劑盒。在一些實施方案中，所述方法 需要將絲氨酸蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，諸如樹脂或 柱，并且用洗脫緩沖液來洗脫多肽。在一些實施方案中，所述洗脫緩沖液包含諸如競爭劑等 能破壞STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑。在一些實施方案中，所述洗脫緩沖液 還包含鹽和/或清潔劑。
[0005] 在一個實施方案中，提供了一種純化絲氨酸蛋白酶的方法，該方法包括將絲氨酸 蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，和用包含能破壞STI與絲 氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑的洗脫緩沖液來洗脫絲氨酸蛋白酶。
[0006] 在一些方面，所述洗脫緩沖液還包含鹽、清潔劑和/或離液劑。
[0007] 在一些方面，所述試劑是競爭劑，所述競爭劑可以選自苯甲脒、對氨基苯甲脒、精 氨酸、小分子fXa抑制劑、肽類fXa抑制劑和肽模擬物類fXa抑制劑。在一些方面，所述競 爭劑是精氨酸。
[0008] 在一些方面，絲氨酸蛋白酶是包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的多肽，或與 SEQ ID NO: 1或2具有至少約80%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位點上具 有突變的多肽。
[0009] 在一些方面，絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 2 具有至少約95%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位點上具有突變的多肽。在 一些方面，所述絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
[0010] 在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH值為約4. 5至約10. 5。在一些方面，所述洗脫 緩沖液的pH值為約5. 0。在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH值為約7. 4。
[0011] 在一些方面，所述洗脫緩沖液包含約250 mM精氨酸至約1000 mM精氨酸。在一些 方面，所述洗脫緩沖液包含約500 mM精氨酸。在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH值為約 5. 0〇
[0012] 在一些方面，所述方法進一步包括用離子交換柱對經過洗脫的絲氨酸蛋白酶進行 純化。
[0013] 還提供了利用本公開的方法制備的經過純化的絲氨酸蛋白酶。
[0014] 在一個實施方案中，提供了一種試劑盒，該試劑盒包括基于大豆胰蛋白酶抑制劑 (STI)的親和力色譜儀，和包含能破壞STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的競爭劑的洗 脫緩沖液。
[0015] 在一些方面，所述洗脫緩沖液還包含精氨酸。在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH 值為約4. 5至約10. 5。在一些方面，所述洗脫緩沖液包含約250 mM精氨酸至約1000 mM精 氨酸。在一些方面，所述試劑盒還包含洗滌緩沖液，所述洗滌緩沖液包含約250 mM處于中 性pH值下的NaCl。
[0016] 附圖簡述 圖1示出了在氨基酸106-111處具有連接子-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)的SEQ ID NO: 1，即一種fXa衍生物（也稱為r-解毒劑前體）。
[0017] 圖2示出了從所述r-解毒劑前體去除了所述連接子的SEQ ID NO: 2,即一種fXa 衍生物（也稱為r-解毒劑）。
[0018] 圖3示出了如實施例1中所描述在苯甲脒-瓊脂糖親和樹脂上使用經過純化的 r-解毒劑的負載曲線。
[0019] 圖4示出了如實施例1中所描述在L-賴氨酸-瓊脂糖親和樹脂上使用經過純化 的r-解毒劑的負載曲線。
[0020] 圖5示出了如實施例1中所描述在抑肽酶-瓊脂糖親和樹脂上使用經過純化的 r-解毒劑的負載曲線。
[0021] 圖6示出了如實施例1中所描述在STI-瓊脂糖親和樹脂上使用經過純化的r-解 毒劑的負載曲線。
[0022] 圖7示出了使用從細胞培養(yǎng)物收集的條件培養(yǎng)基（所收集的細胞培養(yǎng)液）時的 STI-瓊脂糖負載曲線，表明功能蛋白被STI樹脂俘獲（如實施例2中所描述）。
[0023] 圖8示出了如實施例2中所描述在HQ-瓊脂糖前置柱上（以流過模式）使用所收 集的細胞培養(yǎng)液的負載曲線。
[0024] 圖9示出了被裝載到STI-瓊脂糖的HQ-瓊脂糖FT級分的負載曲線，其表明功能 蛋白被STI-樹脂俘獲。
[0025] 圖10A-B示出了如實施例2中所描述用I M苯甲脒洗脫結合的蛋白質。將使用1 M苯甲脒的洗脫曲線示于圖IOA中，并且將對經STI洗脫并匯集的級分進行的西方印跡分析 (Western blot)結果示于圖IOB中。分子標記被裝載到圖IOB的第1道和第IA道中；FXa 被裝載到第2道和第2B道中；并且從STI-瓊脂糖柱洗脫的r-解毒劑被裝載到第4道和第 4B道中。
[0026] 圖11示出了如實施例2中所描述在苯甲脒梯度下的洗脫曲線。
[0027] 圖12示出了在實施例2中所描述的按比例放大的程序的洗脫曲線。
[0028] 圖13示出了針對25 L培養(yǎng)基的r-解毒劑純化方案（波狀袋）。UF =超濾；MWCO =分子量截止值；UF/DF =超濾/透濾。
[0029] 圖14繪示了如實施例2中所描述對經過純化的r-解毒劑的SDS-PAGE分析結果。
[0030] 圖15示出了如實施例3中所描述使用精氨酸洗脫緩沖液的STI親和柱的洗脫曲 線。
[0031] 圖16繪示了如實施例3中所描述利用來自于具有不同的STI樹脂（A-E)的各種 STI親和柱的負載洗脫劑的還原銀染凝膠分析結果。利用精氨酸緩沖液洗脫產生了與利用 苯甲脒洗脫類似的產物分布。
[0032] 詳細描述 定義 除非另有指示，否則本公開的實踐將采用屬于本領域技能范圍內的常規(guī)組織培養(yǎng)、免 疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術。參見例如Sambrook等，（1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版；Ausubel 等編，（1987) Current Protocols In Molecular Biology ;MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor編，（1995) PCR 2: A Practical Approach ;Harlow 和 Lane 編，(1988) Antibodies, A Laboratory Manual ;Harlow 和 Lane 編，(1999) Using Antibodies, a Laboratory Manual ;和 R. I. Freshney 編，（1987) Animal Cell Culture。
[0033] 如本文中所使用，術語"約" 一般意指所述值加上或減去該值的10%的范圍。
[0034] 如本說明書和權利要求書中所使用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式"一 (種）"、"一個"和"所述"包括復數個引用對象。
[0035] 術語"蛋白質"、"肽"和"多肽"可互換使用且在其最廣泛意義上是指具有兩個或更 多個亞單位氨基酸、氨基酸類似物或肽模擬物的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在 另一個實施方案中，所述亞單位可通過其它鍵，例如酯、醚等連接。蛋白質或肽必須含有至 少兩個氨基酸，且對蛋白質或肽序列中可包含的氨基酸的最大數目并無限制。如本文中所 使用，術語"氨基酸"是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D與L光 學異構體兩者、氨基酸類似物和肽模擬物。"肽模擬物"是旨在模擬肽的小蛋白質樣鏈。其 可由修飾現有的肽，或通過設計能模擬肽的類似系統（諸如類肽和￠-肽）來制得。
[0036] 如本文中關于諸如DNA或RNA等核酸使用的術語"分離"或"重組"是指與其它DNA 或RNA分離的分子。術語"分離"在本文中還用于指與其它細胞蛋白質分離的多核苷酸、多 肽和蛋白質且意在涵蓋經過純化的和重組的多肽。舉例來說，分離的細胞是與具有不相似 的表型或基因型的組織或細胞分離的細胞。分離的多核苷酸是與其在其原生或天然環(huán)境中 (例如，在染色體上）在正常情況下所締合的3'和5'連續(xù)核苷酸分離。如本領域技術人員 所了解，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要"分離"以將其與其 天然存在的對應物相區(qū)別。
[0037] 術語蛋白質、肽或多核苷酸的"生物學等效物"是指具有至少約80%同源性或序列 同一性，且可選地至少約85%、或可選地至少約90%、或可選地至少約95%、或可選地98%同源 性或序列同一性，并且展現與參考蛋白質、多肽或核酸基本上等同的生物活性的蛋白質、肽 或多核苷酸。
[0038] "雜交"是指可在不同"嚴格度"的條件下進行的雜交反應。增加雜交反應的嚴格 度的條件在本領域中是眾所周知的并且已經公布：參見例如Sambrook等，見下文。相關 條件的例子包括（按照嚴格度增加的順序）：孵育溫度25°C、37°C、50°C和68°C ;緩沖液濃 度 10XSSC、6XSSC、1XSSC、0. IXSSC (其中 SSC 是 0? 15 M NaCl 和 15 mM 檸檬酸鹽緩沖液） 以及其使用其它緩沖液系統的等效物；甲酰胺濃度〇%、25%、50%和75% ;孵育時間5分鐘至 24小時，和持續(xù)時間增加、頻率增加或緩沖液濃度降低的洗滌。
[0039] 與另一個序列具有某一百分比（例如，80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%)的"序列 同一性"的多核苷酸或多核苷酸區(qū)（或多肽或多肽區(qū)）意指在比較兩個序列的過程中，當對 準時，該百分比的堿基（或氨基酸）是相同的。比對和百分比同源性或序列同一性可使用本 領域中已知的軟件程序來測定，例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等編，1987)增刊30,章節(jié)7. 7. 18,表7. 7. I中所描述的軟件程序。優(yōu)選地，使用缺省參數 進行比對。優(yōu)選比對程序是BLAST，使用缺省參數。確切地說，優(yōu)選程序是BLASTN和BLASTP， 使用以下缺省參數：遺傳密碼=標準；過濾器=無；股=兩股；截止值=60 ;期望值=10 ;基 質=BL0SUM62 ;描述=50個序列；排序方式=得分高低；數據庫=非冗余GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 翻譯 + SwissProtein + SPupdate + PIR。這些程序的細節(jié) 可見于以下互聯網地址：ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST。
[0040] "同源性"或"同一性"或"相似性"是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相 似性。同源性可以通過對可能出于比較目的而被對準的各序列中的位置進行比較來確定。 當被比較的序列中的位置被相同堿基或氨基酸占據時，則分子在該位置處是同源的。序列 之間的同源性程度隨所述序列所共有的匹配位置或同源位置的數目而變化。舉例來說，"非 相關"或"非同源"序列與本公開的序列之一共有小于40%的同一'丨生，或可選地小于25%的 同一I"生。
[0041] 術語"級分"當被用于蛋白質分離的情形下時是指基于特定性質分離的材料集合。 所述特定性質可以包括（但不限于）尺寸、質量、等電點、電荷等等。
[0042] "因子Xa"或"fXa"或"fXa蛋白"是指血液凝聚路徑中的絲氨酸蛋白酶，其是由 非活性因子X (fX)產生。因子Xa被因子IXa與其輔因子因子VIIIa的復合物（稱為內在 Xase)或因子Vila與其輔因子組織因子的復合物（稱為外在Xase)激活。fXa與因子Va 形成膜結合凝血酶原酶復合物，并且是凝血酶原酶復合物中能催化凝血酶原轉化成凝血酶 的活性組分。凝血酶是能催化纖維蛋白原轉化成纖維蛋白的酶，其最終導致血液凝塊形成。
[0043] 如本文中所使用，"fXa衍生物"是指在組裝至凝血酶原酶復合物中的方面不與fXa 競爭，但結合和/或基本上中和諸如fXa抑制劑等抗凝血劑的經過修飾的fXa蛋白。在一 些實施方案中，fXa衍生物具有降低的促凝血活性或不具有促凝血活性。fXa衍生物的一個 例子在本文中被提供為SEQ ID NO: 2 (圖2)或其生物等效形式。
[0044] 術語"活性位點"是指酶或抗體中發(fā)生化學反應的部分。"經過修飾的活性位點"是 在結構上經過修飾以提供具有增加或降低的化學反應性或特異性的活性位點的活性位點。 活性位點的例子包括但不限于人類因子X的包含235-488個氨基酸殘基的催化域和人類因 子Xa的包含fXa的195-448個氨基酸殘基的催化域。經過修飾的活性位點的例子包括但 不限于人類因子Xa的在位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414或Arg424處具有至 少一個氨基酸取代的催化域。
[0045] 如上文所述，本發(fā)明的衍生物可具有經過修飾的Gla域或被去除了整個Gla域。 fXa的Gla域是指野生型fXa蛋白的氨基酸殘基1-45。在一些實施方案中，所述衍生物完 全（1-45)或部分缺失Gla域（例如1-44、1-39或6-39)。
[0046] "r-解毒劑前體"是指由SEQ ID NO: 1表示的fXa衍生物，其相對于人類野生型 fXa含有三個突變。第一個突變是缺失野生型fX蛋白在位置6-39處的Gla域。第二個突 變是用-RKR-置換活化肽序列氨基酸143-194。這就產生了連接輕鏈和重鏈的-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)連接子。在分泌后，這個連接子在CHO中被裂解，產生裂解的雙鏈多肽。術 語"裂解的雙鏈多肽"是指SEQ ID NO: 2的多肽，或與SEQ ID NO: 2具有80%同一性、具 有兩條鏈并且通過二硫鍵連接在一起的多肽。N末端鏈由SEQ ID NO: 2的氨基酸1-105組 成，且C末端鏈由SEQ ID NO: 2的氨基酸106-359組成。任選地，LC鏈可含有所述連接子 的1、2、3、4、5或6個氨基酸殘基。這樣的附加殘基由不完全去除連接子多肽產生。第三個 突變是活性位點殘基S379突變成Ala殘基（氨基酸編號是基于分泌的人類fX序列）。這 個氨基酸取代分別對應于SEQ ID NO: 1和2的氨基酸296和290。
[0047] 術語"r-解毒劑"可以是指去除所述連接子之前的多肽（SEQ ID NO: 1)或去除連 接子之后的多肽（SEQ ID NO: 2)。以全文引用的方式并入本文中的美國申請13/766, 652 描述了用于對單鏈r-解毒劑前體進行改良型或增強型加工以使充當針對fXa抑制劑的解 毒劑的雙鏈r-解毒劑蛋白裂解的方法和細胞。
[0048] "STI"或"大豆胰蛋白酶抑制劑"是指從大豆分離的胰蛋白酶抑制劑或其生物等效 物。胰蛋白酶抑制劑的大小為約20 kDa，并且能降低胰蛋白酶（一種蛋白水解酶）以及血漿 激肽釋放酶、因子Xa和纖溶酶活性。STI可購自諸如Life Technologies (Grand Island, NY)等供應商。STI的一個例子是得自于毛豆（大豆）的GenBank登錄號為NP_001238611 的KTI3 Kunitz胰蛋白酶抑制劑。
[0049] 術語"競爭劑"是可通過破環(huán)STI與絲氨酸蛋白酶之間的電荷-電荷相互作用或 通過與STI競爭結合于絲氨酸蛋白酶來幫助從STI親和柱洗脫絲氨酸蛋白酶的分子。非限 制性例子包括苯甲脒、對氨基苯甲脒、精氨酸、小分子fXa抑制劑、肽類fXa抑制劑和肽模擬 物類fXa抑制劑。
[0050] 術語"因子Xa抑制劑"或"因子Xa的抑制劑"是指能在體外和/或體內直接或 間接地抑制凝血因子Xa催化凝血酶原轉化成凝血酶的活性的化合物、肽、肽模擬物。已知 fXa抑制劑的例子包括但不限于磺達肝癸（fondaparinux)、艾卓肝素（idraparinux)、經過 生物素標記的艾卓肝素、依諾肝素（enoxaparin)、法安明（fragmin)、NAP-5、rNAPc2、組織 因子路徑抑制劑、DX_9065a (例如，如 Herbert, J.M.等，//7Aazmaco/ /-- 1996 276 (3) :1030-8 中所描述）、YM-60828 (例如，如Taniuchi, Y?等，VaewoW. 1998 79(3):543-8 中所描述）、YM-150 (例如，如 Eriksson, B.I?等，財 oot/ 2005;106(11)， Abstract 1865 中所描述）、阿哌沙班（apixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)、^)-348292 (例如，如Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007 中所描述）、奧米沙班（otamixaban)、雷扎沙班（razaxaban) (DPC906)、BAY 59-7939 (例如，如 Turpie, A. G?等，7； ?你 ewost 2005，3 (11) :2479-86 中所 描述）、DU-176b (例如，如 Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9) :778-783 中所 描述）、LY517717 (例如，如 Agnelli, G?等，7； VaewoW. 2007 5(4):746-53 中所描述）、GSK913893、貝曲西班（betrixaban)(如下文所描述）以及其衍生物。低分子 量肝素（"LMWH"）也被視為因子Xa抑制劑。
[0051] 術語"離液劑"意指能破壞諸如蛋白質和核酸等大分子的結構并且使其變性的物 質。離液劑包括例如丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸鋰、氯化鎂、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸鈉、硫 脲和尿素。
[0052] 方法 本公開描述了用于對來自于含絲氨酸蛋白酶的樣品的呈活性形式的絲氨酸蛋白酶進 行純化的方法。這些方法優(yōu)于常規(guī)的絲氨酸蛋白酶純化方法。此外,所述方法在對甚至經 過修飾的絲氨酸蛋白酶進行純化時也是有效的，所述修飾，諸如與野生型fXa相比在r-解 毒劑中的那些修飾，能影響蛋白酶的結合和/或酶促活性。
[0053] 已經證明，因子Xa和其它絲氨酸蛋白酶可使用苯甲脒-瓊脂糖親和色譜儀進行純 化。初步測試（參見例如實施例1)指示，缺乏Gla域的某些fXa衍生物由于缺失Gla域而 對諸如Q-瓊脂糖等常規(guī)離子交換色譜儀具有低親和力。令人驚訝的是，r-解毒劑不能結 合于苯甲脒-瓊脂糖親和色譜儀，或其它類似的市售小配體親和色譜儀。本公開描述了使 用基于STI的親和色譜儀純化絲氨酸蛋白酶，和利用競爭劑和任選地存在的鹽和清潔劑的 洗脫步驟。
[0054] 可以如先前所描述（例如在13/766, 652中）或利用本領域中已知的其它重組蛋 白質產生方法來重組產生絲氨酸蛋白酶。舉例來說，可將蛋白質克隆到DNA構筑體（即質 粒、病毒載體、粘粒、表達載體、噬菌粒、福斯質粒和人工染色體，諸如細菌人工染色體、酵母 人工染色體和人類人工染色體）中，并且通過諸如基于化學的轉染（諸如磷酸鈣轉染和 多聚轉染）和非基于化學的轉染（諸如電穿孔、光學轉染和基因電轉移）等基因轉移技術 引入合適的宿主細胞中。合適的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞，包括但不限于細菌 細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、綿羊細胞、猿細 胞和人類細胞。接著可通過諸如超聲處理或凍融等物理技術或通過使用諸如含有150 mM NaCl、1.0% IGEPAL? CA - 630、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS 和 50 mM Tris 的 RIPA 緩沖液 (Radi-免疫沉淀測定）（pH 8. 0)等清潔劑或溶解緩沖液，或通過物理分離（諸如離心或過 濾）來溶解細胞，以便從哺乳動物細胞培養(yǎng)物中收集澄清培養(yǎng)液。然后可將所得可溶性蛋 白質提取物用于本文中所描述的純化方法中。
[0055] 將蛋白質提取物施加于基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和色譜儀。大豆胰 蛋白酶抑制劑是20 kDa蛋白質，并且可以被固定在固體載體樹脂上以用于純化某些蛋白 質。除了大豆胰蛋白酶抑制劑以外，還可以使用其它胰蛋白酶抑制劑蛋白質，諸如從血清、 利馬豆、牛胰腺或卵類粘蛋白或其經修飾形式中分離的那些胰蛋白酶抑制劑蛋白質。還預 期某些蛋白酶抑制劑，確切地說是絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以用于制備親和樹脂，以便純化 r_解毒劑、絲氨酸蛋白酶或其它因子Xa衍生物。可以利用本文中所公開的方法從這些蛋白 酶抑制劑中鑒別出合適的。
[0056] 然后可以用包含競爭劑、鹽、清潔劑或離液劑的洗脫緩沖液來洗脫絲氨酸蛋白 酶。競爭劑中斷STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用或通過與STI競爭結合于絲氨酸蛋 白酶來實現。競爭劑的非限制性例子包括苯甲脒、精氨酸、小分子fXa抑制劑、肽類fXa 抑制劑或肽模擬物類fXa抑制劑。直接因子Xa抑制劑包括NAP-5、rNAPc2、組織因子路 徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292、奧米 沙班、依杜沙班（edoxaban)、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、貝曲西班或其藥學上可接 受的鹽以及其組合。肽類fXa抑制劑包括如Betz等，"Inhibition of Factor Xa by a Peptidyl-a-ketothiazole Involves Two Steps. Evidence for a Stabilizing Conformational Change"，Biochemistry (1999)，38，14582-14591 中所描述的三膚酮 噻唑和相應的醛，該文獻出于所有目的以引用的方式并入。
[0057] 在一個實施方案中，競爭劑是精氨酸。用精氨酸洗脫是有利的，因為它是GRAS ( - 般認為是安全的）賦形劑，并且不需要從經過純化的蛋白質中去除。精氨酸的另一個益處 是它實際上提高了絲氨酸蛋白酶（例如，r-解毒劑）的溶解度，并且可以被用作最終制劑 中的賦形劑。
[0058] 洗脫緩沖液中所采用的精氨酸或競爭劑的濃度可為約250 mM至約1000 mM。在一 個實施方案中，洗脫緩沖液中的精氨酸或競爭劑的濃度為約500 mM。在其它實施方案中， 所述濃度為約250 mM、或約300 mM、或約350 mM、或約400 mM、或約450 mM、或約550 mM、 或約600 mM、或約650 mM、或約700 mM、或約750 mM、或約800 mM、或約850 mM、或約900 mM、或約I M。所述洗脫緩沖液任選地還包含鹽、清潔劑或離液劑?？捎糜诒疚闹兴_的 方法和試劑盒的洗脫緩沖液中的鹽包括氯化鈉、氯化銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、氯化鉀、氯化 鎂、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鈣、磷酸銨、磷酸鎂、磷酸鉀、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸 鈣等等。可用于本文中所公開的方法和試劑盒的洗脫緩沖液中的清潔劑包括例如聚山梨醇 醋80、尿素、狐等等。
[0059] 本文中所描述的方法和試劑盒中的洗脫緩沖液的pH值是允許有效洗脫吸附在樹 脂上的絲氨酸蛋白酶蛋白而不造成絲氨酸蛋白酶失活和/或沉淀的pH值。某些fXa衍生 物，諸如r-解毒劑，在低pH值下會失活或沉淀。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的pH值為 約4. 5至約10. 5。在另一個實施方案中，洗脫緩沖液的pH值為約pH 5.0。在另一個實施方 案中，洗脫緩沖液的pH值為約pH 7.4。可選地，洗脫緩沖液的pH值為至少約4. 5、約5. 5、 約6、約6. 5、約7、約7. 5、約8. 0、約8. 5、約9、約9. 5或至少約10。在另一個實施方案中， 洗脫緩沖液的pH值不高于約5. 5、約6、約6. 5、約7、約7. 5、約8. 0、約8. 5、約9、約9. 5、約 10或不高于約10. 5。在一個實施方案中，洗脫緩沖液的pH值當使用苯甲脒作為競爭劑時 為約7. 4且當使用精氨酸作為競爭劑時為pH 5. 0。
[0060] 在某些實施方案中，絲氨酸蛋白酶是fXa衍生物，舉例來說，其為包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的多肽，或與SEQ ID NO: 1或2具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或 99%序列同一性的多肽。在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1或2具有序列同一性的多肽 具有基本上與SEQ ID NO: 1或2相同的活性。由SEQ ID NO: 1表示的fXa衍生物相對 于fXa含有三個突變。第一個突變是缺失野生型蛋白質中FX在位置6-39處的Gla域。第 二個突變用-RKR-置換活化肽序列143-194 aa。這就產生了連接輕鏈和重鏈的-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)連接子。在分泌后，這個連接子在CHO中被裂解，產生雙鏈fXa分子（SEQ ID NO: 2)。第三個突變是活性位點殘基S379突變成Ala殘基（基于分泌的人類fX氨基 酸序列）。這個氨基酸取代分別對應于SEQ ID NO: 1和2的位置296和位置290處的氨基 酸。fXa衍生物在組裝至凝血酶原酶復合物中的方面不與fXa競爭，而是結合和/或基本上 中和諸如fXa抑制劑等抗凝血劑?？捎米鹘舛緞┑难苌锝涍^修飾以減少或去除內在促凝 血和抗凝血活性，同時保留結合抑制劑的能力。在結構上，所述衍生物經過修飾以便無促凝 血活性或降低促凝血活性。"促凝血活性"在本文中稱為藥劑引起血液凝固或形成凝塊的能 力。降低的促凝血活性意指促凝血活性與野生型fXa相比降低了至少約50%或約90%以上 或約95%以上。在一個相關實施方案中，與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基 酸序列與野生型因子Xa相比具有降低的促凝血活性。在另一個實施方案中，與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列不組裝至凝血酶原酶復合物中。
[0061] 在一個實施方案中，可以在允許絲氨酸蛋白酶吸附至柱上的條件下將絲氨酸蛋白 酶添加（裝載）至柱上，并且可以用允許絲氨酸蛋白酶繼續(xù)吸附至柱上且污染流經物中的 蛋白質或分子的洗滌緩沖液對柱進行洗滌。在一個實施方案中，洗滌緩沖液可以包含鹽并 且處于中性pH值下。術語"中性pH值"意在指約6至約8的pH值。在某些實施方案中， 洗滌緩沖液包含約200至約500 mM處于中性pH值下的NaCl。在其它實施方案中，pH值為 約6或約7或約8。
[0062] 本文中所公開的方法還可以包括其它純化和色譜步驟，舉例來說，諸如過濾、離子 交換色譜、混合模式樹脂、排阻色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、親和色譜法或等電點聚焦。在 一個實施方案中，所述方法還包括將含有所述多肽的溶液施加于離子交換柱。
[0063] 合適的陽離子交換樹脂包括本領域中已知的多種材料，包括能夠在較寬pH值范 圍內結合多肽的那些材料。舉例來說，羧甲基化的、磺化的、瓊脂糖基的或聚合的聚苯乙烯/ 二乙烯基苯陽離子交換基質是特別優(yōu)選的。其它可用基質材料包括但不限于纖維素基質， 諸如纖維狀、微粒狀和珠粒狀基質；右旋糖酐、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅和 聚醚基質；和復合物。其它適合用于陽離子交換色譜的材料在本領域技術人員的知識范圍 內。
[0064] 陰離子交換色譜是使用如本領域中已知的對其適當的介質來進行。合適的介質 包括例如聚合的聚苯乙烯/二乙烯基苯樹脂和瓊脂糖基的樹脂，以及瓊脂糖珠粒、右旋糖 酐珠粒、聚苯乙烯珠粒、包含經衍生化而具有叔氨基或季氨基的不溶性顆粒狀載體和經 衍生化而具有三甲基氨基乙基的載體的介質。合適的這樣的介質的例子包括DE92 (二 乙基氛基乙基纖維素，Whatman) ;DEAE 纖維素（Sigma)、BAKERB0ND ABX 40 mu (J. T. Baker, Inc.) ;DEAE 樹脂，諸如 FRACTOGEL EMD DEAE-650 (EM Separations)、FRACT0GEL EMDTMAE-650 (S)TM (EM Science， Gibbstown，NJ)、 TSK 凝膠 DEAE-SPW (Tosohaas)、 DEAE-SEPHAROSE CL-6BT" 和螯合 SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech AB)、DEAE MERE SEP. I000TM ( Millipore)和 DEAE SPHERODEX (S印racor) !RESOURCE QTm 和 Q SEPHAROSE (QSFF) (Amersham Pharmacia Biotech AB) ；MACR〇-PEP QTM (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA) ；Q-HYPERD (BioSepra, Inc. ,Marlborough,Mass);等等。其 它合適的陰離子交換色譜材料以及用于本申請的這些材料的選擇和使用在本領域中是常 規(guī)的。
[0065] 可以在STI親和色譜法之前或之后進行離子交換色譜、過濾、納米過濾或附加純 化步驟。附加步驟還可以包括通過例如對蛋白質提取物進行溶劑和清潔劑處理或通過納米 過濾進行病毒滅活步驟。
[0066] 一般來說，"純化"是指增加蛋白質或肽在樣品中的濃度和/或純度。在一些實施 方案中，純化過程對樣品進行分餾以去除各種其它組分，在此期間蛋白質或肽基本上保持 其生物活性。組合物中經過充分純化的蛋白質或肽形成了該組合物的主要組分，諸如構成 樣品溶液的干組分中的蛋白質的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約 90%、至少約95%或以上。
[0067] 本領域技術人員根據本公開將會獲知用于對蛋白質或肽的純化程度進行定量的 各種方法。這些方法包括例如測定活性級分的比活性或通過SDS/PAGE分析來估計級分內 的多肽的量。用于估計級分的純度的一種優(yōu)選方法是計算該級分的比活性，將它與初步提 取物的比活性相比較并且由此計算純度程度，在本文中通過"純化倍數"來估計。用于表示 活性的量的實際單位當然將取決于用于追蹤純化和所表達的蛋白質或肽是否展現可檢測 活性的所選特定測定技術。
[0068] 適用于蛋白質純化的各種技術對于本領域技術人員將為熟知的。這些技術包括例 如與硫酸銨、PEG (聚乙二醇）、抗體等等一起沉淀或利用熱變性，隨后離心；色譜步驟，諸 如離子交換、凝膠過濾、逆相、羥基磷灰石和親和色譜；等電點聚焦；凝膠電泳；和這些與其 它技術的組合。
[0069] 本文中所公開的另一個方面涉及一種經過純化的絲氨酸蛋白酶，其包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1或2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、 至少約95%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列同一性的多肽，其中所述多肽是通過 本文中所描述的方法產生。在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1或2具有序列同一'丨生的多 肽具有基本上與SEQ ID NO: 1或2相同的活性。
[0070] 本申請還描述了一種試劑盒，其包含大豆胰蛋白酶抑制劑親和樹脂；包含競爭劑 和/或精氨酸的洗脫緩沖液；和使用說明。在一個實施方案中，所述試劑盒還包含洗滌緩沖 液。在一個相關實施方案中，所述洗滌緩沖液包含約250 mM處于中性pH值下的NaCl。
[0071] 實驗實施例 參考以下實施例進一步了解本公開，所述實施例意在單純地例示本公開。本公開在范 圍方面不受所例示的實施方案限制，所述實施方案僅意在說明本公開的單一方面。功能上 等效的任何方法都在本公開的范圍之內。根據以上描述和附圖，除了本文中所描述以外對 本公開的各種修改將變得為本領域技術人員所顯而易見。所述修改屬于所附權利要求書的 范圍內。
[0072] 除非另有說明，否則所有溫度都是以攝氏度表示。還有，在這些實施例和其它部分 中，縮寫具有以下含義：
【權利要求】
1. 一種純化絲氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括： 將所述絲氨酸蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，和 利用包含能破壞所述STI與所述絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑的洗脫緩沖液 來洗脫所述絲氨酸蛋白酶。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述洗脫緩沖液還包含鹽、清潔劑和/或離液劑。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中所述藥劑是能競爭性地結合所述絲氨酸蛋白酶 的STI的競爭劑。
4. 如權利要求3所述的方法，其中所述競爭劑選自苯甲脒、對氨基苯甲脒、精氨酸、小 分子fXa抑制劑、肽類fXa抑制劑和肽模擬物類fXa抑制劑。
5. 如權利要求4所述的方法，其中所述競爭劑是精氨酸。
6. 如權利要求1所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶是包含SEQIDNO: 1或2的氨 基酸序列的多肽，或與SEQIDNO: 1或2具有至少約80%序列同一性、缺失至少一部分Gla 域且在活性位點上具有突變的多肽。
7. 如權利要求6所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶包含SEQIDNO: 2的氨基酸序 列，或與SEQIDNO: 2具有至少約95%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位點 上具有突變的多肽。
8. 如權利要求6所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶包含SEQIDNO: 2的氨基酸序 列。
9. 如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約4. 5至約 10. 5。
10. 如權利要求9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約5. 0。
11. 如權利要求9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約7. 4。
12. 如權利要求5所述的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約250mM精氨酸至約1000mM 精氨酸。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約500mM精氨酸。
14. 如權利要求13所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約5. 0。
15. 如權利要求1至14中任一項所述的方法，其還包括利用離子交換柱對所述經過洗 脫的絲氨酸蛋白酶進行純化。
16. 如權利要求1至15中任一項所述的方法，其還包括在洗脫所述絲氨酸蛋白酶之前， 用包含鹽且處于中性pH值下的洗滌緩沖液來洗滌所述色譜儀。
17. -種經過純化的絲氨酸蛋白酶，其是由如權利要求1至16中任一項所述的方法制 備。
18. -種試劑盒，其包括： 基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，和 包含能破壞所述STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的競爭劑的洗脫緩沖液。
19. 如權利要求18所述的試劑盒，其中所述洗脫緩沖液還包含精氨酸。
20. 如權利要求18所述的試劑盒，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約4. 5至約10. 5。
21. 如權利要求19所述的試劑盒，其中所述洗脫緩沖液包含約250mM精氨酸至約1000 mM精氨酸。
22.如權利要求18至21中任一項所述的試劑盒，其還包含洗滌緩沖液，所述洗滌緩沖 液包含處于中性pH值下的約250mMNaCl。
【文檔編號】C07K1/22GK104379594SQ201380033420
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年6月12日 優(yōu)先權日:2012年6月14日
【發(fā)明者】盧根民, 烏馬·辛哈 申請人:博爾托拉制藥公司