專利名稱：人重組組織因子的構(gòu)建表達、純化方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人重組組織因子，特別是人重組組織因子的構(gòu)建表達和純化方法。本發(fā)明還涉及該人重組組織因子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
20世紀初期，Schmid與Moranitz首次發(fā)現(xiàn)了組織中血液凝固的啟動因子，并將其命名為組織因子(Tissue factor，TF)。到20世紀80年代，組織因子被證實是生理性凝血過程中最重要的啟動因子。人們借助重組DNA、人工致突變及基因剔除等現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，進一步在分子水平和基因水平研究TF，發(fā)現(xiàn)TF與全身炎癥反應(yīng)綜合癥及休克、DIC、血栓性疾病、移植排斥反應(yīng)、惡性腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，近年來又研究發(fā)現(xiàn)TF還具有參與愈傷組織修復、新生血管形成及胚胎發(fā)育等多種生理功能。因此，組織因子在生物制藥領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用發(fā)展前景。
目前，國內(nèi)外組織因子的研究主要集中在與組織因子有關(guān)的生物技術(shù)新藥的研究開發(fā)和凝血酶原時間檢測試劑的研制方面。
在生物制藥產(chǎn)業(yè)上，組織因子的研究主要集中在抗凝藥、心血管病方面的藥物上，如研究開發(fā)的組織因子單克隆抗體、TFPI(TF pathway inhibitor)、失活的因子VIIa、rNAPc2、抗TF或VIIai的小分子化合物、靶向免疫絡(luò)合物等。
組織因子是凝血酶原時間(Prothrombin time，PT)檢測試劑的主要活性成分，是影響凝血酶原時間測定的主要因素，高質(zhì)量的組織因子能夠敏感地反應(yīng)出凝血因子的異常與否。凝血酶原時間測定是血液臨床檢驗的常規(guī)項目，用于檢測病人凝血機制是否正常，特別是心胸外科、骨科、婦產(chǎn)科等手術(shù)前檢查病人的凝血功能，同時也是口服抗凝藥物治療監(jiān)控的重要實驗室指標，凝血酶原時間的延長和縮短與肝病、腫瘤、炎癥、糖尿病、心臟病、血液病、高血壓、高血脂等多種疾病有密切關(guān)系。
長期以來，凝血酶原時間測定試劑的制備都是由從兔腦、牛腦、人腦、胎盤等組織中提取組織因子配制而成，如美國DadeBehring公司生產(chǎn)的胎盤凝血活酶、法國Diagnostia Stago公司生產(chǎn)的兔腦凝血活酶、我國陜西方舟公司生產(chǎn)的兔腦凝血活酶、上海太陽公司用兔腦制備的含鈣凍干組織凝血活酶等。由于這些組織提取物所含的組織因子的濃度不同，尤其是不同種屬來源組織中的組織因子對凝血的反應(yīng)敏感度不同，所以用其生產(chǎn)的凝血酶原時間測定試劑普遍存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，敏感性差，檢測結(jié)果不穩(wěn)定的問題，不同的臨床檢驗實驗室之間得到的檢測結(jié)果難以比較。盡管采用了WHO的標準參照品，但仍然不能把誤差降低到可接受的水平。
近年來，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)克隆出組織因子的基因，清楚了它的結(jié)構(gòu)，并采用基因工程技術(shù)合成了重組組織因子。目前，國外有少數(shù)幾家公司(如DadeBehring公司)已經(jīng)利用兔重組組織因子或人重組組織因子開發(fā)出了新型的凝血酶原時間測定試劑。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，由于重組組織因子分子結(jié)構(gòu)均一、質(zhì)量穩(wěn)定，且對凝血因子具有極高的敏感性，使用重組組織因子制成的凝血酶原時間測定試劑提高了PT測定的敏感性、精密度和準確度，在臨床醫(yī)學檢驗上被認為是新一代的標準化凝血酶原時間測定試劑。使用重組組織因子生產(chǎn)的凝血酶原時間測定試劑，已成為相關(guān)研究人員的共識和各級醫(yī)院的首選。
人組織因子是分子量為47KD的糖蛋白，含有263個氨基酸殘基，為跨膜受體蛋白質(zhì)。TF是凝血因子Ⅶ的受體和輔助因子，是外源凝血途徑的啟動蛋白。TF蛋白分子分為3個部分，胞內(nèi)區(qū)21個氨基酸殘基，跨膜部分為23個氨基酸殘基，具有疏水性，膜外部分含219個氨基酸殘基，為氨基端，帶有糖鏈。研究證實，缺失胞內(nèi)區(qū)的截斷型人組織因子(TF243，由跨膜部分和膜外部分組成)具有全部的凝血活性。
國外利用人重組組織因子制備凝血酶原時間測定試劑的文獻以及專利報道基本上集中在了組織因子制備凝血酶原時間測定試劑的脂化、緩沖液組成、穩(wěn)定劑的加入等工藝上。復旦大學的發(fā)明專利申請“重組可溶性組織因子及其制備方法和應(yīng)用”提供了一種含有部分天然TF的氨基酸序列(1～218)及具有啟動外源性凝血活性的重組可溶性組織因子r-sTF。其r-sTF的一種具體制備方法是從胎盤組織中提取總RNA，運用RT-PCR、質(zhì)粒重組和大腸桿菌的陽性克隆篩選，獲得sTF基因片段，進一步構(gòu)建表達質(zhì)粒r-sTF-pLY-4，并導入大腸桿菌JF1125中表達；然后經(jīng)過離心收集菌體，菌體破碎，包涵體溶解，復性和Q-Sepharose F.F.層析純化等步驟，最終得到r-sTF。上述得到的r-sTF經(jīng)磷脂化處理后，可用于制備凝血酶原時間檢測試劑。
在復旦大學的發(fā)明專利申請中，獲得的r-sTF只是TF的胞外部分，與天然全長型TF或TF243截斷型(含有跨膜結(jié)構(gòu))相比，其生物活性較低。此外，r-sTF在大腸桿菌的表達方式是通過提高發(fā)酵溫度誘導表達形成包涵體沉淀物，而較高的培養(yǎng)溫度常常會降低可溶性蛋白的表達水平，同時包涵體沉淀物需要經(jīng)過蛋白質(zhì)變性及復性才能得到有活性的TF樣品，因此，r-sTF的純化過程繁瑣，TF結(jié)構(gòu)和活性的均一性較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的人重組組織因子以及構(gòu)建、表達和純化該重組組織因子的方法。
本發(fā)明的目的還在于應(yīng)用該重組組織因子，制備高穩(wěn)定性和高敏感性的凝血酶原時間測定試劑盒。
本發(fā)明構(gòu)建的人重組組織因子recombinant human tissue factor簡稱rhTF243，其核苷酸序列和氨基酸序列見圖1，為由膜外區(qū)和跨膜區(qū)兩部分組成，缺失胞內(nèi)區(qū)的截斷型人重組組織因子，即TF的1～243氨基酸序列部分，具有和組織因子同樣活性的蛋白。
本發(fā)明從人胎盤組織中獲取總RNA，根據(jù)已知的TF核苷酸序列，設(shè)計PCR引物，并加入酶切位點；以總RNA為模板，通過RT-PCR方法得到目的基因片段；將收集的TF基因片段與phoA質(zhì)粒(由美國血液技術(shù)公司焦進安博士提供)重組，構(gòu)建出TF表達質(zhì)粒載體pTF243。圖2所示為TF表達質(zhì)粒載體pTF243的物理圖譜。
進而將TF表達質(zhì)粒載體pTF243轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中，用添加0.01％氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶酶切分析基因片段，篩選確認陽性克隆，得到高效表達的基因重組工程菌株。
取篩選得到的基因重組工程菌株接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃～37℃和pH6.0～7.2條件下直接發(fā)酵培養(yǎng)表達，得到含有rhTF243的發(fā)酵培養(yǎng)菌液。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基是以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2％～5％的葡萄糖、1％～5％無機鹽溶液和0.01％～0.05％氨芐青霉素后組成的。
其中的無機鹽溶液由0.1％～0.5％磷酸二氫鈉、0.5％～1.0％磷酸氫二鉀、0.01％～0.05％氯化鐵、0.01％～0.03％硫酸鋅、0.01％～0.03％氯化鈷、0.01％～0.03％硫酸銅、0.5％～1.0％硫酸銨和0.05％～0.10％硫酸鎂組成。
本發(fā)明中，rhTF243在大腸桿菌MM294中的表達是由phoA啟動子控制的，而phoA啟動子的抑制與激活又受到發(fā)酵培養(yǎng)液中無機磷濃度的控制，當無機磷濃度低于0.1mmol/L時，rhTF243蛋白被誘導表達。
當大腸桿菌在含無機磷濃度高的培養(yǎng)液里生長時，phoA啟動子受到抑制，不能進行rhTF243的表達，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，隨著大腸桿菌的生長，無機磷逐漸消耗，當無機磷濃度降低到一定水平(低于0.1mmol/L)時，phoA啟動子受到激活，從而誘導rhTF243開始表達。表1、表2列出了不同時間和不同無機磷濃度下的rhTF243表達情況(活性以凝血酶原時間表示，凝血酶原時間長，活性較低，凝血酶原時間短，活性較高)。
表1 不同無機磷濃度下rhTF243的表達活性

表2 發(fā)酵過程中rhTF243活性的表達

本發(fā)明rhTF243的純化方法是，取發(fā)酵培養(yǎng)菌液溶于Tris-EDTA緩沖液中，用高壓勻漿機高壓破碎，釋放出rhTF243蛋白；先使用Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)對破碎液進行離子交換層析，得到rhTF243蛋白的粗提液；再將粗提液通過TF單抗免疫親和層析柱進行吸附和洗脫后，收集得到純度95％以上的rhTF243蛋白。
TF單抗免疫親和層析柱的具體吸附和洗脫方法為依次用pH8.0的Tris-HCl緩沖液、pH6.0的磷酸鹽緩沖液和pH4.0的醋酸鈉緩沖液洗滌，然后用pH3.0的醋酸緩沖液洗脫rhTF243蛋白，并收集。
本發(fā)明使用的TF單抗免疫親和層析柱是由TF單克隆抗體與Amersham公司的CNBr-actvated Sepharose Fast Flow偶聯(lián)后制備得到的，其中的TF單克隆抗體由美國血液技術(shù)公司焦進安博士提供。本發(fā)明制備得到的TF單克隆抗體具有很強的專一性，可以重復多次使用。
通過使用紫外分光光度計測定在280nm波長下的吸光度值A(chǔ)280和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法鑒定洗脫后的rhTF243蛋白純度。
本發(fā)明制備得到的rhTF243蛋白主要應(yīng)用于制備凝血酶原時間檢測試劑。
在鈣和磷脂存在條件下，TF具有引起血漿凝固的功能，TF的血漿凝固功能是通過測定凝血時間進行的。
在進行PT測定時，TF、CaCl2和磷脂混合在一起組成PT試劑。本發(fā)明制備凝血酶原時間檢測試劑的具體方法是在37℃條件下將純化的rhTF243蛋白加入溶解有磷脂的100mmol/L Tris緩沖液(pH7.5，含有100mmol/L CHAPS)中得到rhTF243磷脂液，再將rhTF243磷脂液與由100mmol/L HEPES、10mmol/LCaCl2、1mg/mL BSA組成的緩沖液(pH7.0)混合后，得到PT檢測試劑。
其中的磷脂是由Sigma公司提供的PC(產(chǎn)品號P6354)與PS(產(chǎn)品號P7769)混合組成。
本發(fā)明運用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，構(gòu)建了新型的人重組組織因子的表達載體pTF243，改進了TF的表達機理，使其能夠在大腸桿菌MM294的發(fā)酵中，隨著培養(yǎng)基中無機磷的逐漸消耗而直接表達，不再需要增加誘導物和(或)改變發(fā)酵條件進行誘導外源蛋白的表達，簡化了發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，有效地提高了rhTF243蛋白的表達率，也不需要對蛋白質(zhì)進行變性和復性；同時在rhTF243蛋白的純化工藝中，采用了TF單抗免疫親和層析技術(shù)，依據(jù)人重組組織因子與TF單抗免疫親和層析柱上的抗體特異性結(jié)合，經(jīng)過洗滌、洗脫得到純化的重組組織因子蛋白，由于人重組組織因子與TF單克隆抗體之間結(jié)合的特異性和溫和性，人重組組織因子在純化過程中沒有受到不可逆的損傷，因此獲得了高純度和高活性的rhTF243。純化的rhTF243純度95％以上，收率大于60％。
使用本發(fā)明純化的rhTF243蛋白制備得到的PT試劑，穩(wěn)定性和敏感性均得到了提高，PT測定時間10s～14s，ISI值1.0±0.2。


圖1為人重組組織因子rhTF243的DNA序列和氨基酸序列；圖2為TF表達質(zhì)粒載體pTF243的物理圖譜；圖3為純化rhTF243蛋白的紫外分光光度圖；
圖4為純化rhTF243蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
具體實施例方式
實施例1rhTF243表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建從人胎盤組織中獲取總RNA，根據(jù)已知的TF核苷酸序列，設(shè)計PCR上游引物P1和下游引物P2。
上游引物P15’-ACCAGCCATGGCTCAGGCACTACAAATACTGTGGC-3’下游引物P25’-GGATCCTCAGTGTAGAGATATAGCCAGGATG-3’P1引物含有數(shù)個TF蛋白N端氨基酸及NcoI酶切位點，P2引物含有數(shù)個TF蛋白C端氨基酸、終止碼及BamHI酶切位點。
以總RNA為模板，P1、P2為引物，通過常規(guī)RT-PCR方法得到TF目的基因片段；將收集的rhTF243基因片段用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI處理，與phoA質(zhì)粒重組，構(gòu)建TF表達質(zhì)粒載體pTF243。
將TF表達質(zhì)粒載體pTF243轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中，用添加0.01％氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶酶切分析基因片段，并測定TF基因的DNA序列，篩選確認陽性克隆，使用PT測定方法(檢測TF凝血活性)篩選得到高效表達的基因重組工程菌株。
實施例2rhTF243的發(fā)酵表達1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備組成LB培養(yǎng)基1000mL、葡萄糖50g、無機鹽溶液10mL、0.01％氨芐青霉素。其中無機鹽溶液由0.1％磷酸二氫鈉、0.5％磷酸氫二鉀、0.01％氯化鐵、0.03％硫酸鋅、0.01％氯化鈷、0.03％硫酸銅、0.5％硫酸銨和0.05％硫酸鎂組成。
將LB培養(yǎng)基、葡萄糖、無機鹽的混合溶液在121℃條件下滅菌20～30min后，加入氨芐青霉素制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
2、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)取2mL篩選得到的基因重組工程菌菌液加入到含有1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，放入30℃恒溫搖床內(nèi)，以200r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16h～20h，至測定600nm處的OD值在1.5～2.5之間。
3、高密度發(fā)酵培養(yǎng)在30L發(fā)酵罐中加入6L發(fā)酵培養(yǎng)液，加入搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液，開始高密度發(fā)酵培養(yǎng)，溫度35℃，攪拌速度400r/min，保持水溶性氧(dissolved oxygen)＞20％，用25％氨水維持pH值在6.0～7.5之間，發(fā)酵6h、8h時分別補加1L的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵18h，培養(yǎng)至測定600nm處的OD值10.0以上，得到發(fā)酵培養(yǎng)液。
測定表達rhTF243蛋白的活性為20s～30s(以凝血酶原時間計)。
4、rhTF243蛋白活性的測定方法取純化的rhTF243蛋白30μL(含量為30μg/ml)、30μL磷脂混合物(含量為1mg/mL)、240μLTBSA緩沖液，振蕩混勻，37℃水浴中保溫30min，得到脂化的rhTF243。取0.5mL脂化的rhTF243、0.5mL 0.1mol/L CaCl2、4mL TBSA混合，在37℃水浴中保溫10min，按照血凝儀使用說明進行凝血酶原時間的測定。
磷脂混合物由Sigma公司的PC(產(chǎn)品號為P6354)和PS(產(chǎn)品號為P7769)按7∶3組成。
實施例3rhTF243蛋白的純化1、制備TP單抗免疫親和層析柱稱取15mg純化的TF單抗、1g CNBr-活化的Sepharose基質(zhì)、100mL0.4mol/L NaHCO3偶聯(lián)緩沖液(pH8.3)、11.7克NaCl，在溫度25℃下混合裝柱，緩慢振蕩2h，排出液體；再用0.1mol/L Tris緩沖液(pH8.2)封閉2h，25℃靜置，排出液體；依次用pH3.0的0.1mol/L乙酸鈉溶液和pH8.3的0.1mol/LTris緩沖液洗滌，最后用5倍柱體積的PBS緩沖液4℃保存，制備成TP單抗免疫親和層析柱。
2、rhTF243蛋白的純化1)菌體破碎將得到的發(fā)酵菌體20g溶于2℃～8℃20mmol/L Tris-EDTA緩沖液100mL中，加1％Triton X-100，振蕩混勻，用高壓勻漿機以60Mpa～100Mpa的高壓進行細胞破碎，連續(xù)三次破碎后，在4℃～8℃條件下以20000g離心力離心30min，收集上清液，得到釋放rhTF243蛋白的破碎液。
2)Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)層析將破碎液與Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)等比例充分混合，靜置5min，過濾除去基質(zhì)，清液在4℃～8℃條件下以20000g離心力離心30min，收集上清液，得到粗提液。
3)TP單抗免疫親和柱層析將粗提液在4℃～8℃條件下加入TP單抗免疫親和層析柱，依次用5倍柱體積的pH8.0 TrisI-HCl緩沖液、pH6.0磷酸鈉緩沖液、pH4.0醋酸鈉緩沖液，以240mL/h流速洗滌親和層析柱，再用pH3.0的醋酸緩沖液洗脫rhTF243蛋白，收集洗脫液，用MILIPORE ULTRA-15型10KB超濾管離心濃縮，收集得到純化的rhTF243蛋白，-70℃保存。
用紫外分光光度計測定收集液的A280值，計算蛋白含量1.15mg/mL，體積為2.8mL，SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果見圖4。
實施例4制備凝血酶原時間測定試劑1、rhTF243蛋白的磷脂化稱取PC(產(chǎn)品號P6354，Sigma公司提供)28mg，PS(產(chǎn)品號P7769，Sigma公司提供)12mg，溶解于18.8mL含有100mmol/L CHAPS的Tris緩沖液(pH7.5，100mmol/L)中，37℃水浴保溫2h，加入純化的rhTF243蛋白1.2mL(含量為1.15mg/mL)，室溫靜置2h，得到rhTF243磷脂液。
2、配制PT測定試劑取rhTF243磷脂液20mL與1980mL緩沖液(100mmol/L HEPES pH7.0、10mmol/L CaCl2、1mg/mL BSA)混合，振蕩混勻，得到PT測定試劑。
3、試劑測定結(jié)果使用上述PT測定試劑，按照血凝儀使用說明，可以進行凝血酶原時間的測定。
1)室溫(20℃～25℃)放置的重組PT試劑正常人血漿凝血酶原時間測定結(jié)果

2)37℃放置的重組PT試劑正常人血漿凝血酶原時間測定結(jié)果

3)試劑的靈敏性與用兔腦組織因子制備的PT試劑進行比較，本發(fā)明制備的PT試劑具有明顯的高敏感性和穩(wěn)定性，與Recombiplastin(另一用人重組組織因子制備的PT試劑)產(chǎn)品擁有相同的敏感性和穩(wěn)定性。

敏感性的測定

*正常血漿是指德靈DADE Ci-Trol 1；80％、40％為正常血漿用生理鹽水稀釋樣**ratio指稀釋血漿和正常血漿的比值，比值越大，敏感性越高
權(quán)利要求
1.一種人重組組織因子，含有天然人組織因子跨膜部分和膜外部分的243個氨基酸殘基，為缺失胞內(nèi)區(qū)的截斷型人重組組織因子recombinant humantissue factor，簡稱rhTF243，具有天然人組織因子的全部凝血活性。
2.權(quán)利要求1所述人重組組織因子的構(gòu)建表達方法，其特征是從人胎盤組織中獲取總RNA，設(shè)計PCR引物，通過RT-PCR方法得到目的基因片段；將收集的TF基因片段與phoA質(zhì)粒重組，構(gòu)建TF表達質(zhì)粒載體pTF243，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中，篩選得到基因重組工程菌株，接入發(fā)酵培養(yǎng)基直接發(fā)酵表達，得到含rhTF243蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)菌液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2％～5％的葡萄糖、1％～5％無機鹽溶液和0.01％～0.05％氨芐青霉素后組成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達方法，其特征是所述的無機鹽溶液由0.1％～0.5％磷酸二氫鈉、0.5％～1.0％磷酸氫二鉀、0.01％～0.05％氯化鐵、0.01％～0.03％硫酸鋅、0.01％～0.03％氯化鈷、0.01％～0.03％硫酸銅、0.5％～1.0％硫酸銨和0.05％～0.10％硫酸鎂組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達方法，其特征是rhTF243在大腸桿菌中的表達是由發(fā)酵培養(yǎng)液中的無機磷濃度控制的，隨著大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液中的無機磷逐漸消耗，當無機磷濃度低于0.1mmol/L時，rhTF243蛋白被誘導表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)在溫度30℃～37℃和pH6.0～7.5條件下進行，并保持水溶性氧＞20％。
7.權(quán)利要求1所述人重組組織因子的純化方法，其特征是用高壓勻漿機破碎發(fā)酵培養(yǎng)菌液釋放rhTF243蛋白，先用Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)進行離子交換層析，再通過TF單抗免疫親和層析柱，收集得到純化的rhTF243蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人重組組織因子的純化方法，其特征是依次用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液和pH 4.0的醋酸鈉緩沖液洗滌吸附在TF單抗免疫親和層析柱上的rhTF243蛋白，然后用pH 3.0的醋酸緩沖液洗脫rhTF243蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人重組組織因子的純化方法，其特征是所述的TF單抗免疫親和層析柱是由TF單克隆抗體與CNBr-actvated Sepharose FastFlow偶聯(lián)后制備得到。
10.權(quán)利要求1所述的人重組組織因子在制備凝血酶原時間測定試劑盒上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人重組組織因子的構(gòu)建、表達和純化方法及應(yīng)用。從人胎盤中獲取得到的TF基因片段與phoA質(zhì)粒重組，構(gòu)建質(zhì)粒載體pTF
文檔編號C07K14/43GK1687125SQ20051001241
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日
發(fā)明者焦進安, 趙邑, 郝建平, 李晉川, 謝紅, 趙峰梅 申請人:太原博奧特生物技術(shù)有限公司