一種重組人表皮生長因子原液生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組人表皮生長因子原液生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長因子（hEGF)是人體重要的多肽，它具有多種生物學(xué)功能，例如可與表皮 細(xì)胞上特異的受體結(jié)合，將信息傳遞入細(xì)胞，改變細(xì)胞內(nèi)的酸堿度和游離鈣度，從而促進糖 酵解和蛋白質(zhì)合成以及增加某些專一性基因轉(zhuǎn)錄，促進DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。表皮生長因 子是由Cohen等人在上世紀(jì)60年代從小鼠頌下腺發(fā)現(xiàn)的一種生長調(diào)節(jié)蛋白，由53個氨基 酸組成，研究證實它具有廣泛的刺激細(xì)胞增殖的作用。1975年，Starkey、Cohen等人從人 尿中提取了人表皮生長因子（humanEpidermalGrowthFactor，hEGF)，與鼠表皮生長因子 具有高度一致的結(jié)構(gòu)，并具有一致的生物學(xué)活性。表皮生長因子廣泛存在于人體各種組織 中，可刺激多種細(xì)胞增殖，主要是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，這是通過結(jié)合細(xì)胞膜上的表 皮生長因子受體（EGFR)而起作用的。EGF通過與細(xì)胞受體的膜外部分結(jié)合，激活其酪氨酸 激酶活性，誘導(dǎo)蛋白磷酸化，啟動DNA合成，激活RNA、蛋白質(zhì)合成，促進細(xì)胞增生、移行。因 此，hEGF可促進表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和器官組織上皮細(xì)胞生長；可促進新生胎兒齒、骨與各 器官的生長；可促進肝細(xì)胞再生；可促進胃腸道黏膜細(xì)胞生長和保護胃腸道黏膜受損。
[0003] 表皮生長因子廣泛存在于人體內(nèi)各種組織，含量極微，對于維持人體各種組織器 官（如角結(jié)膜、皮膚、各種黏膜、腺體等）的正常生理功能具有重要作用。隨著年齡的增長， 體內(nèi)表皮生長因子水平逐漸下降，表現(xiàn)為相關(guān)組織器官的衰老和退化，特別是上皮組織的 衰老，因此，及時向人體補充表皮生長因子，可維護人體正常功能并延緩衰老，這是表皮生 長因子在美容保健行業(yè)的應(yīng)用基礎(chǔ)。另外，在肌體受損等的情況下，內(nèi)源性表皮生長因子不 能滿足組織修復(fù)的大量需要，及時向受損部位補充表皮生長因子，可促進受損肌體組織的 修復(fù)，在臨床上應(yīng)用非常廣泛，如用于創(chuàng)傷、炎癥、手術(shù)、化學(xué)燒傷及干眼癥等各種原因引起 的角膜上皮缺損修復(fù)，燒傷、創(chuàng)傷、外科手術(shù)、炎癥、潰瘍等各種皮膚和黏膜缺損的修復(fù)。
[0004] 重組人表皮生長因子（rhEGF)是通過基因工程技術(shù)將大腸桿菌或酵母分泌表達(dá) 而來的，其制品純度可達(dá)98%。重組人表皮生長因子屬于分子量超過500道的大分子多肽 類藥物。目前，對表皮生長因子和重組表皮生長因子已有研究，例如中國專利97115284. 5， 公開了表皮生長因子工程菌及使用該菌制備表皮生長因子的方法，研究人員通過表皮生長 因子可以得到重組人表皮生長因子（或者稱為重組人表皮生長因子原液）?？萍荚诓粩噙M 步，對于表皮生長因子和重組表皮生長因子的研究也在不斷的進行當(dāng)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種重組人表皮生長因子原液生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：
[0006] 1)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：由以下重量比例成分制成：
[0007]
[0008] 所述微量金屬離子為三氯化鐵、氯化鈣、鉬酸鈉、氯化鋅、硫酸銅、硼酸、硫酸鋁中 的一種；
[0009] 用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為5. 5-6. 5 ;
[0010] 所述促進劑采用以下方法制備：
[0011] ①原料處理：將穿心蓮和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎；
[0012] ②蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破壓力3. 0-3. 5Mpa， 保壓時間維持在150-200s;
[0013] ③蒸餾處理：將步驟②得到的物料放入蒸餾器，在蒸餾器底部，加熱燃燒或通入蒸 汽，當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸餾器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離 器，收集精油；
[0014] ④高剪切均質(zhì)機處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機處理，線速度 30-40m/s，時間3-5min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到；
[0015] 2)發(fā)酵、表達(dá)：應(yīng)用2L搖瓶及20L原位滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)遺傳工程菌株，以10%培 養(yǎng)基接種后，添加誘導(dǎo)劑，30°C培養(yǎng)，控制pH7. 0,氧飽和度10-50%，攪拌150-170rpm，罐壓 0. 01378-0. 03445MPa，流加甘油至每L濕菌達(dá)100-300g后流加甲醇保持其濃度為1 %以進 行EGF的誘導(dǎo)表達(dá)；
[0016] 3)分離：表達(dá)結(jié)束，離心分離，收集上清既得重組克隆菌株離心液；
[0017] 4)純化：將步驟3)得到的重組克隆菌株離心液，加入硫酸銨使?jié)舛瘸?. 5M，上樣 于用5倍柱體積量的20mM磷酸緩沖液pH7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡過的疏水柱，以20mM磷 酸緩沖液PH7. 0, 0. 5M硫酸胺將進樣峰洗至基線，以20mM磷酸緩沖液洗脫出EGF峰，該樣品 峰以20mMTris-HClρΗ7· 6緩沖液稀釋 10倍后上樣于Q-sepharoseHighPerformance柱， 以A液（20mMTris-HClρΗ7·6)至B液（20mMTris-HClpH7.6,0.5MNaCl)梯度洗脫方法收 集EGF峰，最后用分子篩Superdex30柱純化重組hEGF蛋白，純度可達(dá)98 %以上。
[0018] 進一步優(yōu)選的，步驟1)所述培養(yǎng)基的準(zhǔn)備按照以下步驟：
[0019] 培養(yǎng)基由以下重量比例成分制成：
[0020]
[0021] 所述微量金屬離子為三氯化鐵、氯化鈣、鉬酸鈉、氯化鋅、硫酸銅、硼酸、硫酸鋁中 的一種；
[0022] 用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為6. 0 ;
[0023] 所述促進劑采用以下方法制備：
[0024] ①原料處理：將穿心蓮和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎；
[0025] ②蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破壓力3. 0-3. 5Mpa， 保壓時間維持在150-200s;
[0026] ③蒸餾處理：將步驟②得到的物料放入蒸餾器，在蒸餾器底部，加熱燃燒或通入蒸 汽，當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸餾器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離 器，收集精油；
[0027] ④高剪切均質(zhì)機處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機處理，線速度 30-40m/s，時間3-5min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到。
[0028] 本發(fā)明所述用水符合制藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
[0029] 本發(fā)明所述穿心蓮和金銀花的使用量，優(yōu)選粉碎后的體積相當(dāng)于蒸汽爆破罐體積 的 1/4-1/3〇
[0030] 本發(fā)明所述用水符合制藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，所述遺傳工程菌株參照現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選遺傳 工程菌株GS115-3EGF。
[0031] 步驟2)所述誘導(dǎo)劑為甲醇，用量1. 2-1. 8% (w/w)。
[0032] 步驟4)所述疏水柱優(yōu)選Phenyl sepharose 6Fast Flow (high sub)柱。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0034] 1、本發(fā)明使用的植物原料成分經(jīng)過了蒸汽爆破、蒸餾、高剪切均質(zhì)機處理，得到納 米乳狀的植物油性成分，和培養(yǎng)基中其他配方的相容性好。
[0035] 2、現(xiàn)有技術(shù)中常用的工程菌的誘導(dǎo)方式有溫控或者是化學(xué)物質(zhì)，比如甲醇、IPTG 等等。本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中添加植物原料成分作為促進劑，和現(xiàn)有技術(shù)相比，表達(dá)產(chǎn)量會 提尚 31_42%。
【具體實施方式】
[0036] 下面以實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0037] 實施例1 :
[0038] 一種重組人表皮生長因子原液生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：
[0039] 1)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：由以下重量比例成分制成：
[0040]
[0041] 所述微量金屬離子為三氯化鐵；
[0042] 用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH為5. 5 ;
[0043] 所述促進劑采用以下方法制備：
[0044] ①原料處理：將穿心蓮和金銀花按照等重混合、洗凈、干制、粉碎；
[0045] ②蒸汽爆破處理：將步驟①得到的物料放入蒸汽爆破罐，體積相當(dāng)于蒸汽爆破罐 體積的1/3,爆破壓力3.OMpa，保壓時間維持在200s;
[0046] ③蒸餾處理：將步驟②得到的物料放入蒸餾器，在蒸餾器底部，加熱燃燒或通入蒸 汽，當(dāng)炙熱的蒸氣充滿在蒸餾器里，水蒸氣通過冷凝管，被引入冷凝器內(nèi)，再通過油水分離 器，收集精油；
[0047] ④高剪切均質(zhì)機處理：將步驟③得到的精油通過高剪切均質(zhì)機處理，線速度30m/ s，時間3min，制成納米乳，并用微孔濾膜過濾除菌得到；
[0048] 2)發(fā)酵、表達(dá)：應(yīng)用2L搖瓶及20L原位滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)遺傳工程菌株，以10%培 養(yǎng)基接種后，添加誘導(dǎo)劑1. 2 %，30°C培養(yǎng)，控制pH7. 0,氧飽和度50 %，攪拌150rpm，罐壓 0. 01378MPa，流加甘油至每L濕菌達(dá)100g后流加甲醇保持其濃度為1%以進行EGF的誘導(dǎo) 表達(dá)；
[0049] 3)分離：表達(dá)結(jié)束，離心分離，既得重組克隆菌株離心液；
[0050] 4)純化：將步驟3)得到的重組克隆菌株離心液，加入硫酸銨使?jié)舛瘸?. 5M，上樣 于用5倍柱體積量的20mM磷酸緩沖液pH7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡過的疏水柱（Phenyl sepharose6FastFlow(highsub)柱），以 20mM磷酸緩沖液ρΗ7· 0, 0· 5M硫酸胺將進樣峰 洗至基線，以20mM磷酸緩沖液洗脫出EGF峰，該樣品峰以20mMTris-HClρΗ7. 6緩沖液稀 釋 10 倍后上樣于Q-sepharoseHighPerformance柱，以Α液（20mMTris-HClρΗ7·6)至 Β液（20mMTris-HClpH7. 6,0. 5MNaCl)梯度洗脫方法收集EG